金针菇多糖提取物在制备抗病毒药物中应用及其提取方法与流程

本发明涉及多糖提取物的医药用途，具体地，涉及一种金针菇多糖提取物在制备抗流感病毒药物中的应用及其提取方法。

背景技术：

流行性感冒是由流感病毒(influenzavirus)引起的急性呼吸道疾病，具有传染性强、传播迅速、流行面广等特点，严重威胁人类生命健康并造成巨大的经济威胁。人流感病毒是流感病毒中的一种，分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型，其中甲型流感病毒由于其抗原性最易发生变异而对人类威胁最大。2009年度甲型h1n1流感在世界范围内发生大流行，突出了甲型流感病毒感染的严重性。

接种疫苗是预防和控制流感传播的最有效方法，但流感病毒的主要抗原血凝素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)易发生抗原性转变和抗原性漂移，导致人类对新出现的毒株缺乏免疫力，进而引起流感病毒的暴发流行。所以，通过接种疫苗预防流感有一定的滞后性，预防效果有限。而用于治疗流感病毒的药物主要为金刚烷胺类(例如金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(例如奥司他韦和扎那米韦)，但是，这类药物由于耐药性的出现及其内在的毒副作用而限制临床应用。

因此，从天然产物中提取抗流感病毒的活性成分对于研发新的抗流感病毒药物具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可以抗流感病毒特别是甲型流感h1n1的金针菇多糖提取物及其提取方法和应用。

第一方面，本发明提供金针菇多糖提取物在制备抗病毒药物、食品、或保健品中的应用。

优选的，所述金针菇多糖提取物浓度在200μg/ml～2000μg/ml之间。在该浓度范围内的金针菇多糖提取物具有显著的抗病毒效果而非常微小的毒性作用。

优选的，所述病毒为流感病毒。

进一步优选的，所述病毒为甲型流感病毒，例如包括但不限于甲型h1n1流感病毒。

优选的，所述食品包括特殊医疗用途食品、或功能性食品。

金针菇(flammulinavelutipes)别名冬菇、朴蕈、绒毛柄金钱菌等，属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属，是我国最早实现工厂化栽培的食用菌品种。目前研究发现，金针菇具有保肝、增强免疫调节、调节血糖、抑制肿瘤和抗氧化等作用，但尚未发现金针菇多糖提取物抗病毒研究方面的报道。

发明人通过试验证实，金针菇多糖提取物对于抗流感病毒特别是甲型病毒具有特别明显的效果并且毒性非常微小。

优选的，所述的金针菇多糖提取物采用水提醇沉的方法从金针菇子实体中提取得到。

优选的，所述的金针菇多糖提取物通过：将金针菇子实体粉碎后，用水浸提，提取液过滤后的滤液经浓缩后得到浓缩液，浓缩液再用乙醇沉淀，将沉淀干燥得到金针菇多糖提取物。

在一个优选的实施例中，金针菇多糖提取物提取通过：将金针菇子实体粉碎后，用10-20倍重量的水浸泡，再加热提取，过滤得滤液，重复上述提取步骤1-5次，合并滤液，滤液经浓缩后得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇，使乙醇的体积分数为70-90％，静置，所得沉淀转移至烘盘中，45℃真空烘干，得到金针菇多糖提取物。

第二方面，提供一种抗病毒药物，包括金针菇多糖提取物及药学上可接受的载体。

在上述药物中，金针菇多糖提取物作为活性成分。

优选的，所述金针菇多糖提取物浓度在200μg/ml～2000μg/ml之间。在该浓度范围内的金针菇多糖提取物具有显著的抗病毒效果而非常微小的毒性作用。

优选的，所述病毒为流感病毒。

进一步优选的，所述病毒为甲型流感病毒，例如包括但不限于甲型h1n1流感病毒。

优选的，所述的金针菇多糖提取物采用水提醇沉的方法从金针菇子实体中提取得到。

优选的，所述的金针菇多糖提取物通过：将金针菇子实体粉碎后，用水浸提，提取液过滤后的滤液经浓缩后得到浓缩液，浓缩液再用乙醇沉淀，将沉淀干燥得到金针菇多糖提取物。

在一个优选的实施例中，金针菇多糖提取物提取通过：将金针菇子实体粉碎后，用10-20倍重量的水浸泡，再加热提取，过滤得滤液，重复上述提取步骤1-5次，合并滤液，滤液经浓缩后得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇，使乙醇的体积分数为70-90％，静置，所得沉淀转移至烘盘中，45℃真空烘干，得到金针菇多糖提取物。

第三方面，提供一种抗病毒的食品或保健品，包含金针菇多糖提取物。

优选的，所述金针菇多糖提取物浓度在200μg/ml～2000μg/ml之间。发明人通过试验证实，在该浓度范围内的金针菇多糖提取物具有显著的抗病毒效果而非常微小的毒性作用。

在上述食品或保健中，金针菇多糖提取物作为活性成分。

优选的，所述病毒为流感病毒。

进一步优选的，所述病毒为甲型流感病毒，例如包括但不限于甲型h1n1流感病毒。

优选的，所述食品包括特殊医疗用途食品、或功能性食品。

优选的，所述的金针菇多糖提取物采用水提醇沉的方法从金针菇子实体中提取得到。

优选的，所述的金针菇多糖提取物通过：将金针菇子实体粉碎后，用水浸提，提取液过滤后的滤液经浓缩后得到浓缩液，浓缩液再用乙醇沉淀，将沉淀干燥得到金针菇多糖提取物。

在一个优选的实施例中，金针菇多糖提取物提取通过：将金针菇子实体粉碎后，用10-20倍重量的水浸泡，再加热提取，过滤得滤液，重复上述提取步骤1-5次，合并滤液，滤液经浓缩后得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇，使乙醇的体积分数为70-90％，静置，所得沉淀转移至烘盘中，45℃真空烘干，得到金针菇多糖提取物。

第四方面，提供一种金针菇多糖提取物的提取方法，包括：将金针菇子实体粉碎后，用水浸提，提取液过滤后的滤液经浓缩后得到浓缩液，浓缩液再用乙醇沉淀，将沉淀干燥得到金针菇多糖提取物。

在一个优选的实施例中，金针菇多糖提取物的提取方法，包括：将金针菇子实体粉碎后，用10-20倍重量的水浸泡，再加热提取，过滤得滤液，重复上述提取步骤1-5次，合并滤液，滤液经浓缩后得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇，使乙醇的体积分数为70-90％，静置，所得沉淀转移至烘盘中，43-50℃真空烘干，优选45℃真空烘干，得到金针菇多糖提取物。

本发明金针菇提取物在提取过程中，以环境友好的水、乙醇为溶剂，采用加热提取、干燥等温和手段进行提取纯化，具有工艺简单、生产成本低、避免有机溶剂污染的优点，且该提取方法可以最大限度保留金针菇提取物的活性；提取得到的金针菇多糖提取物可用于制备抗流感病毒药物、特殊医疗用途食品、功能性食品或保健品。

本发明首次提出了金针菇多糖提取物具有明确的抗流感病毒作用，将提取所得的金针菇多糖提取物进行体外抗流感病毒药效研究，结果显示金针菇多糖提取物可显著抑制流感病毒感染所致的细胞病变；将提取所得的金针菇多糖提取物进行动物实验(h1n1病毒感染小鼠实验)，结果证实金针菇多糖提取物能有效缓解h1n1病毒感染引起的呼吸道症状，说明金针菇多糖提取物应用于制备抗流感病毒药物具有良好的前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明金针菇多糖提取物及其提取方法和应用以及有益效果进行详细说明。

图1为金针菇多糖提取物对mdck细胞的细胞毒性结果图。

图2为金针菇多糖提取物对mdck细胞感染流感病毒存活率的影响。

图3为金针菇多糖提取物对感染h1n1病毒小鼠的肺指数比较。

图4为金针菇多糖提取物对感染h1n1病毒小鼠的肺组织外观比较。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

除非特别说明，本发明实施例采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1金针菇多糖提取物的制备

(1)取金针菇子实体，经粉碎机打粉(25000r/min，5s)，使用1号药典检验筛进行筛选，收集滤过物，加到15倍重量水中进行浸泡至完全湿润，加热提取1.5h、过滤，收集滤液；滤渣重新加水10倍，加热提取1h、过滤，收集滤液，合并所得滤液，50℃减压浓缩至约20l，进一步浓缩至百利度60％左右，得到浓缩液；

(2)在步骤(1)所得浓缩液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积分数为85％，静置过夜，取沉淀转移至烘盘中，45℃真空烘干，得到金针菇多糖提取物，得率为12.8％，提取物中多糖含量为10.1％。

实施例2金针菇多糖的细胞毒性研究

将实施例1得到的金针菇多糖提取物用pbs稀释配成3mg/ml的药物母液，4℃储存。

将生长状态良好的mdck细胞(犬肾细胞)用edta-胰酶消化计数，以2×10⁴/100μl/孔接种细胞于96孔板中，37℃、5％co2细胞培养箱培养24小时。待细胞融合度将近90％，将细胞培养液移除，用1×pbs(磷酸盐缓冲溶液)将细胞清洗2遍。将药物母液用含2％胎牛血清的dmem按2倍比连续稀释，药物稀释液浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml。将药液按照100μl/孔加入上述细胞培养板中，空白对照孔和正常细胞对照孔按100μl/孔加入含2％胎牛血清的mem培养基(minimumeagle’smedium)，于37℃、5％co2培养箱中48小时。

48小时后，吸弃含药培养基，pbs润洗1-2遍，加入20μl/孔的5mg/ml的mtt溶液(噻唑蓝)(设置调零组)，于37℃、5％co2培养箱中作用4小时。4小时后，取出培养板，加入150μl/孔的dmso溶液(二甲基亚砜)，待结晶溶解后，在酶标仪上测定各孔吸光度值，检测波长为490nm，按照以下公式计算细胞存活率。

计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(cc50)。

细胞毒性研究结果见图1显示，从图1可以看出，在浓度100μg/ml～2000μg/ml范围内，mdck细胞存活率在94.47％～84.05％之间，这说明，金针菇多糖对mdck细胞的半数有毒浓度cc50＞2000μg/ml，表明本发明的金针菇多糖提取物对mdck细胞的毒性非常小。

实施例3金针菇多糖体外抗流感病毒研究

将生长状态良好的mdck细胞按每孔约2×10⁴密度接种到96孔细胞培养板，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养约24h，细胞融合度将近100％。将细胞培养液移除，用1×pbs将细胞清洗2遍，将不同的药物母液用含2％胎牛血清的dmem按2倍比连续稀释。将实施例1的得到的金针菇多糖提取物用pbs稀释配成药液并按照50μl/孔加入上述细胞培养板中，病毒对照孔和正常细胞对照孔按50μl/孔加入含2％胎牛血清的dmem基础培养基，37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养。同时取25μl的药物溶液与25μl的病毒溶液混匀(含药病毒液)，取25μl的无胎牛血清的mem与25μl的病毒溶液混匀做为药物空白对照。将96孔培养板与(不)含药病毒液一起放入含5％co2、37℃恒温培养箱中孵育2h。2h后，取出96孔培养板，分别吸弃药物溶液，用pbs溶液润洗一次。每孔加入50μl的含药病毒液，摇匀，置5％co2的37℃恒温培养箱中孵育2h。2h后，取出96孔培养板，分别吸弃含药病毒液，用pbs溶液润洗一次，分别加入100μl/孔的药物溶液，含2μg/ml/tpck胰酶,摇匀，置含5％co2的37℃恒温培养箱中孵育48h。

将细胞瓶中成片生长的mdck细胞用edta-胰酶消化计数，以2×10⁴/100μl/孔接种细胞于96孔板中，37℃、5％co2培养箱孵育过夜。全程给药后在37℃、5％co2培养箱孵育48h后，吸弃含药培养基，pbs润洗1-2遍，加入20μl/孔的5mg/ml的mtt溶液(设置调零组)，于37℃、5％co2培养箱中作用4h。4h后，取出培养板，加入150μl/孔的dmso溶液，待结晶溶解后，在酶标仪上测定各孔吸光度值，检测波长为490nm，计算细胞存活率。

实验结果见图2表明，病毒组细胞存活率约为53.72％；加入金针菇多糖提取物干预后，浓度在200μg/ml～2000μg/ml范围之间浓度，细胞存活率均有增加，约在61％～74％之间，与病毒对照组均有显著性差别(p＜0.01)；这说明，浓度在200μg/ml～2000μg/ml范围之间，金针菇多糖提取物对感染h1n1流感病毒的mdck细胞具有明显保护作用。

实施例4金针菇多糖提取物对h1n1流感病毒感染小鼠的保护作用

(1)造模与给药

取balb/c小鼠，适应性饲养3天后，按体重随机分为正常对照组，模型组，利巴韦林组(37.5mg/kg)、金针菇多糖提取物(实施例1制备的金针菇多糖提取物)高(h)、低(l)剂量组(900mg/kg为h组、300mg/kg为l组)，每组6只，各药物组连续灌胃28天，正常组、模型组给予等体积生理盐水。

从倒数第5天开始，在异氟烷轻度麻醉下，除正常组外，其余各组采用2ld50h1n1病毒稀释液滴鼻感染小鼠造模，正常组以等体积的无菌生理盐水滴鼻感染小鼠，0.05ml/只，每组6只。从病毒感染当天起连续观察5天，记录饮食、精神状态、呼吸、毛发变化等情况，每天称量小鼠体重。

(2)取材及检测

感染病毒第5天晚9点开始，禁食不禁水12h。

取6只小鼠，颈椎脱臼处死，剖取肺脏，观察各组小鼠肺部组织形态，称量全肺重量，计算肺指数。

(3)结果

肺指数实验结果见图3，肺部组织形态观察结果见图4。

图3和图4的结果表明，模型组的肺指数明显高于正常组，说明接受h1n1流感病毒pr8株感染后，模型组动物肺部出现明显水肿、充血(/淤血)。与模型组相比，金针菇多糖提取物的两个剂量组均可明显降低受试动物的肺指数，肺组织的水肿、充血(/淤血)症状明显减轻，说明金针菇多糖提取物均可有效缓解由于h1n1流感病毒pr8株感染引起的呼吸道症状。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。