miR-302b-3p在作为口腔鳞状细胞癌抗肿瘤标志物中的用途

mir-302b-3p在作为口腔鳞状细胞癌抗肿瘤标志物中的用途
技术领域
1.本发明属于肿瘤诊断和治疗领域。


背景技术：

2.口腔鳞状细胞癌(oscc)，简称口腔鳞癌，约占口腔颌面部恶性上皮源性肿瘤的90％，其对头颈及颌面局部美观及功能的破坏性极大，具有较高的转移率和较差的预后。oscc细胞具有较高的侵袭迁移能力，易在疾病的早期阶段侵犯周围组织并转移至局部淋巴结，此后可通过淋巴管、血管等转移至远隔器官，发生转移性肿瘤。基于上述特点，oscc患者的治疗常不及时，现有治疗方式的远期效果仍不理想，死亡率较高，五年生存率只有50％左右。因此，寻找阻遏口腔黏膜癌变并抑制oscc转移的关键分子迫在眉睫。在临床中尽早关注这些警示因子，对于随时监测疾病进展及防治口腔黏膜癌变，具有重要意义。
3.mirna是长度约为20个核苷酸序列的单链小rna，是非编码rna的一种，在调控基因表达方面具有较高的效能，在组织发育和各种疾病中有各自协调有序的表达模式，参与细胞生物学行为的方方面面，亦参与了多种肿瘤性疾病的发生与发展。它可通过控制细胞周期在基因水平上直接调控细胞功能；也可通过抑制靶基因的翻译或清除靶基因转录体等途径，在转录后水平对基因表达进行调控。mirna通常是通过rna诱导沉默复合体(rnainduced silencing complex，risc)发挥作用的。目前已有学者研究了差异表达的mirna在多种肿瘤性疾病中的作用及机制，其调控的肿瘤细胞生物学行为包括细胞干性、增殖、凋亡、血管形成、侵袭与迁移、肿瘤免疫等。
4.has-mir-302b-3p(人mir-302b-3p，简称“mir-302b-3p”)是mirnas家族中的重要组成部分，根据mirna领域权威数据库mirbase(http://www.mirbase.org/)，其曾用名为hsa-mir-302b(简称“mir-302b”)。研究发现，在oscc肿瘤处分离得到的hsc-3细胞内抑制mir-302a或mir-302b表达，可导致cd44v3和aldh1同时高表达的细胞(cd44是肿瘤干细胞标志物，aldh1是头颈鳞状细胞癌肿瘤干细胞标志物)受到功能性抑制，包括自我更新、肿瘤生长受到抑制(hyaluronan-cd44v3interaction with oct4-sox2-nanog promotes mir-302expression leading to self-renewal,clonal formation,and cisplatin resistance in cancer stem cells from head and neck squamous cell carcinoma.journal of biological chemistry,2012,287(39):32800-32824)，表明mir-302b有可能促进oscc细胞增殖。另有研究表明，oscc患者唾液外泌体中含有mir-302b-3p，但是健康人唾液外泌体中不含mir-302b-3p(salivary extracellular vesicle-associated mirnas as potential biomarkers in oral squamous cell carcinoma.bmc cancer.2018apr18；18(1):439.)，由此可以推论：mir-302b-3p有可能是oscc促癌因子，口腔细胞mir-302b-3p的表达量越高，患有oscc的可能性越高，但这一观点尚未被完全证实。
5.另外，目前尚未见mir-302b-3p与oscc侵袭性或迁移性的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于：提供mir-302b-3p在作为口腔鳞状细胞癌抗肿瘤标志物中的用途，具体的，分为两个方面：第一个方面是将mir-302b-3p检测试剂用于制备口腔鳞状细胞癌侵袭性和/或迁移性的诊断试剂盒，第二个方面是将mir-302b-3p或mir-302b-3p前体作为活性成分用于制备延缓口腔鳞状细胞癌侵袭和/或迁移的药物。
7.术语“前体”指：携带mirna的核苷酸序列，并能在细胞内产生mirna的物质。优选的，前体为mirna mimics或mirna agomir。所述mirnamimics是针对mirna的成熟体设计并合成的小片段双链mirna；所述mirna agomir指在mirna mimics的基础上进行化学修饰，经过特殊的化学修饰升级的产品，表达更稳定，表达时间更长，可以实现细胞实验，不需要转染试剂，另外，可以直接溶解后用于动物实验。
8.本发明的技术方案如下：
9.本发明首先提供了人类mir-302b-3p或其前体在制备延缓口腔鳞状细胞癌侵袭和/或迁移的药物中的用途。
10.进一步的，所述前体是人类mir-302b-3p的mirna mimics或人类mir-302b-3p的mirna agomir。
11.进一步的，所述药物还包括mir-302b-3p或其前体的载体；优选的，所述载体为慢病毒或脂质体。
12.本发明还提供了一种延缓口腔鳞状细胞癌侵袭和/或迁移的口腔鳞状细胞癌的药物，该药物的活性成分是人类mir-302b-3p或其前体。
13.如前述的药物，所述前体是人类mir-302b-3p的mirna mimics或人类mir-302b-3p的mirna agomir。
14.如前述的药物，所述药物还包括mir-302b-3p或其前体的载体；优选的，所述载体为慢病毒或脂质体。
15.本发明还提供了检测人类mir-302b-3p的试剂在制备口腔鳞状细胞癌侵袭性和/或迁移性的诊断试剂盒中的用途。
16.如前述的用途，所述检测人类mir-302b-3p的试剂是qrt-pcr试剂。
17.本发明还提供了一种口腔鳞状细胞癌侵袭性和/或迁移性的诊断试剂盒。
18.如前述的试剂盒，所述检测人类mir-302b-3p的试剂是qrt-pcr试剂。
19.本发明用直接证据证明，mir-302b-3p可抑制oscc的侵袭和/或迁移，口腔细胞内mir-302b-3p水平越高，oscc侵袭和迁移的可能性越低。而mir-302b-3p与oscc的侵袭和/或迁移性的关系未被现有技术报道。本发明的药物可以通过提高mir-302b-3p的水平，延缓oscc的侵袭和/或迁移，是一种构思与现有oscc药物不同的新药物，丰富了治疗oscc的药物选择。
20.本发明的试剂盒可以通过检测mir-302b-3p水平高低，评估oscc患者出现肿瘤细胞侵袭或迁移的风险，为oscc治疗决策提供有价值的参考信息。
21.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容
所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
23.图1：oscc细胞系的侵袭迁移能力与mir-302b-3p表达相关性。
24.图2：oscc淋巴转移率与mir-302b-3p的相关性。
25.图3：mir-302b-3p与fzd6基因之间的靶向关系。
26.图4：mir-302b-3p的靶基因fzd6表达与oscc预后的关系。
27.图5：过表达fzd6对oscc细胞的侵袭与迁移能力的增强作用，以及mir-302b-3p对该增强作用的逆转作用。
具体实施方式
28.实施例1oscc细胞系的侵袭迁移能力与mir-302b-3p表达水平的关系
29.使用真核细胞转染技术，将mir-302b-3p-mimic【正义链:uaagugcuuccauguuuuaguag(seq id no.1)；反义链cuacuaaaacauggaagcacuua(seq id no.2)】、mir-302b-3p-off【cuacuaaaacauggaagcacuua(seq id no.3)】或随机mirna mimic【即nc-mimic；micron mimic nc序列正义链:uuuguacuacacaaaaguacug(seq id no.4)，反义链：caguacuuuuguguaguacaaa(seq id no.5)；microff inhibitor nc序列：caguacuuuuguguaguacaa(seq id no.6)】分别转染oscc细胞系hsc-3、hsc-4、um1、um2。使用transwell侵袭实验与迁移实验，检测转染前、后的的迁移和侵袭情况。另外抽提细胞rna，使用qrt-pcr检测mir-302b-3p的表达。
30.具体操作方法如下：
31.1.细胞rna抽提和qrt-pcr。oscc细胞系hsc-3、hsc-4、um1、um2培养至对数生长期，每5～10
×
106个细胞加入1ml trizol，用一次性或已消毒的细胞刮刮下，转入新的洁净ep管中，用注射器反复抽吸5～6次，或反复用移液枪捶打或剧烈震荡，以充分裂解细胞。室温下静置5min(除离心外，所有操作尽量在通风橱内进行)。ep管中按照每1ml trizol加入0.2ml氯仿，观察液体由淡红色清亮转为桃红色浑浊样，盖上ep管，用力震荡15秒，或涡旋。室温下静置2～3min。再离心，参数为12000g，4℃，15min。取上层水相置于新的ep管中，注意避免吸取到中间的白色蛋白。加入0.5ml异丙醇，室温下静置10min，离心，参数为12000g，4℃，10min。弃上清，ep管中加入1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合。离心，参数为≤7500g，4℃，5min。弃上清。在通风橱内室温下自然干燥，用约30μl的rnase-free水溶解rna，将液体转至pcr管中，55℃或60℃温育10min。用分光光度仪测定rna浓度。按照taqman microrna反转录试剂盒产品说明书将rna反转录为cdna，并进行荧光定量pcr检测(qrt-pcr)。u6作为内参基因，结果采用相对定量法，公式为2
-△△
ct
。
32.2.真核细胞转染技术。
①
铺六孔板，用有血清培养基培养上述oscc细胞系至细胞量为70～80％。吸去每孔原培养基，加入新的无血清培养基(即不加胎牛血清的dmem液)1.5～2ml，置于细胞培养箱备用。
②
取ep管1个，用opti-mem培养基稀释mir-302b-3p-mimic(即mir-302b-3p的mirna mimics)，比例：opti：mir-302b-3p-mimic＝250ul：10ul。其中模拟物及对照试剂的10ul用量为锐博生物试剂公司说明书推荐值。同法稀释空白nc-mimic，比例同上。
③
取ep管1个，用opti-mem培养基稀释转染试剂invitrogen lipofectamine 2000，
(常规比例为目的待转物：lipo2000＝1：2～3)，因lipo2000预实验中六孔板每孔＞10μl时细胞状态较差，所以本次用opti:lipo2000＝250ul:10μl，保温5min。
④
混合稀释的mir-302b-3p-mimic与lipo2000，单个样本量为500ul opti-mem+5ul mir+10ul lipo2000，保温20min。同法操作nc组。
⑤
将混合液加入6孔板中，摇动培养板，轻轻混匀。
⑥
将六孔板置于细胞培养箱中，37℃，5％的co2条件下培养6小时后，更换为有血清培养基。
33.3.transwell侵袭实验与迁移实验。
①
取出成品matri-gel胶，用无血清培养基稀释为1：3浓度备用。使用前置于0℃冰箱中融化为液态，取出时置于冰上备用。避免高温。
②
在上述无菌操作台中，取出transwell小室，置于六孔板中备用。a.预计进行侵袭试验的小室上层加入35μlmatri-gel胶，避免气泡，加完后，盖好24孔板板盖，做好组别标记，放入37℃细胞培养箱中，静置45min，待matri-gel胶凝固呈果冻状时，在transwell小室下方的24孔板力，按每孔500μl的量加入有血清培养基。b.进行迁移试验的小室内不必加matri-gel胶，在下层的六孔板中置入500μl有血清培养基即可。
③
铺细胞：收取上述转染成功并培养24小时后的细胞，用无血清培养基重悬至浓度为5
×
105个/ml，备用。取上述细胞悬液，在加了matri-gel胶的侵袭实验组transwell小室上层加入200μl/孔。将剩余的上述混悬液对稀释为2.5
×
105个/ml后，在未加matri-gel胶的迁移实验组transwell小室上层加入200μl/孔。24小时后取出transwell小室。
④
固定、染色及统计：a.用干棉签擦去小室上层的细胞后，将上室置于70％甲醇溶液中固定半小时，用pbs漂洗。b.在24孔板中倒入500μl的4％结晶紫溶液，将transwell小室置于其中染色20min。c.取出小室，pbs洗净后，自然晾干。取下小室并置于载玻片上，中性树胶封片。静置24小时后显微镜下拍照保存后统计。
34.结果如图1所示：无论是初始状态(图1a、b)，还是转染mir-302b-3p-mimic(图1d)或mir-302b-3p-off(图1c)前后，mir-302b-3p的表达量高的细胞内，侵袭和/或迁移能力越低。
35.结论：在各oscc细胞系中，mir-302b-3p的表达量越高，侵袭和/或迁移能力越低。
36.实施例2裸鼠oscc颊部移植瘤动物模型转移实验
37.方法如下：
①
细胞悬液的制备：a.荧光素酶基因(luciferase)标记细胞：采用具有体外成瘤能力的高侵袭性hsc-3细胞系，用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞。其中空白组为正常无处理的荧光素酶基因标记hsc-3细胞系，对照组为过表达nc mimic的荧光素酶基因标记hsc-3细胞系，实验组为过表达mir-302b-3p的荧光素酶基因标记hsc-3细胞系。培养至生长状态良好的指数生长期。收取细胞并制备不含血清及抗生素的培养基(即dmem)重悬细胞液，计数并调整细胞浓度为1
×
107/ml。
②
提前将matri-gel胶置于4度冰箱融化。将上述细胞悬液与matri-gel胶1：1比例混合，冰上进行。
③
裸鼠接种：空白组、对照组及实验组各3只，每组按照各自组别，取相应单细胞均匀混悬液100μl，缓慢注射于裸鼠颊黏膜下。注射后用消毒棉签轻压片刻，止血及避免细胞顺针口流出，可见接种处黏膜稍隆起，随后将裸鼠放回饲养笼。待裸鼠颊部接种部位肉眼可见明显的肿瘤结节(本实验为第12天)，结节质地较硬后，空白组、对照组和实验组分别行pbs、nc agomir试剂、mir-302b-3p agomir瘤内注射，每隔2日一次，每次10nmol。肉眼观察并记录裸鼠颊部肿瘤生长情况，并用活体荧光成像检测颊部及内脏情况。
38.结果如图2所示：注射mir-302b-3p agomir的小鼠oscc颈部、腋窝淋巴结转移率显著低于对照组。
39.结论：mir-302b-3p可以抑制oscc的转移。
40.实施例3验证靶基因
41.经软件预测发现，fzd6是mir-302b-3p的靶基因，其靶向识别模式如图3a所示。本实施例的目的是验证该基因是否为靶基因。
42.1.双荧光素酶报告基因系统验证
43.方法：将hek-293t细胞接种于96孔板，使转染细胞密度达1
×
107/ml。将mir-302b-3p过表达载体和psicheck-2-report-fzd6-3’utr载体共转染至293t细胞中，共转染mir-302b-3p过表达载体和psicheck-2-report-fzd6-3’utr mut载体或psicheck-2-report空载体做对照。每组共转染海蜇荧光素酶(prl-tk)作为内参，转染试剂为invitrogen lipofectamine 2000。转染48小时后，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光发光情况，并裂解细胞，按照promega双荧光素酶试剂盒说明书进行操作，所用仪器为微孔板发光分析仪。
44.结果：因为mir-302b-3p对psicheck-2-report-fzd6-3’utr载体的utr区进行识别，该载体的荧光素酶表达受到抑制，因此wt-utr组(即psicheck-2-report-fzd6-3’utr载体)荧光受到抑制，比内参荧光要弱；而mut-utr组(psicheck-2-report-fzd6-3’utr mut载体)的mirna识别位点被突变，表达不受mir-302b-3p的抑制，因此其荧光比内参荧光要强，与vector组(psicheck-2-report空载体)荧光相对强弱趋势一致(图4)。可见mir-302b-3p可识别fzd6的3’utr区，并下调具备该3’utr区的基因。
45.2.rna pull-down验证
46.方法：使用lipofectamine 2000转染试剂(美国invitrogen，美国)，用生物素化的mir-302b-3p探针(序列为：5
′-
cuacuaaaacauggaagcacuua-3
′
(seq id no.7))及生物素化的nc-mimic探针(序列为：5
′-
caguacuuuuguguaguacaaa-3
′
(seq id no.8))(ribobio，中国广州)将hsc-3细胞转染24小时，然后在冷的全细胞裂解缓冲液中裂解。通过将细胞裂解液与抗生蛋白链菌素包被的磁珠(thermo fisher scientific，美国)在室温下孵育1小时，来完成目标mrna-mirna复合物的下拉。用下拉洗涤缓冲液洗涤珠子3次。使用rneasy mini kit(qiagen，德国)提取总rna。行rt-qpcr以检测相对的fzd6mrna含量。
47.结果：如图3c所示，mir-302b-3p探针可大量结合fzd6的mrna，结合能力远高于对照组(nc-mimic探针)。
48.结论：fzd6是mir-302b-3p的靶基因。
49.实施例4临床样本验证fzd6与oscc侵袭性和/或迁移性的关系
50.收集四川大学华西口腔医院就诊、经手术切除后病理确诊为oscc的组织样本，制备oscc石蜡切片。观察切片并使用免疫组织化学染色检测fzd6的表达情况；随后考察病人生存率与fzd6表达量高低的关系。
51.免疫组织化学方法如下：
52.石蜡切片置于65℃烤箱，2h。过二甲苯后梯度酒精水化。1
×
tbs洗5min，2次(3min，3次)。edta修复液行抗原修复；3％过氧化氢封闭。按稀释比滴加羊抗的fzd6抗体，室温/37℃条件下孵育10-30min，后在4℃下放过夜。次日取出，置于37℃，40min；tbs洗5min，2次。滴加dako公司产通用型二抗，37℃下静置40min；dab显色，苏木素复染；清水冲洗片子后过一遍盐酸酒精液；细水流轻轻冲洗2-5min，去除盐酸酒精。玻片置于氨水中反蓝约10min。洁净水细流冲洗20min。脱水、透明、封片。胶封﹥24h，扫片。光盘刻录图像数据。
53.结果如图4所示：正常口腔黏膜的fzd6表达量低，而oscc口腔黏膜以及淋巴结转移组织中fzd6表达量高(图5a、b)；fzd6低表达患者的生存率显著高于fzd6高表达患者生存率。
54.这进一步证实了fzd6表达量越高，oscc越严重(发生转移、死亡率高)。
55.实施例5验证mir-302b-3p、fzd6与口腔鳞癌的侵袭性的关系
56.本实施例使用慢病毒包装fzd6过表达载体(fzd6-oe)、fzd6小干扰rna(fzd6-si，序列为5
′-
ucagcggcuuguaucuugu-3
′
(seq id no.9))、mir-302b-3p-mimic(302b-3p-m)、随机mirna mimic(nc-mimic)、mir-302b-3p agomir(302b-3p-ago，序列同302b-3p-m)或随机agomir(nc-ago，序列同nc-mimic)组合侵染口腔鳞癌细胞系hsc-3。其中，在hsc-3细胞的体外实验中，fzd6-si与mir-302b-3p-mimic和nc-mimic均通过脂质体转染，通过实施例1的方法检测其转移细胞和侵袭细胞，并通过免疫组化、western blot检测相关蛋白的表达。而在动物体内研究部分，首先将hsc-3细胞经脂质体转染mir-302b-3p-mimic，再通过尾静脉注射方式构建裸鼠肺转移瘤模型；再通过尾静脉将mir-302b-3p agomir及nc-agomir直接注射进入各组裸鼠血液循环，被靶细胞摄取。该产品为人工合成的动物专用模拟物，可被活体动物细胞高效吸收并发挥稳定和高效的作用；在没有转染试剂的情况下，也可以高效进入靶细胞中发挥作用，可维持长达数周的效果。
57.实验操作参考：
58.1.慢病毒包装和侵染。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，用含10％血清的培养基调整细胞密度为约5
×
106个/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前2h更换为无血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(gv载体质粒20μg、phelper1.0载体质粒15μg、phelper 2.0载体质粒10μg)，不相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；混合液缓慢滴加至293t细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混合物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混合物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％co2培养箱内继续培养48-72h。根据细胞状态，收集转染后48h的293t细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片，以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用pbs或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬。经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清按要求分装。运用倍比稀释原则对病毒进行滴度测定，感染口腔鳞状细胞癌细胞系hsc-3。感染24～48h后观察荧光标记基因的表达情况，荧光率大于80％，拍完荧光后补加500μl正常培养基，待长满后收集细胞用于fzd6基因的rna提取或fzd6蛋白质检测验证。
59.2.western blot技术。培养生长状态良好的空白组及处理组细胞至对数生长期。按照常规方法提取细胞总蛋白并进行bca定量。通过sds-page分离，半干转至pvdf膜，5％脱脂奶粉封闭1小时，加入相应稀释比例的羊抗的fzd6抗体(1:1000)，4℃过夜。tbst洗膜后，加入辣根过氧化酶(hrp)标记的对应二抗(兔抗山羊igg，1:5000)孵育1小时，充分洗膜后用ecl化学发光法进行暗室曝光。
[0060]3·
免疫组织化学染色。方法同实施例4。结果：
[0061]
本领域公知的，小干扰rna可特异性识别靶基因的dna或mrna序列，在转录水平或转录后水平抑制靶基因表达。图5a～c表明，fzd6的过表达可导致oscc侵袭、迁移能力增强；而fzd6的小干扰rna能够通过抑制fzd6的表达，进而减弱oscc侵袭、迁移能力。而使用mir-302b-3p也能明显减弱oscc侵袭、迁移能力，效果与小干扰rna类似。
[0062]
由图5d可知，fzd6的小干扰rna能够显著降低侵袭迁移关键蛋白rhoa、rock2、vimentin的表达水平，过表达fzd6能够显著提高rhoa、rock2、vimentin的表达水平，而过表达mir-302b-3p后，fzd6蛋白表达水平显著下降，且侵袭迁移关键蛋白rhoa、rock2、vimentin的表达水平同样地显著下调。
[0063]
由图5f可知，过表达fzd6可提高oscc裸鼠肺转移模型中的肺转移数，这一结果可被mir-302b-3p逆转。
[0064]
结论：mir-302b-3p通过抑制fzd6的表达，减弱oscc侵袭、迁移能力。
[0065]
综上，mir-302b-3p表达量与oscc侵袭能力、迁移能力负相关；mir-302b-3p通过下调fzd6表达，减弱oscc侵袭能力、迁移能力，延缓oscc病程。因此，检测mir-302b-3p的试剂可以用于筛查oscc的侵袭性和/或迁移性；且mir-302b-3p(及其前体)能够作为延缓oscc侵袭和/或迁移的药物中的活性成分。