一种预防药物性颌骨坏死的药物的制作方法

本发明涉及一种预防药物性颌骨坏死的药物。

背景技术：

双膦酸盐(bisphosphonates，bps)是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的一类新药物。能特异的与骨质中的羟膦灰石结合，抑制破骨细胞活性，从而抑制骨质吸收。用于治疗骨质疏松症，变形性骨炎，恶性肿瘤骨转移引起的高钙血症和骨痛症等。

近年来，越来越多的报道显示，bps使用可能导致药物性颌骨坏死(mronj)，是mronj的主要诱因。该病临床上以骨面裸露、死骨形成、疼痛、口臭等为特征。由于mronj发病机理不明确，临床上尚无完全有效的治疗方法。

dna四面体框架核酸(tfnas)是一种由dna单链通过碱基互补配对自组装形成的四面体纳米结构，通常是由dna单链(通常为4条，也可为4条以上)围成4个三角形，每个三角形作为四面体的一个面，每两个三角形各有1条边互补配对形成双链，构成四面体的一条棱，由此组成四面体结构，因此也被称为“dna四面体”。tfnas生物相容性高，没有细胞毒性，已有报道将其用于转运核酸(如：适配体、sirna等)、阿霉素等物质，是一种具有良好应用前景的药物载体。

目前未见tfnas作为药物的活性成分，用于预防药物性颌骨骨坏死的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种预防药物性颌骨坏死的药物。

本发明的技术方案如下：

一种预防药物性颌骨坏死的药物，所述药物以dna四面体为活性成分。

如前述的药物，所述dna四面体是用等物质的量的序列如seqidno.1～4所述的4条dna单链通过碱基互补配对形成的四面体结构分子。

如前述的药物，所述dna四面体是将所述dna单链先经过加热变性，再冷却复性制备得到；

优选的，所述加热变性的温度是95摄氏度，时间为5分钟。

优选的，所述冷却复性的温度是4摄氏度，时间为20分钟以上。

dna四面体在制备预防药物性颌骨坏死的药物中的用途。

如前述的用途，所述预防药物性颌骨坏死的药物是促进破骨细胞形成和/或维持破骨细胞的骨吸收功能的药物。

如前述的用途，所述预防药物性颌骨坏死的药物是提高骨矿物质密度、增加骨量的药物。

如前述的用途，所述药物性颌骨坏死是由双膦酸盐类药物引起的。

如前述的用途，所述药物性颌骨坏死是由唑来膦酸引起的。

如前述的用途，所述dna四面体是用等物质的量的序列如seqidno.1～4所述的4条dna单链通过碱基互补配对形成的四面体结构分子。

如前述的用途，所述dna四面体是将所述dna单链先经过加热变性，再冷却复性制备得到；

优选的，所述加热变性的温度是95摄氏度，时间为5分钟。

优选的，所述冷却复性的温度是4摄氏度，时间为20分钟以上。

双膦酸盐类药物被广泛应用，很多患者因此遭受药物性颌骨坏死的折磨。发明人研究发现，dna四面体可以通过促进破骨细胞的形成(由单核巨噬细胞分化成破骨细胞)，维持破骨细胞骨吸收功能，抑制双磷酸盐药物对骨质的破坏，预防骨坏死的发生。

将dna四面体用于制备预防药物性颌骨坏死的药物，具有重要的应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：dna四面体的合成验证图。a，合成示意图；b，动态光散射结果；c，page胶检测结果；d，细胞摄入实验结果。

图2：dna四面体框架核酸对增殖迁移的影响图。a，za浓度与细胞活性的关系；b，dna四面体与za共同处理下的细胞活性；c，dna四面体与za共同处理下细胞迁移能力统计图；d，细胞迁移能力检测图。

图3：dna四面体可以促进破骨细胞的分化与功能。a，免疫荧光结果；b，造孔试验结果；c，trap染色结果。

图4：wnt信号通路相关蛋白的检测图。a，westernblotting检测图；b～f，将a图信号数字化后的统计图。

图5：动物实验大体观与micro-ct的结果图。a，直接观察图；b，micro-ct检测图举例；c，bmd统计结果；d，bv/tv统计结果；e，愈合大鼠数量统计结果。

具体实施方式

实施例1本发明复合物的制备和验证

1.tfnas的制备

将四条dna单链(s1、s2、s3、s4)溶解于tmbuffer(10mmtris-hcl,50mmmgcl2,ph＝8.0)中，四条dna单链的终浓度为1000nm，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到tfnas。合成示意图如图1a所示。

在需要荧光标记时，可在任一dna单链的5’端连接荧光基团，例如cy5。

四条单链的序列(5′→3′)如下：

2.鉴定

合成后的dna四面体，page胶结果可见dna四面体大小约为180bp，可认为dna四面体已成功合成(图1c)。动态光散射结果可见，dna四面体大小为15nm左右，与理论值相符(图1b)。

以下用实验例的形式对本发明的有益效果进一步说明。实验例中的dna四面体(tfnas)均使用实施例1的方法制备得到。

实验例1体外模型实验

1.方法

1.1构建bronj体外模型

取对数生长期的raw264.7细胞(一种单核巨噬细胞)，分为control组、za(唑来膦酸)组、tfnas+za组。细胞贴壁生长24h时，三组处理条件分别如下:a)control组：5％血清培养基，50ng/mlrankl(核因子κb受体活化因子配体，又称“破骨细胞分化因子”)供应；b)za组：含5％血清的培养基，同时加入10μmza和50ng/mlrankl；c)含5％血清的培养基，加入50ng/mlrankl、10μmza和250nmtfnas，持续120h(每2天更换一次培养基)。

在本实验例中，rankl的作用是：促进raw264.7细胞分化形成破骨细胞。

1.2cck8细胞毒性实验

将raw264.7细胞分组培养于96孔板(5×10³/孔)中，按1.1的方法进行分组处理。

再去除培养基，pbs冲洗一次，然后加入无血清dmem培养基与10％(v/v)cck-8溶液，在37℃孵育2小时后，在450nm波长下检测样品的od值。

1.3细胞摄取tfnas

细胞被播种到共聚焦小中皿24h。随后,这些细胞用10μm的za,50ng/mlrankl和250nmcy5标记的tfnas或250nmcy5标记的ssdna处理6h。用pbs三洗后,这些细胞用4％多聚甲醛固定。然后，用dapi和phalloidin染色细胞核和细胞骨架。所有样品均用共聚焦显微镜观察并摄取图像。

1.4transwell化验

细胞生长在6-welltranswell板块(8-μm孔隙)。将含有10％fbs和tfnas(250nm)的dmem培养基加入下腔，将不含血清的dmem与上腔浸泡8h，然后轻轻拭去腔室内底未迁移的细胞。pbs洗涤三次后，用结晶紫染色。光镜下统计细胞迁移数。

1.5抗酒石酸磷酸酶(trap)染色

细胞接种于6孔板，处理条件如下:a)5％血清培养基，5％rankl供应；b)含5％血清的培养基，加入za和rankl；c)含5％血清的培养基，加入rankl、za和tfnas，持续120h(每2天更换一次培养基)。用pbs三次洗涤后,所有的细胞都在37℃的4％多聚甲醛中固定25分钟。将染色液加入6孔板，37℃避光孵育1h，洗涤干燥后，用光学显微镜观察细胞并拍照。

注：抗酒石酸磷酸酶(trap)是破骨细胞(oc)的标志酶,通常可作为oc鉴定的标志。

1.6坑形成实验

根据生产说明书进行了造孔试验。简而言之，raw264.7细胞被接种到骨测定表面板。再用rankl(50ng/ml)+za或pbs刺激raw264.7细胞培养7天。除去成熟的破骨细胞后，加入10％的naclo溶液，室温孵育5分钟。除去naclo溶液后，用ddh2o洗3次。将平板置于空气中干燥约4小时，最后用显微镜观察凹坑。

1.7免疫印迹

总蛋白通过细胞裂解法提取，与5×loading缓冲液混合，加热10min(100℃)。各组样品经12％十二烷基硫酸钠page处理后，转至聚偏氟乙烯膜。这些膜被5％脱脂牛奶在37℃浸泡1h和沉浸到初级抗体(anti-gapdhanti-total/磷酸化akt、anti-c-fosanti-β-catenin，anti-nfatc1,anti-gsk3；1:1000；4℃过夜。用tbst(0.1％tween-20,10mmtris-base和100mmnacl；ph7.5)洗涤3次，二抗(1:2000；使用abcam)孵育1h，然后使用凝胶-blot成像系统对条带进行可视化，并使用imagej软件进行定量。

2.结果

2.1细胞对tfnas的摄取

结果如图1d所示，细胞对tfnas的摄取明显高于对单链的摄取。

该结果说明tfnas能进入细胞发挥作用，排除了单链的影响。

2.2细胞活性、迁移性

随着za浓度的增加，细胞的活性逐渐降低(图2a)。而tfnas的加入，能够逆转za对细胞活性(图2b)和迁移能力(图2c，2d；图2c是对图2d结果的统计分析)的负面影响。

注：图2a～c中，数据表示为平均值±sd(n＝4)；学生t检验用于统计分析；统计学分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

该结果说明：单核巨噬细胞向破骨细胞分化过程中，za抑制细胞的活性、迁移能力，最终会抑制破骨细胞的形成；而tfnas可以逆转za的抑制作用。

2.3tfnas对破骨细胞功能的影响

采用免疫荧光技术、trap染色、核形成实验和westernblotting评价tfnas对破骨细胞的影响。

通过观察图3a中的绿色荧光，可以看出tfnas可以显著促进肌动蛋白环的形成。红色荧光为vi蛋白，表明tfnas对细胞粘附有积极作用。图3a的荧光结果同时表明，对照组和tfnas+za组的细胞融合称为多核的破骨细胞，而za组大多数细胞维持raw264.7的单核细胞形态。

骨研磨板的吸收度可以反映骨吸收的活性。图3b中tfnas+za组骨研磨片的吸收明显高于za组，说明tfnas+za组的破骨细胞可保持较好的破骨细胞功能(骨吸收功能)，tfnas可以抑制za对破骨细胞功能的不良影响。

trap是一种破骨细胞标志物，可作为破骨细胞鉴定的标志物。胞质经trap染色后呈酒红色。图3c的trap染色结果显示，在rankl的作用下，raw264.7细胞可以融合形成破骨细胞，za组的多数细胞还未从raw264.7细胞融合形成破骨细胞，而tfnas+za组与对照组接近，有较多破骨细胞形成。

c-fos和nfatc1与破骨细胞的分化密切相关。westernblotting结果(图4a、c、e)显示，za可显著抑制c-fos和nfatc1的表达，从而抑制oc的形成和骨吸收。在tfnas+za组中，二者的表达明显上调。

以上结果说明：tfnas可以逆转za对破骨细胞形成和功能的抑制作用。

2.4相关蛋白的检测

如图4a、b、d、f所示，tfnas处理过后，akt激活后，gsk-3活性下降，β-catenin因降解减少而浓度增加。

以上结果说明：tfnas逆转za对破骨细胞形成的抑制作用，与wnt信号通路的激活密切相关。

注：图4b～f中，条形图高度表示为平均值±sd(n＝4)；学生t检验用于统计分析；统计学分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

本实验例的结果表明：za抑制巨噬细胞向破骨细胞分化，并抑制了破骨细胞的骨吸收功能，而tfnas可以逆转前述的抑制作用，该过程与wnt信号通路激活相关。

实验例2动物实验

1.方法

30只8周大体重从180-200g的wistar雄性大鼠，随机分为三组：对照组、za组和tfnas+za组。每只大鼠腹腔注射地塞米松(5mg/kg)，持续5周。动物在za组和组tfnas+za组收到腹腔注射za(125μg/公斤)为5周每周两次。tfnas+za组拔牙后1周内每天接受腹腔注射tfnas。而对照组则在相同剂量的生理盐水下处理5周。在动物实验的第二周进行拔牙，即在腹腔注射地塞米松和za的后一周。臼齿周围的牙龈被牙科探查器分开。用血管钳作为牙钳，切除左上颌第一磨牙。用棉球按压拔牙窝止血。

在本实验例中，地塞米松的作用是：地塞米松会导致骨质疏松，能模拟需要服用za治疗的患者体内骨质情况，促进构建更接近实际的体内药物性颌骨坏死模型。

2.结果

如图5a所示，大鼠口内大体观(第三周和第五周)表明tfnas处理后拔牙窝愈合，软组织覆盖。图5c和d显示：za对牙槽骨(属于颌骨)的骨矿物质密度(bmd)、骨体积比(bv/tv)均有较大负面影响，体现出对牙槽骨的破坏作用；而tfnas可以显著预防前述的破坏作用。图5b和图5e分别体现了各组大鼠牙槽窝的总体愈合情况，其中，对照组愈合完整，za组大部分没有愈合，而tfnas+za组大部分愈合。

注：bv/tv具体表示骨组织体积与组织体积比值，可直接反映骨量变化情况。

本实验例的结果表明：za对颌骨具有破坏作用，tfnas可以提高骨矿物质密度，增加骨量，预防za对颌骨的破坏作用。

综上，本发明的预防药物性颌骨坏死的药物，可以通过促进破骨细胞的形成，维持破骨细胞骨吸收功能，抑制双磷酸盐药物对骨质的破坏，预防骨坏死的发生。

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<110>四川大学

<120>一种预防药物性颌骨坏死的药物

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