蛋白自组装铁基纳米粒及其制备方法与抗肿瘤药物递送系统中的应用与流程

本发明涉及抗癌药物递送体系技术领域，具体而言涉及一种蛋白自组装铁基纳米粒及其制备方法与抗肿瘤药物递送系统中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤的发生、发展导致了肿瘤病灶呈现特殊的肿瘤微环境(tme)，这类特殊的微环境为癌细胞的生长、侵袭和转移提供了适宜的条件，但同时为肿瘤的高效选择性及特异性治疗提供了可能。基于此，作为一种新型的肿瘤治疗策略，化学动力学疗法(cdt)通过芬顿(fenton)反应或类芬顿反应诱导肿瘤细胞凋亡从而引起了广泛的关注。其中铁基纳米粒，尤其是含fe²⁺的纳米制剂已被证实可作为高效的芬顿反应催化剂，产生高细胞毒性的羟基自由基，从而杀伤肿瘤细胞[1]。与传统疗法相比，化学动力学疗法通过利用催化剂与内源性过氧化氢(h2o2)的相互作用产生的羟基自由基杀伤细胞，可避免对正常细胞和组织的损伤。然而，肿瘤自身的内源性h2o2并不足以实现满意的化学动力学疗效。因此，发展具备提高肿瘤内h2o2水平的化学动力学试剂，从而实现cdt对肿瘤的高效催化芬顿反应是非常必要的。

即使在有氧条件下，肿瘤细胞也更倾向于使用将葡萄糖代谢为乳酸的糖酵解作用取代正常细胞的氧化磷酸化作用(warburg效应)。基于葡萄糖在促进肿瘤细胞生长与转移中的关键作用，癌症饥饿疗法即通过葡萄糖氧化酶(gox)介导的葡萄糖代谢将葡萄糖转化为h2o2和葡萄糖酸，从而饿死肿瘤。而h2o2的产生、积累和酸性环境的生成有利于加速芬顿反应的发生，从而产生高毒性的·oh，进一步提高cdt的效率。

利用近红外(nir)光照射肿瘤内积聚的光吸收剂作为外源性热源的光热治疗(ptt)因其非侵袭性以及其良好的可控性、易操作性而在肿瘤治疗中受到广泛关注，包括铁基材料等的无机纳米材料早期已成为应用于光热治疗的主要材料。研究表明，gox的酶活性在43～60℃范围内随温度升高而增强，利用光热试剂的光热转化能力，可以光控gox的催化效率[2]。并且，光热治疗过程中血流加速，肿瘤组织缺氧得到缓解，从而可克服缺氧对gox催化的抑制作用，进而提高饥饿治疗效率。

目前，为了高效激活化学动力学疗法，促进其肿瘤治疗效果，需要将单一治疗模式转换为协同治疗模式。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种蛋白自组装铁基纳米及其制备方法与抗肿瘤药物递送系统中的应用，利用生物矿化法制备蛋白自组装铁基纳米粒，通过gox介导的饥饿治疗饿死肿瘤细胞，原位提高内源性h2o2水平，从而加速铁基材料催化的芬顿反应高效进行；并利用铁基纳米粒的光热转化能力提高gox催化效率，协同促进肿瘤的治疗效果。

为实现上述目的，本发明提出一种蛋白自组装铁基纳米粒的制备方法，所述蛋白自组装铁基纳米粒由葡萄糖氧化酶与铁基材料通过静电吸附作用结合，再通过溶剂交换法载入紫杉醇而成，其具体制备过程包括：

(1)将葡萄糖氧化酶、氯化亚铁、硫化钠分别溶于水中，配制得到葡萄糖氧化酶溶液、氯化亚铁溶液和硫化钠溶液；

(2)将氢氧化钠溶于水中，配制得到0.1m的氢氧化钠溶液；

(3)取100～150μl氯化亚铁溶液缓慢滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，磁力搅拌2～5min；

(4)将氢氧化钠溶液滴加到步骤(3)所得溶液中，调节溶液ph为8～9；

(5)取100～150μl硫化钠溶液立即加入到步骤(4)所得溶液中，避光磁力搅拌1～2h，得到的fes-gox纳米粒，再用超滤离心管以3000～5000r/min进行离心处理，然后使用pbs洗涤三次去除杂质，得到超微fes-gox纳米粒(fg)溶液；

(6)将紫杉醇溶于乙醇溶液中，配制得到紫杉醇溶液；

(7)取50～100μl紫杉醇溶液逐滴加入到超微fes-gox纳米粒(fg)溶液，避光磁力搅拌1～2h，然后再置于透析袋中透析24～48h，即得到蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx。

进一步地，所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶溶液浓度为15-20mg/ml，氯化亚铁溶液浓度为30-40mg/ml，硫化钠溶液浓度为5-7mg/ml。

进一步地，所述步骤(5)中，磁力搅拌的温度为室温，搅拌速度为800～1000r/min。

进一步地，所述步骤(7)中，紫杉醇溶液与超微fes-gox纳米粒溶液的体积比为1:40。

进一步地，所述步骤(7)中，紫杉醇溶液浓度为15-20mg/ml。

进一步地，所述步骤(7)中，磁力搅拌温度为室温，搅拌速度为600～800r/min。

进一步地，所述fes-gox纳米粒的平均粒径为160-180nm,超微fes-gox纳米粒的平均粒径为12-30nm。

进一步地，所述fes-gox纳米粒平均zeta电位为﹣10至﹣12mv,超微fes-gox纳米粒的平均zeta电位为﹣12至﹣14mv。

根据本发明的第二方面还提出一种根据前述蛋白自组装铁基纳米粒的制备方法制备得到的蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx。

根据本发明的第三方面还提出一种蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx在抗肿瘤药物递送系统中的应用

与现有技术相比，本发明的显著的有益效果在于：

(1)本发明利用葡萄糖氧化酶介导的催化反应，消耗肿瘤部位葡萄糖，提高原位h2o2水平，从而实现化学动力学-饥饿疗法联合治疗，为提高化学动力学试剂肿瘤治疗效率提供思路；

(2)fes铁基材料可作为一种光热治疗剂用于肿瘤治疗，利用其良好的光热转换效率及光稳定性提高葡萄糖氧化酶的催化效率，增效肿瘤治疗效果；

(3)本发明通过蛋白自组装方法制备抗肿瘤纳米粒，制备方法简单，易于操作，可实现药物与酶的高效负载。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

图1是实施例1制备的fes-gox@ptx的粒径表征图。

图2(a)-2(b)是实施例1制备的fes-gox@ptx在不同浓度下的下降曲线图和h2o2含量变化图，其中图2(a)是ph下降曲线图，图2(b)是h2o2含量变化图。

图3是实施例1制备的fes-gox@ptx的羟基自由基的测定结果图。

图4是fes-gox@ptx各处理组及对照组在不同浓度下对4t1细胞毒性比较图。

图5是fes-gox@ptx各处理组及对照组生理盐水经尾静脉注射入乳腺癌荷瘤鼠后的治疗情况。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。

在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。

结合本发明公开的实施例的目的在于提供一种蛋白自组装铁基纳米粒及其制备方法与抗肿瘤药物递送系统中的应用，利用生物矿化法制备蛋白自组装铁基纳米粒，通过gox介导的饥饿治疗饿死肿瘤细胞，原位提高内源性h2o2水平，从而加速铁基材料催化的芬顿反应高效进行；并利用铁基纳米粒的光热转化能力提高gox催化效率，协同促进肿瘤的治疗效果。

作为可选的实施例的蛋白自组装铁基纳米粒，蛋白自组装铁基纳米粒由葡萄糖氧化酶与铁基材料通过静电吸附作用结合，再通过溶剂交换法载入紫杉醇而成。利用葡萄糖氧化酶介导的催化反应，消耗肿瘤部位葡萄糖，提高原位h2o2水平，从而实现化学动力学-饥饿疗法联合治疗，同时利用铁基材料光热转换及光稳定性提高葡萄糖氧化酶的催化效率，增效肿瘤治疗效果。

作为可选的示例的制备过程包括：

(1)将葡萄糖氧化酶、氯化亚铁、硫化钠分别溶于水中，配制得到葡萄糖氧化酶溶液、氯化亚铁溶液和硫化钠溶液；

(2)将氢氧化钠溶于水中，配制得到0.1m的氢氧化钠溶液；

(3)取100～150μl氯化亚铁溶液缓慢滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，磁力搅拌2～5min；

(4)将氢氧化钠溶液滴加到步骤(3)所得溶液中，调节溶液ph为8～9；

(5)取100～150μl硫化钠溶液立即加入到步骤(4)所得溶液中，避光磁力搅拌1～2h，得到的fes-gox纳米粒，再用超滤离心管以3000～5000r/min进行离心处理，然后使用pbs洗涤三次去除杂质，得到超微fes-gox纳米粒(fg)溶液；

(6)将紫杉醇溶于乙醇溶液中，配制得到紫杉醇溶液；

(7)取50～100μl紫杉醇溶液逐滴加入到超微fes-gox纳米粒(fg)溶液，避光磁力搅拌1～2h，然后再置于透析袋中透析24～48h，即得到蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx。

进一步地，步骤(1)中，葡萄糖氧化酶溶液浓度为15-20mg/ml，氯化亚铁溶液浓度为30-40mg/ml，硫化钠溶液浓度为5-7mg/ml。

进一步地，步骤(5)中，磁力搅拌的温度为室温，搅拌速度为800～1000r/min。

进一步地，步骤(7)中，紫杉醇溶液与超微fes-gox纳米粒溶液的体积比为1:40。

进一步地，步骤(7)中，紫杉醇溶液浓度为15-20mg/ml。

进一步地，步骤(7)中，磁力搅拌温度为室温，搅拌速度为600～800r/min。

进一步地，fes-gox纳米粒的平均粒径为160-180nm,超微fes-gox纳米粒的平均粒径为12-30nm。

进一步地，fes-gox纳米粒平均zeta电位为﹣10至﹣12mv,超微fes-gox纳米粒的平均zeta电位为﹣12至﹣14mv。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。下述实施列中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

(1)将20mg葡萄糖氧化酶溶于2ml水中，配制得到浓度为20mg/ml葡萄糖氧化酶溶液；将62.5mg氯化亚铁(四水合物)溶于2ml水中，配制成氯化亚铁(31.25mg/ml)溶液；将12.5mg硫化钠溶于2ml水中，配置成(12.5mg/ml)硫化钠溶液，备用。

(2)将氢氧化钠溶于水中，配制得到0.1m的氢氧化钠溶液，将所得溶液置于细口瓶密封保存，备用。

(3)取100μl氯化亚铁溶液缓慢滴加到步骤(1)中葡萄糖氧化酶溶液中，磁力搅拌3min。

(4)将步骤(2)中氢氧化钠溶液滴加到步骤(3)所得溶液中，调节溶液ph为8.2。

(5)取100μl硫化钠溶液立即加入到步骤(4)所得溶液中，避光磁力搅拌2h，将得到的fes-gox纳米粒用超滤离心管4000r/min离心20min并用pbs洗涤三次去除杂质，得到超微fes-gox纳米粒，备用。

(6)将4.0mg紫杉醇溶于200μl乙醇溶液中，配制得到紫杉醇溶液(20mg/ml)，备用。

(7)取50μl步骤(6)中紫杉醇溶液逐滴加入到fg纳米粒中，避光磁力搅拌1h，将所得纳米粒溶液置于透析袋中透析24h，即可得到蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx。

将fg纳米粒和蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx分别用去离子水配置成浓度为300μg/ml的溶液，然后在37℃下测其粒径大小。其粒径结果图如图1所示，fg纳米粒的粒径为12±5nm；蛋白自组装铁基纳米粒fes-gox@ptx的粒径为160±8nm，证明制得的纳米粒粒径比较均一。

实施例2

按照实施例1中的方法制备fes-gox@ptx纳米粒，调整其浓度为2、20、50、100μg/ml(gox浓度)，加入2mg/ml的葡萄糖(glu)(总体系为3ml)。测定反应液的ph值随时间变化的曲线。结果如图2(a)所示，与葡萄糖对照组溶液相比，加入复合纳米粒溶液的处理组在90min内ph值呈现显著下降趋势，从7.2降至4.0，证明载入复合纳米粒中的葡萄糖氧化酶具有高效的催化活力，在葡萄糖参与反应的条件下生成葡萄糖酸，从而使ph值降低。

按照实施例1中的方法制备fes-gox@ptx纳米粒，对各组进行不同处理：①2μg/mlfes-gox@ptx+glu；②20μg/mlfes-gox@ptx+glu；③2μg/mlgox+glu；④2μg/mlfes-gox@ptx。

加入过氧化氢检测试剂后孵育15min，利用荧光酶标仪检测(λex＝540/λem＝590nm)处荧光强度。

根据标准曲线计算过氧化氢含量，并绘制过氧化氢含量随时间变化曲线。结果如图2(b)所示，加入葡萄糖15min后，①②组h2o2含量逐渐下降，证明由葡萄糖氧化酶催化产生的h2o2诱导铁原位启动芬顿反应，从而导致h2o2含量呈现先上升后下降的趋势。

实施例3

按照实施例1中的方法制备fes-gox@ptx纳米粒，取3ml的pbs缓冲溶液(ph＝7.4)，先加入10μg/ml的亚甲基蓝(mb)，再加入300μg/ml(gox浓度)的fes-gox@ptx纳米粒溶液，最后加入10mg/ml的葡萄糖。置于42℃水浴锅中，分别于0、1、3、5、10、20、30min取出反应液对500～800nm波段进行紫外扫描。

结果如图3所示，fes-gox@ptx纳米粒溶液与葡萄糖混合后，混合物溶液的在617nm处的吸光度值随时间不断下降，溶液中的亚甲基蓝颜色也逐渐褪去，表明fes-gox@ptx在加入葡萄糖以及加热条件下高效进行催化反应及芬顿反应，产生大量羟基自由基，从而将亚甲基蓝氧化为无色。

实施例4

(1)采用cck-8法，选择对数生长期的4t1鼠乳腺癌细胞，调整细胞数为8000个/ml接种于96孔培养板，细胞贴壁生长24h，培养基为含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素的rpmi1640培养基。

(2)弃去培养基，加药，依次为空白组、空白加光照组、fes-hsa@ptx组、fes-hsa@ptx加光照组、fes-gox@ptx组、fes-gox@ptx加光照组，在以上几组的基础上调节葡萄糖氧化酶的浓度分别为15μg/ml和30μg/ml，对应铁的浓度为100μg/ml和200μg/ml。

(3)加过药的细胞在37℃，5％co2的环境中孵育4h,用pbs洗三遍，加入无血清rpmi1640培养基；加光照组用1.6w的nir近红外激光灯照射3min后，放入细胞培养箱孵育2h。

(4)每孔加入10μlcck-8试剂和100μl无血清rpmi1640培养基，在细胞培养箱中孵育2h，最后用酶标仪测定450nm处的吸光度。

(5)计算肿瘤生长抑制率(％)＝(1-实验组od值/对照组od值)×100％。

(6)结果如图4所示，fes-hsa@ptx组对细胞有一定的毒性，但fes-gox@ptx组其抗肿瘤效应明显增加，且随着葡萄糖浓度的增加，抗肿瘤效应更强。不仅如此，通过加光照和不加光照组的情况对比，结果表明fes-gox@ptx组在加光照的条件下可极大的发挥抗肿瘤效应，说明光热促进了光动力疗法与饥饿治疗的协同效应，对癌细胞具有更好的抑制作用。

实施例5

(1)取4～6周龄的balb/c雌鼠，构建小鼠皮下肿瘤模型，待肿瘤大小为60～100mm³时，随机将小鼠分为6组，每组5～7只：

①生理盐水组；②生理盐水+nir组；③fes-hsa@ptx组(对应hsa浓度为300μg/ml,对应fe浓度为500μg/ml)；④fes-hsa@ptx+nir组；⑤fes-gox@ptx组(对应gox浓度为300μg/ml,对应fe浓度为500μg/ml)；⑥fes-gox@ptx+nir组。

(2)分别尾静脉注射对应药物到小鼠体内，24h后，用808nm激光照射②④⑥组的小鼠肿瘤部位3min。

(3)在接下来的14天内，每隔两天称量小鼠体重并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的大小。并根据下式计算肿瘤体积：

v(体积)＝w(宽度)²×l(长度)/2。

结果如图5所示，⑤治疗组小鼠肿瘤的生长明显被抑制，⑥治疗组的治疗效果更为显著，饲养后期肿瘤结痂直至完全治愈；②组对照组在激光治疗过程中肿瘤前期稍被抑制，后期明显复发。由此证明本发明的蛋白自组装铁基纳米粒通过光动力疗法和饥饿治疗达到改良的治疗效果，辅助光热疗法使其具有更高效的肿瘤治疗能力。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。