一种促进皮肤伤口愈合的组合物及其制备方法与流程

本发明涉及医学创面修复技术领域，更具体的说，是一种用于促进皮肤伤口愈合的组合物及其制备方法。

背景技术：

皮肤是人体最大的器官，是抵御病原体的第一道屏障。皮肤伤口愈合是皮肤组织受到损伤后再生修复的生理过程，尽管烧烫创面在临床治疗中取得了较大的进展，但仍存在供体皮来源不足、深度伤口修复困难、慢性伤口难愈合、瘢痕增生所致的功能障碍等诸多难题。

近年来，随着再生医学的发展，干细胞治疗作为生物治疗的有效方法之一，在创伤领域已显示出广阔的应用前景。间充质干细胞(mscs)作为干细胞家族的一个重要成员，具有多向分化、自我更新能力强、免疫原性低、免疫调节功能，被认为是在再生医学领域理想的种子细胞之一。多项研究表明，mscs具有强大的促进伤口愈合的能力，及促进组织修复和再生的功能。mscs能够表达和旁分泌多种细胞因子，比如：成纤维细胞生长因子(fgf)、内皮细胞生长因子(vegf)、表皮细胞生长因子(egf)、白细胞介素(il)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等。在伤口愈合过程中，fgf的迁移可以加速伤口的愈合，vegf可促进血管生成，il及tnf-α可以降低炎症反应，这些因子对改善伤口附近的微环境及伤口愈合起到积极的促进作用。

现有干细胞技术治疗伤烫伤创面多采用骨髓间充质干细胞促进伤口愈合，但骨髓间充质干细胞数量少，需要开刀手术，提取困难。亦有采取脂肪干细胞治疗烧烫伤创面，但是脂肪干细胞提取也需要外科手术。目前，使用间充质干细胞治疗创面，多采用创面局部注射的方法，给大面积创伤和烧伤带来新的伤口，限制了干细胞修复创面愈合的能力。

现有的药物在治疗伤口时，存在愈合率低、有效率低、治疗时间长、容易造成炎症反应，出现瘢痕增生现象。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种促进皮肤伤口愈合的组合物及其制备方法，实现以下发明目的：

（1）本发明提供的组合物使用天然提取物，不含任何非天然添加剂，安全性较高，无副作用。

（2）本发明提供的组合物，降低炎症反应，促进创面愈合，避免出现瘢痕增生现象。

（3）本发明提供的组合物，促进皮肤伤口愈合，愈合率高，有效率高，治愈周期短。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种促进皮肤伤口愈合的组合物，所述组合物，包括以下活性成分：间充质干细胞培养上清液、2-脱氧-d-核糖、雌二醇、凡士林油、丁二醇、柠檬酸、牛油树脂、黄原胶。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述组合物中，活性成分的质量百分比为65.4-80.6%，间充质干细胞培养上清液、2-脱氧-d-核糖、雌二醇、凡士林油、丁二醇、柠檬酸、牛油树脂、黄原胶的质量比为18-22：18-22:18-22:4.5-5.5:4.5-5.5:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。

所述组合物，以质量百分比计，包括以下组分：间充质干细胞培养上清液18-22%、2-脱氧-d-核糖18-22%、雌二醇18-22%、凡士林油4.5-5.5%、丁二醇4.5-5.5%、柠檬酸0.8-1.2%、牛油树脂0.8-1.2%、黄原胶0.8-1.2%、助剂补足100%。

所述组合物，以质量百分比计，包括以下组分：间充质干细胞培养上清液20%、2-脱氧-d-核糖20%、雌二醇20%、凡士林油5%、丁二醇5%、柠檬酸1%、牛油树脂1%、黄原胶1%、助剂补足100%。

所述间充质干细胞培养上清液为人源脐带间充质干细胞培养3-4代时收集的上清液。

所述间充质干细胞培养上清液为含有egf因子、fgf因子、vegf因子、il-10因子的ultraculture培养基，其中egf因子浓度为74-76ng/ml，fgf因子浓度为90-95ng/ml，vegf因子浓度为83-87ng/ml，il-10因子浓度为88-92ng/ml。

所述组合物为喷雾剂时，助剂为水。

按照常规方法将组合物各组分制备成化妆品的各种制剂。

鉴于间充质干细胞在治疗伤口愈合中具有重要的作用，寻找最佳的给药方式，使mscs的迁移、免疫调节、血管生成和修复能力达到最大化，以缩短皮肤伤口愈合时间，提高愈合率和有效率，降低炎症反应，避免出现瘢痕增生现象，是本发明研究的关键所在。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）本发明提供的含有间充质干细胞培养上清液、2-脱氧-d-核糖、e2和各种活性物质的组合物喷雾剂治疗小鼠烧烫伤面，各组合物成分均无天然提取物，整个治疗过程无副作用发生，安全性较高；只需14天即可使小鼠创面完全愈合，愈合率高达100%，总有效率达100%；

（2）本发明的促进皮肤伤口愈合的组合物，可以降低炎症反应，加速皮肤伤口愈合，避免瘢痕增生现象，尤其对治疗慢性伤口、深度烧伤、糖尿病性溃疡、大面积创面，效果显著。

附图说明

图1p3代脐带间充质干细胞形态的显微镜观察图；

图2流式细胞技术鉴定间充质干细胞表面相关抗原cd90的流式图；

图3流式细胞技术鉴定间充质干细胞表面相关抗原cd73的流式图；

图4流式细胞技术鉴定间充质干细胞表面相关抗原cd105的流式图；

图5流式细胞技术鉴定间充质干细胞表面相关抗原cd44的流式图；

图6流式细胞技术鉴定间充质干细胞表面相关抗原cd34的流式图；

图7流式细胞技术鉴定间充质干细胞表面相关抗原hla-dr的流式图。

具体实施方式：

为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体的实施例对本发明实施方式中的技术方案进行详细地描述。

实施例1脐带间充质干细胞上清培养液的制备

取临床健康足月新生儿脐带，在超净工作台中先用75%酒精消毒两次，放在培养皿中，用镊子剥离出其中的华氏胶，用剪刀剪碎至1mm³大小的组织块，点阵式间距1cm将组织块贴于50ml培养瓶底壁，加入含有血清替代物的ultraculture培养基培养，于5%co2、37℃培养箱中培养，每3d换1次液，当细胞达70%-80%融合时进行传代、扩增，并于倒置显微镜下观察细胞形态。传至p3时，加入培养基继续培养48h，收集培养上清液，3000g/10min离心获得上清液，并于220目滤膜过滤去除细胞碎片，所得过滤液即为间充质干细胞培养上清液；0.25%胰蛋白酶消化瓶底的p3代细胞，调节细胞密度为1×10⁶个/ml，置于流式管中，分别加入抗小鼠抗人单克隆抗体：cd29、cd44、cd90、cd105、igg1-fitc和hla⁃dr，4℃避光孵育30min。pbs洗涤两遍，1000rpm/3min，使用流式细胞仪进行检测分析，当cd73、cd44、cd90和cd105表达率高达98%以上，igg1-fitc和hla⁃dr表达率不足1%时，即鉴定为脐带间充质干细胞。

所述间充质干细胞培养上清液，含有血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf-1)、上表皮生长（egf）、纤维母细胞生长因子-2（fgf-2）、粒细胞巨噬细胞刺激因子（gm-csf）、碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、hgf、白细胞介素-10（il-10）、转化生长因子-β（tgf-beta）。

利用elisa定量试剂盒测定间充质干细胞培养上清液的主要因子含量，其中egf因子浓度为75ng/ml，fgf因子浓度为92ng/ml，vegf因子浓度为85ng/ml，il-10因子浓度为90ng/ml。

实施例2一种促进皮肤伤口愈合的组合物

所述组合物包括活性成分和助剂；

所述活性成分包括间充质干细胞培养上清液、2-脱氧-d-核糖、雌二醇、凡士林油、丁二醇、柠檬酸、牛油树脂、黄原胶；

所述助剂为水；

所述组合物，以质量百分含量计算，包括以下组分：

表1

所述间充质干细胞培养上清液，为含有egf因子、fgf因子、vegf因子、il-10因子的ultraculture培养基，egf因子浓度为75ng/ml，fgf因子浓度为92ng/ml，vegf因子浓度为85ng/ml，il-10因子浓度为90ng/ml。

按上述配比混合均匀，装于喷雾剂瓶中即得到含有间充质干细胞上清液的组合物。

实施例3体外伤口愈合实验

（1）小鼠烫伤模型的制备

选择若干只16周龄、体重200左右的裸鼠，术前禁食12小时，不禁水。将裸鼠麻醉后，固定于泡沫板上，背部脱毛后常规消毒；水煮沸，用圆柱状空心管（直径2cm）分别垂直贴于小鼠背部脊柱右侧皮肤，加入10ml沸水后维持20s，形成2cm的圆形烫伤创面，医用碘伏消毒。

（2）小鼠伤口愈合的观察

将烫伤小鼠随机分为3组，每组20只，分别是：

空白组（生理盐水）；

对照组（市面上购买的烫伤药品）；

实验组（即实施例2制备的喷雾剂）。

实验组动物：每天早中晚在烫伤创面各喷1次组合物喷雾剂，空白组和对照组以同样方式分别使用生理盐水、实验组喷雾剂喷于伤口表面。

细胞注射当日记为第1天（1d），每组于伤后不同时间点（3d、7d、及14d）测定小鼠局部创伤面积，并按下式计算创面愈合率。

愈合率/%=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%

有效性评价标准：

愈合率≥75%为痊愈，≥50%为显效，≥25%为有效，≤25%为无效。

总有效率/%=（显效例数+有效例数）/各组小鼠总数×100%

从表2和表3中可以看出，治疗第14d时，实验组小鼠创面愈合率高达100%，完全愈合；空白组和对照组，小鼠伤口愈合率仅有60%和80%。实验组总有效率为100%，对照组总有效率为80%，实验组总有效率高于对照组，两组的总有效率差异具有统计学意义（p<0.05）。结果表明，实验组组合物对小鼠创面的治疗效果显著优于市面上购买的烫伤药品。

实验过程中，发现在治疗第3-7d时，空白组和对照组各有2只小鼠出现了严重炎症反应及溃疡面增大，已痊愈的位置出现了瘢痕增生的现象。而实验组小鼠创面愈合速度最快，治疗第10天左右，伤口基本愈合；治疗第14天时，完全康复，20只小鼠均没有瘢痕增生的现象。因此，本发明提供的含有间充质干细胞上清液的组合物能够有效治疗皮肤伤烫伤创面，加速皮肤伤口愈合，缩短病程。

表2小鼠创面愈合率比较

表3小鼠创面总有效率比较

本发明组合物中2-脱氧-d-核糖、雌二醇、凡士林油、丁二醇、柠檬酸、牛油树脂、黄原胶与间充质干细胞培养上清液具有协同增效作用，2-脱氧-d-核糖、雌二醇、凡士林油、丁二醇、柠檬酸、牛油树脂、黄原胶可以提高和促进间充质干细胞培养上清液对伤口的愈合能力，缩短治疗周期。

本发明的组合物也可以采用实施例2所述活性成分和其他常规助剂复配，制备成膏剂、粉剂等，不同的产品形式对组合物的治疗妊娠物和疤痕的效果基本没有影响。