本发明涉及一种降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的中药复方制剂；此外，本发明还涉及该中药复方制剂的制备方法和医药用途。
背景技术：
：系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus，sle）是一种有多种自身抗体的形成、可累及全身多脏器的弥漫性结缔组织病，为自身免疫介导，并以免疫炎症为突出表现。狼疮性肾炎（lupusnephritis，ln）是sle患者最常见的临床表现及最严重的并发症之一，甚者可以导致死亡。流行病学调查显示其好发于15-45岁的女性（女：男=7-9：1），我国的患病率为70/10万人，而妇女中高达113/10万人。约50-70%的sle患者在疾病过程中会出现明显的肾脏损害表现，如蛋白尿、血尿、管型尿、甚至肾衰竭，并且经活检显示几乎所有sle患者均有肾脏病理学改变，其中20%左右的患者会在5年内发展为终末期肾病。由于ln的发病机制复杂、病情严重且需要长期治疗，故而针对ln制定最佳的治疗方案对改善患者生存质量有重要意义。目前，ln临床特征性病理变化之一是持续性蛋白尿，并且蛋白尿的排泄率与疾病的严重度呈正相关。现代医学对ln的诊断定义为：有临床表现或试验室检查发现持续性蛋白尿≥0.5g/d或（和）尿蛋白3+或（和）出现细胞管型，包括红细胞管型、血红蛋白管型、颗粒管型、管状或混合型；并将肾穿活检作为诊断的“金标准”。一般来讲，ln的治疗原则包括免疫抑制治疗和针对并发症的治疗，其治疗的最终目的是长期保护肾脏功能，防止ln的进展及复发，提高患者的生存率，改善生存质量。临床通常以糖皮质激素（glucocorticoid，gc）为基础用药，联合免疫抑制剂、抗疟药或者生物制剂等，严重时（终末期肾病）将采用血液净化、免疫吸附、肾脏替代治疗等。但长期的使用gc会导致高血压、高血糖、骨质疏松、肥胖等（库欣综合征），免疫抑制剂的生殖毒性、诱发感染，抗疟药致视网膜病变等均有众多副作用及不良反应；晚期的血液净化、免疫吸附、肾脏替代治疗价格昂贵，且患者的生存质量无法保证，更给整个家庭造成巨大负担。中医学中可将sle归为“蝴蝶斑”、“阴阳毒”、“日晒疮”等范畴，由sle引起的肾脏损害则属于“尿浊”、“水肿”、“肾痹”、“癃闭”、“关格”等。目前中医对狼疮性肾炎发病机制的认识虽各有不同，但基本都可总结为本虚标实：本虚盖因本病病程长、变化多，致使肾阴不足、精血亏损；标实则为热、瘀、痰、毒等外邪侵袭人体。ln治疗中医采用的治法为养阴清热，利湿化瘀。急性期以热毒壅盛、热毒夹瘀为主，缓解期以阴虚或气阴两虚常见，血脉瘀阻贯穿始终。热毒壅盛证选用犀角地黄汤合化斑汤加减，肝肾阴虚证选用六味二至饮，气阴两虚证选用黄芪生脉二至饮，脾肾气虚证选用防己黄芪汤合五皮饮。目前中医治疗主要以全身脏器功能调节为主，针对降低蛋白尿排泄率这一关键病理环节的中药复方，其长期改善率还有待于进一步提高。技术实现要素：针对现有中药降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的上述不足，根据本发明的实施例，希望提供一种具有降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的药理作用，其降低ln蛋白尿排泄率可以较为持久，长期服用所可能产生的副作用较应用西医免疫抑制剂显著为低，并提供其制备方法。根据实施例，本发明提供的一种降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的中药复方制剂，其创新点在于，由下列重量份的原料药制成：生地黄10-30份，生石膏15-45份，黄芩10-30份，金雀根15-45份，接骨木10-45份，山豆根3-9份，秦皮10-30份，甘草3-12份。根据一个实施例，本发明前述降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的中药复方制剂中，原料药的重量份分别为：生地黄15份，生石膏15份，黄芩12份，金雀根15份，接骨木15份，山豆根6份，秦皮15份，甘草3份。根据一个实施例，本发明前述降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的中药复方制剂中，原料药的重量份分别为：生地黄30份，生石膏30份，黄芩30份，金雀根15份，接骨木30份，山豆根6份，秦皮30份，甘草6份。根据一个实施例，本发明前述降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的中药复方制剂中，原料药的重量份分别为：生地黄18份，生石膏18份，黄芩15份，金雀根12份，接骨木24份，山豆根9份，秦皮30份，甘草15份。本发明融合中医古籍及现代研究结果，总结临床经验，创新性提出中医理论：ln的病因病机为血络瘀滞，经脉痹阻，卫气内伐，真阴不足，肾阴亏损，本虚标实。其中“卫气内伐”的观念取自《内经》，与西医抗体损伤自身的观点是可以呼应的。在治疗上以养阴清热、凉血化瘀，注重“调节”卫气，而非“增强”卫气。依据该理论，以生地为君药，其功效为养阴生津、凉血清热。生地中含有梓醇、地黄多糖、甘露醇、β-谷甾醇、地黄素、多种氨基酸等多组分，具有类似激素的作用。同时，生地具有扩张血管，抗血管内皮炎症的作用。生石膏为臣药，与生地配伍，可增强生地黄疗效。其主要成分为二水硫酸钙及锌、铜、铁等丰富的微量元素，能调整t淋巴细胞的平衡，并具备退热作用。黄芩主要成分包括黄酮类化合物（黄芩素、黄芩甙等）、β-谷甾醇、苯甲酸、葡萄糖醛酸和多种微量元素，能显著抑制肥大细胞释放组胺，并能明显抑制大鼠腹腔巨噬细胞pge2合成增加，影响花生四烯酸代谢，从而减少炎性介质释放。金雀根、接骨木均有益气活血之功效。金雀根可抑制小鼠t淋巴细胞增殖，对于抑制抗体、治疗蛋白尿很有效果。接骨木能抑制炎症早期毛细血管通透性亢进、渗出与水肿，对渗出性炎症有较强的疗效。山豆根临床应用发现治疗顽固的ln蛋白尿以及肾功能不全，降低肌酐、尿素，效果非常好。秦皮具有抗菌抗病毒、消炎镇痛等作用。研究表明，秦皮甲素和秦皮苷均具有利尿作用，甘草起到调和诸药药性的作用。根据实施例，本发明前述降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的中药复方制剂的制备方法，包括如下步骤：（1）将八味原料药称重后投入非金属容器内，加入1-3倍量的纯净水，搅拌均匀，加热至沸腾，煮沸后保持沸腾一段时间，分离煎出液和药渣；（2）将（1）的药渣再次加入1-3倍量的纯净水，加热至沸腾，煮沸后保持沸腾一段时间，分离煎出液和药渣；（3）本发明随后的试验例将证明：两种种系相同不同品种的50只小鼠随机分5组：正常组c57bl/6j小鼠（0.9%生理盐水）；mrl/1pr小鼠根据尿蛋白含量随机分为4组：模型组（0.9%生理盐水）；中药组（益肾养阴合剂）；中药联合激素组（益肾养阴合剂+醋酸泼尼松）；激素组（醋酸泼尼松），每组10只，连续给药四周后用bca蛋白浓度测定试剂盒测尿蛋白含量，比色法测定血肌酐、尿素氮。结果模型组mrl/lpr小鼠尿蛋白含量均有明显升高（p<0.05），差异有显著性意义。中药组第1、2周尿蛋白无明显变化（p>0.05），第3、4周时尿蛋白明显降低（p<0.05）。中药联合激素组、激素组，第2、3、4周尿蛋白逐渐降低（p<0.05）。在给药第一周，与模型组相比，尿蛋白含量在各治疗组之间无明显差异（p>0.05）。在第2、3、4周时，与模型组相比，各治疗组的尿蛋白含量均有显著下降（p<0.05），中药联合激素组的尿蛋白含量最低（p<0.05）。血肌酐、尿素氮各治疗组均有显著下降（p<0.05)，中药联合激素组下降最明显（p<0.05）。在随后的急性毒性试验中小鼠的最大灌胃体积量相当于临床成人（体重按70kg计）拟用量的105.28倍。通过小鼠观察小鼠体重、肝肾功等，各组比较无统计学意义（p>0.05）。结果：本次发明中药组方（暂名沈氏清肾合剂）具有显著降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的药理作用，为该方的临床应用提供了一定的理论基础。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。实施例1称取生地黄150g，生石膏150g，黄芩120g，金雀根150g，接骨木150g，山豆根60g，秦皮150g，甘草30g。将此八味中药纳入非金属容器内，加入常温纯净水5000ml，搅拌均匀后浸泡15分钟，后加热至沸腾，煮沸后保持沸腾5分钟，后分离煎出液1500ml。再次加入常温纯净水3000ml，加热至沸腾，煮沸后保持沸腾3分钟，分离煎出液1500ml。混合两次煎出液，将煎出液浓缩至80℃的相对密度为1.07，留待备服。实施例2称取生地黄300g，生石膏300g，黄芩300g，金雀根150g，接骨木300g，山豆根60g，秦皮300g，甘草60g。将此八味中药纳入非金属容器内，加入常温纯净水500ml，搅拌均匀后浸泡15分钟，后加热至沸腾，煮沸后保持沸腾5分钟，后分离煎出液150ml。再次加入常温纯净水300ml，加热至沸腾，煮沸后保持沸腾3分钟，分离煎出液150ml。混合两次煎出液，将煎出液浓缩至80℃的相对密度为1.04，留待备服。实施例3称取生地黄180g，生石膏180g，黄芩150g，金雀根120g，接骨木240g，山豆根90g，秦皮30g，甘草15g。将此八味中药纳入非金属容器内，加入常温纯净水4410ml，搅拌均匀后浸泡15分钟，后加热至沸腾，煮沸后保持沸腾5分钟，后分离煎出液1500ml。再次加入常温纯净水3000ml，加热至沸腾，煮沸后保持沸腾3分钟，分离煎出液1500ml。混合两次煎出液，将煎出液浓缩至80℃的相对密度为1.10，留待备服。试验例采用动物实验方式证明本次申请中药复方组分（暂名：沈氏清肾合剂）对通过基因敲除等手段获得的狼疮性小鼠肾炎蛋白尿的排泄率有显著降低作用1材料1.1实验动物c57bl/6j背景小鼠，6-8周龄，雄性，spf级。mrl/lpr小鼠，6-8周龄，雄性，spf级。2种小鼠购自上海邦耀生物科技有限公司，合格证号：buph(沪）：2015-0002。动物饲养在上海中医药大学附属市中医临床医学院实验动物中心（spf级），温度22±1℃，湿度55±5%，12小时光暗循环。动物所使用的笼具、垫料、饲料和饮水水均予消毒处理，让其自由摄食、饮水，饲养1周后进行实验，动物实验所有操作均按照实验动物伦理学要求进行。1.2实验药物沈氏清肾合剂（生地黄30g，生石膏30g，黄芩30g，金雀根15g，接骨木30g，山豆根6g，秦皮30g，甘草6g）共178g。中药由上海中医药大学附属市中医医院煎药房统一煎煮，中药煎煮加800ml水，煎煮得到200ml中药汤剂,离心取上清液，4℃冰箱保存。按照成人与小鼠体重系数等比换算，换算系数为9.1，成年人按70kg给药,小鼠每次给药为0.5ml/20g（相当于生药量0.89g/ml）。醋酸泼尼松片（上海信谊药厂有限公司批号:国药准字h3102077），5mg/片。激素按上述换算，成人激素量为5mg/天，则小鼠激素用量为0.013mg/20g,用激素量加蒸馏水制备0.5ml/20g悬液。2动物分组及用药2.1动物分组c57bl/6j背景小鼠，7-9周龄，10只，雄性，为正常组,体重22±3g。mrl/lpr小鼠，7-9周龄，雄性，测量体重和尿蛋白以选取实验组小鼠：体重29±3g，尿蛋白110±5mg/ml。共选取40只，随机分为4组，分别为:模型组（给予0.9%生理盐水）；中药组（沈氏清肾合剂）；中药联合激素组（沈氏清肾合剂+醋酸泼尼松）；激素组（醋酸泼尼松）。每组10只动物。2.2动物给药正常组、模型组给予等体积0.9%生理盐水0.5ml/20g；中药组0.5ml/20g沈氏清肾合剂灌胃；中药联合激素组用中药混合激素配成0.5ml/20g混悬液灌胃；激素组醋酸泼尼松片悬液0.5ml/20g灌胃。每日早9点予以灌胃一次，连续用药4周，并分别在给药后的第1周末（第7天），第2周末（第14天），第3周末（第21天），第4周末（第28天），取尿液一次用于检测尿蛋白含量。3观察内容3.1尿蛋白用bca蛋白测定盒检测尿蛋白含量，将所有的标本尿液用双蒸水稀释10倍。3.1.1取蛋白标准配制液(0.8ml)加入蛋白标准(20mgbsa)中，充分溶解后配制成蛋白标准溶液(25mg/ml).3.1.2取适量蛋白标准溶液，稀释至浓度为0.5mg/ml蛋白标准。3.1.3根据样品数量，bca试剂a与bca试剂b按50:1配制适量bca工作液，充分混匀。3.1.4将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中并加入适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。3.1.5各孔加入200μlbca工作液，37℃孵育30min。3.1.6放入酶标仪（波长562nm）测定。根据标准品计算样品的蛋白。3.2血清血肌酐、尿素氮采用比色法3.2.1血清肌酐3.2.1.1取血清200μl加入乌酸蛋白沉淀剂2ml离心机离心3500转/分，离心10min，取上清。3.2.1.2标空白管、标准管、样本测定管，各测定管中加入1.6ml血清蛋白滤液，标准管加入1.6ml50μmlo/l肌酐标准品，空白管加入双蒸水1.6ml。3.2.1.3各管分别加入0.5ml苦味酸溶液，0.5ml0.75mol/l氢氧化钠溶液，充分混匀，37℃水浴10min,取出后流水冷却，紫外分光光度计（波长510nm，1cm光经）测各管od值。3.2.2尿素氮测定3.2.2.1尿液用生理盐水作1:50稀释3.2.2.2标备空白管、标准管、测定管。在空白管中加入0.02ml的蒸馏水，在标准管中加入0.02ml10mmol/lbun标准应用液；各测定管加入相应的待测样本0.02ml。3.2.2.3空白管、标准管、各测定管加入0.25ml的缓冲酶液（将酶贮备液和酶稀释液按3:1000配成），37℃水浴10min。3.2.2.4各管分别加入1ml酚显色剂，1ml碱性次氯酸钠，充分混匀后37℃水浴10min,紫外分光光度计测各管od值4急性毒理实验4.1实验动物实验动物c57bl/6j小鼠6～8周，20只雄性、雌性各半，体重20～22g。由上海邦耀生物科技有限公司提供，合格证号：buph(沪）;2015-0002。饲养在上海中医药大学附属市中医临床医学院动物室清洁级隔离饲养间，温度22±1℃，湿度55±5%，12小时光暗循环。给予饲料和水均予消毒处理，让其自由摄食、饮水，饲养4周后使用，动物实验所有操作均按照实验动物伦理学要求进行。4.2药物制备沈氏清肾合剂（生地黄30g，生石膏30g，黄芩30g，金雀根15g，接骨木30g，山豆根6g，秦皮30g，甘草6g）共178g,用熬出药液后经过离心、浓缩后为52.8g浸膏（不含辅料，4.36生药g/g浸膏）。用蒸馏水配制成供小鼠灌胃最大浓度为2.3g/ml的悬浮液。以本品可供灌胃的最大浓度，小鼠灌胃可承受的最大容量（0.8ml/20g体重）灌胃给药。4.3动物分组20只c57bl/6j小鼠随即分为两组（每组10只，雌雄各半）：蒸馏水对照组、中药组。4.4观察内容给药前和给药后的第2、4、6、8、10、12、14天，分别测量小鼠体重，每天观察有无死亡及其活动、毛色、排泄分泌物情况；于14d后随机解剖小鼠6只，沈氏清肾合剂组4只(雌雄各半)，对照组2只(雌雄各半)，观察其主要器官有无异常。4.5尿素氮、肌酐测定：方法同3.24.6谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定4.6.1取适量的肝组织，并称体重，按重量（g）:体积（ml）=1:9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下用组织破碎仪机械匀浆经离心机离心10分钟（2500转/分），取上清液待测。4.6.2取出在4℃冰箱保存的谷丙转氨酶（alt/gpt）及谷草转氨酶（ast/got）试剂盒，将谷丙转氨酶和谷草转氨酶基质液行37℃预温后各自在相对应的孔板中加20ul到测定孔和对照孔。4.6.3各测定孔中加入待测样本5μl。测定孔每吸收一个样本，将吸嘴伸入孔板底部基质液中反复吸打均匀。4.6.4将谷草转氨酶和谷丙转氨酶孔板放入37℃水浴30分钟后，各孔板中的测定孔、对照孔加入2,4-二硝基苯肼液20μl。4.6.5各对照孔加入5μl的待测样本。测定孔每吸收一个样本，将吸嘴伸入孔板底部基质液中反复吸打均匀。4.6.6将谷草转氨酶和谷丙转氨酶孔板放入37℃水浴20分钟后，各孔加入0.4mol/l氢氧化钠液（4mol/l氢氧化钠液：双蒸水=1:9的比例稀释）200ul。4.6.7将谷草转氨酶和谷丙转氨酶孔板轻轻水平摇动混匀，室温放置15min,用酶标仪（波长510nm）测各孔od值。4.6.8以绝对od值=测定孔od值减去对照孔od值，查标准曲线，求相应的alt/gpt、ast/got活力单位。5统计学分析方法采用spss19.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，或单因素方差分析，数据统计均以x±s表示，以p＜0.05为差异有统计学意义。6结果6.1尿蛋白（见表1）表1注：各时间点各组比较f值=175.053，p=0.000，p<0.05，多组间可以进行两两比较。同一时间段不同组之间比较：△表示与正常组相比p<0.05；▽表示与模型组相比p<0.05；*表示与中药组相比p<0.05；□表示与中药联合激素组相比p<0.05；●表示与激素组相比p<0.056.2血清肌酐尿素氮（见表2）表2组别肌酐（scr）尿素氮（bun）正常组0.39±0.01▽★□●0.08±0.01▽★□●模型组0.85±0.02△★□●0.56±0.04△★□●中药组0.59±0.02△▽□0.32±0.05△▽□●中药联合激素组0.51±0.02△▽★●0.20±0.04△▽★●激素组0.65±0.05△▽□0.45±0.04△▽□★f值269.5398.543p＜0.05＜0.05注：△表示与正常组相比p<0.05；▽表示与模型组相比p<0.05；*表示与中药组相比p<0.05；□表示与中药联合激素组相比p<0.05；●表示与激素组相比p<0.056.3急性毒理实验结果6.3.1大体观察沈氏清肾合剂对小鼠灌胃14天后动物一般情况好，活动可，未见明显异常反应。14天取血后处死小鼠，肉眼观察肝、肾、心等脏器的形态、色泽、大小等未发现明显异常。中药组的肝肾功能与对照组比较无差异（p＞0.05）。（见表3）表3注：经配对t检验，p>0.05，中药组与对照组比较无差异6.3.2肝肾功能（见表4）表4组别谷丙转氨酶（alt）谷草转氨酶（ast）肌酐（scr）尿素氮（bun）对照组0.4611±0.04150.3653±0.03390.3749±0.04870.0653±0.0187中药组0.4985±0.01180.3925±0.08090.4098±0.07880.0621±0.0234p值0.1830.4980.3240.315注：经配对t检验，p>0.05，中药组与对照组比较无差异7实验结论“沈氏清肾合剂”具有降低狼疮性肾炎蛋白尿排泄率的药理作用，本发明为其临床应用提供了一定的理论基础。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明。当前第1页12