大麻素类化合物及其在治疗帕金森症中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体是涉及一种大麻全谱系油在治疗帕金森中的应用。


背景技术：

2.帕金森病(pd)是中枢神经系统的变性障碍，是阿尔茨海默病之后的第二最常见神经退行性疾病。pd通常被归类为运动障碍，其主要特征是休息时震颤、僵硬、运动徐缓和姿势不稳，其中，休息性震颤是最常见且通常是最早发展的症状，通常在该疾病的晚期发生痴呆。pd的运动症状源自黑质(中脑的一个区域)中多巴胺产生细胞的死亡，该细胞死亡的原因不明。尽管多巴胺能够有效地治疗该疾病早期阶段的运动症状，但是，多巴胺的效力在该疾病的晚期阶段会发生损耗，并且它的长期使用会导致运动并发症。
3.大麻隶属于大麻科、大麻属植物，具有重要的农用及药用价值。大麻素是一类已知的能激活细胞中大麻素受体的化学物质，药理研究表明，大麻中的主要活性成分为大麻素类化合物(cannabinoids)。植物大麻素是从大麻植物中提取的大麻素，也可以人工合成。从大麻植物中可分离出至少85种不同的大麻素，它们的结构因前体大麻素(cbg)在哪里发生环化而不同。大麻植株中主要的大麻素类化合物有四氢大麻酚(thc)、大麻酚(cbn)、大麻二酚(cbd)、次大麻二酚(cbdv)、四氢次大麻酚(thcv)、大麻萜酚(cbg)等，其中前三者占大麻素类化合物的90％以上。
4.众所周知，不同的大麻素具有不同的性质。例如，cbdv是大麻中的非成瘾性成分，能阻碍大麻中主要的致人上瘾物质thc对人体神经系统的影响，并具有治疗癫痫、神经性疼痛、关节炎、流感等药理活性。因此，应当认识到，虽然大麻类化合物都是在大麻植物的不同品系中生产的，但不能假定它们都具有相同的特性。正是因为这一点，针对大麻中的众多提取物的研究始终在进行，并且不断有新的突破。例如，欧洲专利ep2726069公开了用于预防或治疗神经退行性疾病或疾病的大麻素，其中，优选地，大麻素是大麻色烯(cbc)、次大麻二酚(cbdv)和/或大麻素酸(cbdva)，要预防或治疗的神经退行性疾病或紊乱是阿尔茨海默病。英国专利gb2432312公开了大麻植物提取物大麻素在预防神经变性方面比纯化化合物更有效，特别大麻素的提取物四氢大麻素(thc)或大麻素(cbd)。然而，目前公开的一系列大麻素的药物应用中，thcv很少有报道，更少有报道将其用于治疗帕金森。


技术实现要素：

5.本发明针对上述背景技术中的研究的空白和不足，提供了一种大麻素类化合物治疗帕金森中的应用，所述大麻素类化合物中包含次大麻二酚(cbdv)、大麻萜酚(cbg)、大麻二酚(cbd)和四氢次大麻酚(thcv)，不含可致人上瘾的物质四氢大麻酚(thc)，无毒副作用，可安全有效的治疗帕金森病，尤其是帕金森病运动并发症。
6.为达到本发明的目的，本发明所述大麻素类化合物中包含cbdv、cbg、cbd和thcv，不含thc。
7.优选地，在本发明的一些实施例中，所述大麻素类化合物中cbdv、cbg、cbd和thcv的质量比为9～12：1～5：60～65：1～2。
8.更优选地，在本发明的一些实施例中，所述大麻素类化合物中cbdv、cbg、cbd和thcv的质量比为10-11：1-3：62-65：1.5-2。
9.另一方面，本发明提供了一种治疗帕金森的药物组合物，所述药物组合物中包含cbdv、cbg、cbd和thcv，不含thc。
10.优选地，在本发明的具体示例中，所述药物组合物中cbdv、cbg、cbd和thcv的质量比为9～12：1～5：60～65：1～2。
11.更优选地，在本发明的一些实施例中，所述药物组合物中cbdv、cbg、cbd和thcv的质量比为10-11：1-3：62-65：1.5-2。
12.本发明所述药物组合物可制成具体的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂和贴剂等，优选为口服剂型。
13.进一步优选地，当本发明所述的口服剂型为片剂时，药用赋形剂可以是惰性稀释剂或填料(例如蔗糖、微晶纤维素、淀粉、碳酸钙、氯化钠、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；崩解剂，包括淀粉/淀粉衍生物、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐、藻酸、聚乙烯吡咯烷酮或羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂，例如硬脂酸镁；粘合剂(例如阿拉伯树胶、褐藻酸、褐藻酸钠、明胶、淀粉、预凝胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂，以及抗粘剂(例如硬脂酸、硅酸盐或滑石)。还可以包含其他药用赋形剂，例如着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂和湿润剂等。
14.必要时可对片剂进行包衣。包衣可以适于以预定模式释放活性药物物质(例如，为了实现受控释放制剂)或者它可以适于直到通过胃后才释放活性药物物质(肠溶衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或肠溶衣(例如邻苯二甲酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙甲纤维素、琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。
15.用于经口使用的制剂也可以作为咀嚼片或作为其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如马铃薯淀粉、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合的硬明胶胶囊，或作为其中活性成分与水活油介质，例如液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊呈现。
16.用于经口使用的制剂还可以经口施用的液体，适用于通过加入水制备含水混悬剂的粉剂、可分散粉剂或颗粒剂。
17.通过将多种本发明的活性成分与药物可接受的载体混合而形成本发明所述药物组合物，然后可以以适合公开给药途径的各种剂型方便地给予。施用可以是每天一次至多次，持续若干天至若干年，或者可以甚至持续患者一生。所述的载体包括惰性固体稀释剂或填充剂、无菌水溶液和各种有机溶剂。药物制剂可根据药物配方的标准程序方便地制成单位剂型。每单位剂量包含治疗有效量的活性化合物。
18.本发明组合中药物的治疗有效量包括对于减少帕金森病症状、终止或减慢疾病的
进展(一旦其已是临床明显的)、或防止或减少形成该疾病的风险是有效的量，具体的可能会根据活性化合物的性质和预期的剂量方案而改变。一般来说，在每单位剂量0.1mg～5000mg的范围内。需要指出的是，活性成分的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括待治疗患者的一般情况和年龄、待治疗疾病的性质和具体活性成分或所选择的活性成分以及诊治医师的主观判断。
19.本发明中，所述次大麻二酚(cbdv)、大麻萜酚(cbg)、大麻二酚(cbd)和四氢次大麻酚(thcv)可以是化学合成产物、生物合成产物、植物提取物或采用其它方式制备得到。
20.进一步地，所述次大麻二酚(cbdv)、大麻萜酚(cbg)、大麻二酚(cbd)和四氢次大麻酚(thcv)可以分别为各组分的纯净物产品，将其混合即可得到所述药物组合物；所述cbdv、cbg、cbd和thcv也可以同时存在于同一种产品中，例如同时包含所述cbdv、cbg、cbd和thcv的植物提取物，如工业大麻全谱系油。
21.优选的，所述植物提取物的植物提取部位可以为工业大麻的秆芯、花、叶、籽和籽的外壳中的一种或多种，特别是花和/或叶。
22.再一方面，本发明还提供了一种大麻全谱系油在制备治疗帕金森药物中的应用，所述大麻全谱系油中包含cbdv、cbg、cbd和thcv，不含thc。
23.优选地，在本发明的具体示例中，所述大麻全谱系油中cbdv、cbg、cbd和thcv的质量比为9～12：1～5：60～65：1～2。
24.更优选地，所述大麻全谱系油中cbdv、cbg、cbd和thcv的质量比为10-11：1-3：62-65：1.5-2。
25.本发明所述的不含thc是指所述的大麻素类化合物或大麻全谱系油中thc的含量(质量百分比)低于0.3％，优选的，低于0.1％，更优选的，低于0.01％，特别优选的，按照本领域常规方法未检出thc。
26.本发明中所述治疗帕金森指的是治疗和预防包括由帕金森综合征，优选帕金森病的病因触发的症状或其症状的治疗、防止、预防、延缓和减少。在治疗对象包括但不限于(1)针对由α-突触核蛋白引起的毒性的保护，或所述毒性的减少或延缓，和(2)针对由异常谷氨酸积累、氧化性应激、线粒体功能障碍或神经炎症所致的毒性的多巴胺能神经元的保护，或所述毒性的减少或延缓。
27.本发明适用于治疗处于疾病的任何阶段的任何哺乳动物对象，特别是人对象中的帕金森综合征，尤其是用于治疗运动徐缓或运动不能。
28.又一方面，本发明还提供了一种所述大麻全谱系油的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
29.(1)取工业大麻花叶药材进行粉碎，过筛，90～110℃烘烤150～250min，取一定量烘烤后的大麻花叶药材，按料液比1:6～12(w/v)加入65～75％的乙醇，搅拌提取，离心过滤，滤液减压浓缩至无醇味，补加纯化水至溶液重量为药材重量的6～10倍，搅拌均匀，即得上样液；
30.(2)量取上样液，以2～4bv/h的流速经大孔树脂柱纯化，上样毕静置55～65min，再以7～10bv/h的流速依次用纯化水、45～55％乙醇、75～85％乙醇洗脱，确定水洗脱终点后，45～55％乙醇洗脱2.5～3bv，75～85％乙醇洗脱4.5～5.5bv，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至水分低于5％，即得全谱系油粗品；
31.(3)取全谱系油粗品，加入65～75％乙醇搅拌溶解，过滤，所得滤液以1.5～2.5bv/h的流速经色谱填料柱纯化，上样毕，再以1.5～2.5bv/h的流速用65～75％乙醇洗脱4.5～5.5bv，65～75％乙醇洗脱液减压浓缩至水分低于5％，即得大麻全谱系油，所述全谱系油中总大麻素含量达75％以上，其中cbdv 9～12％、cbg 1～5％、cbd 60～65％、thcv 1～2％，thc未检出。
32.本发明提供的大麻素类化合物、药物组合物及大麻全谱系油具有差异显著的(0.01<p<0.05)治疗帕金森的作用，特别是包含本发明优选比例的次大麻二酚(cbdv)、大麻萜酚(cbg)、大麻二酚(cbd)和四氢次大麻酚(thcv)的组合物差异性极显著的优于不含thcv施用时或不按本发明配比施用时的效果，其在治疗帕金森药物制备中具有重要的应用价值，且无毒副作用，可以长期使用。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
35.此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
36.在一些实施例中，当本发明所述的口服剂型为片剂时，药用赋形剂可以是惰性稀释剂或填料(例如，蔗糖，微晶纤维素，淀粉，包括马铃薯淀粉，碳酸钙，氯化钠，磷酸钙，硫酸钙，或磷酸钠)；崩解剂，包括淀粉/淀粉衍生物、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐、藻酸、聚乙烯吡咯烷酮或羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂，例如硬脂酸镁；粘合剂(例如阿拉伯树胶、褐藻酸、褐藻酸钠、明胶、淀粉、预凝胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂，以及抗粘剂(例如硬脂酸、硅酸盐或滑石)。还可以是其他药用赋形剂，例如着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂和湿润剂等。
37.必要时可对片剂进行包衣。包衣可以适于以预定模式释放活性药物物质(例如，为了实现受控释放制剂)或者它可以适于直到通过胃后才释放活性药物物质(肠溶衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如基于羟丙甲纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或肠溶衣(例如邻苯二甲酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙甲纤维素、琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。
38.用于经口使用的制剂也可以作为咀嚼片或作为其中活性成分与惰性固体稀释剂
(例如马铃薯淀粉、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合的硬明胶胶囊，或作为其中活性成分与水活油介质，例如液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊呈现。
39.在本发明的一些实施方式中，用于经口使用的制剂还可以经口施用的液体，适用于通过加入水制备含水混悬剂的粉剂、可分散粉剂或颗粒剂。合适的悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素或/和海藻酸钠等。
40.本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
41.实施例1
42.取工业大麻花叶药材进行粉碎，过1号筛，100℃烘烤200min，取一定量烘烤后的大麻花叶药材，按料液比1:8(w/v)加入70％乙醇，室温搅拌提取两次，每次1小时，过滤，合并提取液，离心过滤，离心过滤液减压浓缩(65℃，-0.08～-0.09mpa)至无醇味，密度为1.070(60℃)，补加纯化水至溶液重量为药材重量的8倍，搅拌均匀即得上样液。
43.量取上样液，以4bv/h的流速经已处理好的大孔树脂柱(径高比为1：5)纯化，上样毕，静置60min，再以9bv/h的流速依次用纯化水、50％乙醇、80％乙醇洗脱，用molish反应确定水洗脱终点，50％乙醇洗脱3bv，80％乙醇洗脱5bv，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩(65℃，-0.08～-0.09mpa)至水分至5％以下，即得全谱系油粗品。
44.取全谱系油粗品，加入70％乙醇搅拌溶解，过滤，所得滤液以2bv/h的流速经已处理好的聚合色谱填料柱unipsn 30(径高比为1：6)纯化，上样毕，再以2bv/h的流速用70％乙醇洗脱5bv，70％乙醇洗脱液减压浓缩(65℃，-0.08～-0.09mpa)至水分至5％以下，即得全谱系油。
45.所得全谱系油中总大麻素含量达78.41％，其中cbdv 10.52％、cbg1.57％、cbd 64.80％、thcv 1.52％，thc未检出。
46.实施例2动物试验
47.1.试验药物的准备，按实施例1的方法制备得到全谱系油，另按9：1：60：1和12：5：65：2的cbdv、cbg、cbd和thcv质量比，准备纯净的大麻素类化合物，分别混合制备成编号为1-3组的试验组。此外，按质量比10.5：1.5：65取cbdv、cbg和cbd混合制成编号为4组的试验组；按质量比10.5：1.5：65：4取cbdv、cbg、cbd和thcv混合制成编号为5组的试验组。
48.2.pd大鼠模型制备：取100只大鼠进入实验，其中10只为假手术组，于内侧前脑束注射生理盐水，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，严格将大鼠头颅水平固定于脑立体定向仪上，确定右侧前脑内侧束(方法参照包新民编著的大鼠脑图谱)：
①
前囟后3.7mm，矢状缝右侧1.7mm，颅骨骨膜下7.8mm，门齿线2.4mm；
②
前囟后4.4mm，矢状缝右侧1.2mm，颅骨骨膜下7.8mm，门齿线2.4mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10μl的微量注射器抽取6-ohda6μl(含0.2％维生素c的生理盐水配置，浓度4μg/μl)，每点注射3μl，留针10min后退针，缝合创面。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡(0.5mg/kg)，平均旋转频率>7次/min为成功pd模型。
49.3.模型制备与行为学测定：将60只成功的pd模型随机分为6大组。
50.第1-5组实验组，分别喂服准备的5组试验药物，均按8.5mg/kg给药，持续4周；第6组为pd对照组，pd模型大鼠处理方式为：腹腔注射左旋多巴甲酯+苄丝肼(50mg/kg左旋多巴甲酯和25mg/kg苄丝肼，溶于含0.2％维生素c的消毒生理盐水中)，2次/天(上午10点和下午6点)，持续4周。
51.在治疗过程中于第8、15、22、29天上午用药后进行大鼠行为学观察和评分。
52.aim评定：aim分成4个组分(上肢aim、口面部aim、轴性aim和旋转aim)进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级(0-4)，即：0无；1：持续时间小于30s；2：持续时间为30s到60s；3：持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4：持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察1min。aim总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上1只大鼠一次用药后各组分aim最大评分为4分，总aim评分为16分。
53.4.统计分析方法，实验数据采用spss 13.0统计软件进行分析。所得计量资料以均数
±
标准差表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，结果如表1所示。
54.表1动物试验结果
55.[0056][0057]
5.结果分析
[0058]
口面部aim评分表明，第1-3组试验组口面部评分相当，第1-3组和第4-6组比较均值差异有统计学意义(p<0.05)。与第4组比较，第2组口面部aim评分较低，差异有统计学意义(p<0.05)；与第5组比较，第2组口面部aim评分较低，差异有统计学意义(p<0.01)。
[0059]
上肢aim评分表明，第1-3组试验组上肢评分相当，第1-3组和第4-6组比较均值差异有统计学意义(p<0.01)。其中第1-3组上肢aim评分低于第4-5组，差异有统计学意义(p<0.01)。
[0060]
轴向aim评分表明，第1-3组试验组轴向评分相当，第1-3组和第4-6组比较均值差异有统计学意义(p<0.01)。第1-3组用药至第22、29天轴向aim值比pd组(第6组)降低，差异有统计学意义(p<0.05)，且第1-3组与第4-5组比较第22、29天差异有统计学意义(p<0.01)，明显降低了轴向aim评分。
[0061]
旋转aim评分表明，根据本发明实施例2-4的cbdv、cbg、cbd和thcv质量比制备的第1-3组试验组旋转评分相当，第1-3组和第4-6组比较均值差异有统计学意义(p<0.01)。第1-3组用药至第22、29天旋转aim评分值比pd组降低，差异有统计学意义(p<0.01)，且第1-3组与第4-5组比较第22、29天差异有统计学意义(p<0.01)，明显降低了旋转aim评分。
[0062]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。