一种含粘膜微粒的肠溶、结肠溶胶囊及其制备方法

1.本发明涉及医药领域一种含粘膜微粒的肠溶、结肠溶胶囊及其制备方法。具体的说是一种采用离子交联法制备盐酸二甲双胍粘膜微粒的肠溶、结肠溶胶囊及其制备方法。
技术背景
2.壳聚糖(chitosan，cs)是唯一天然阳离子型活性多糖，其生物相容性良好，无抗原性，无毒副作用，具备生物可降解性能，可包封带负电荷的药物，在药物载体材料领域具有广阔的应用前景。
3.本实验拟采用离子交联法制备盐酸二甲双胍粘膜微粒。该法反应条件温和，操作简单，不使用有机溶剂，无毒副作用。原理是利用壳聚糖上的胺基质子化后带有正电荷，壳聚糖分子链呈线性舒展状态，能与带负电荷的三聚磷酸钠产生离子交联(静电作用)，且同时将盐酸二甲双胍络合其中，形成盐酸二甲双胍粘膜微粒。
4.盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride，mh)是双胍类降糖药物，用于改善ii型糖尿病(dm)中胰岛素水平循环的一线治疗。目前盐酸二甲双胍市售制剂主要分为普通片，普通肠溶片和肠溶胶囊及缓释片，片剂普遍存在血药浓度波动大、半衰期短，不良反应严重，患者顺应性差等缺点；肠溶胶囊避免了血药浓度过高对胃部引起的刺激，但药物半衰期仍未延长，且胶囊相对于片剂更利于患者吞咽，顺应性更佳；缓释片有效地延长了盐酸二甲双胍的半衰期，但制剂工艺相对复杂。盐酸二甲双胍在生物药剂学分类系统中属于iii类药物，该类药物具有高水溶性，低渗透性的特性，其渗透性是吸收的主要限速过程，盐酸二甲双胍除半衰期短影响其生物利用度外，其药物原型30％左右随粪便排出也影响其利用度，因此需要增加该类药物的跨膜转运和增加其在肠道滞留时间来提高其生物利用度。本研究制备盐酸二甲双胍粘膜微粒给药系统，通过延长其在肠道滞留时间，减少药物因肠道排空而造成的损失。
5.胃肠道生物粘附给药系统指利用黏膜材料与胃肠黏膜黏液层的生物黏附，延长药物制剂在胃肠道的滞留时间，提高了药物的生物利用度。粘膜微粒属gbdds中的一种，其不仅能延长药物在胃肠道的滞留时间，还能增加药物与吸收膜的接触，避免细胞膜流动性的影响，从而增加药物对小肠上皮细胞的穿透力。近期国内外已研究的盐酸二甲双胍黏膜吸附性胃滞留片/微粒延长药物的滞留时间，显著提高了盐酸二甲双胍的生物利用度，但它具有对胃粘膜产生明显的刺激作用的缺点。
6.壳聚糖是唯一的天然阳离子型活性多糖，由于其生物降解性、生物相容性以及低制造和处置成本，可包封带负电荷的药物，在药物载体材料领域具有广阔的应用前景。壳聚糖除了能与带负电荷高分子物质复合外，还能与一些特别的阴离子物质发生凝胶反应，这是由于聚阴离子的作用下分子内外交联的结果。一般采用三聚磷酸钠作为离子交联剂，对壳聚糖进行离子诱导凝胶化，壳聚糖含有大量的阳离子，当它和多聚阴离子化合物相遇时，有可能在多聚阴离子的介导下发生分子内或分子间交联，并进一步凝胶化而形成纳米大小的颗粒。由于盐酸二甲双胍本身带有负电荷，可将其与壳聚糖及三聚磷酸钠通过静电作用
络合形成纳米大小的非共价聚合物，即盐酸二甲双胍纳米粒，该聚合物具备一定的粘附作用，可避免一般缓控释制剂受胃肠道转运时间的限制。
三、

技术实现要素：

7.本发明目的是提供一种提高盐酸二甲双胍药物体内滞留和生物利用度的盐酸二甲双胍纳米粒的制备方法，通过壳聚糖纳米粒的粘附性增加药物体内滞留从而提高生物利用度。
8.本发明的目的通过以下操作实现
9.盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒的制备，其特征在于，制备步骤如下：
10.步骤1，将壳聚糖溶解的冰醋酸溶液中，充分搅拌溶解得到壳聚糖醋酸溶液；
11.优选的壳聚糖的分子量为22kda，溶解壳聚糖的冰醋酸溶液的体积浓度为0.5-2.5％，壳聚糖溶液浓度为0.5-2.5mg/ml。
12.进一步优选壳聚糖的分子量为22kda，溶解壳聚糖的冰醋酸溶液的体积浓度为2％，壳聚糖溶液浓度为1mg/ml。
13.步骤2，加入盐酸二甲双胍原料药，搅拌溶解后调节至ph至酸性。
14.优选的投药后盐酸二甲双胍浓度为1-8mg/ml，投药后调节的ph＝3.5-5.5。
15.进一步优选投药后盐酸二甲双胍浓度为2mg/ml，投药后调节的ph＝4.2。
16.步骤3，按相应比例用注射器缓慢向盐酸壳聚糖溶液中滴入交联剂三聚磷酸钠溶液，边滴加边搅拌，搅拌交联后，得到盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒溶液，纯化冷冻干燥后即可得到纳米粒。
17.优选的，三聚磷酸钠溶液的浓度为1mg/ml，壳聚糖与三聚磷酸钠的摩尔比为8-3∶1，搅拌速度为200-600r/min，搅拌时间为10-60min。
18.进一步优选，三聚磷酸钠溶液的浓度为1mg/ml，壳聚糖与三聚磷酸钠的摩尔比为5∶1，搅拌速度为450r/min，搅拌时间为40min。
19.所制备得到的盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒溶液在冻干前呈现出淡蓝色乳光。
20.本发明的有益效果在于：本发明提供的盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒，制备方法简单，包封率、载药量高，包载在壳聚糖载体中的药物可凭借壳聚糖的生物粘附性增加体内滞留含量，提高药物的而生物利用度。
21.一种含粘膜微粒的肠溶、结肠溶胶囊及其制备方法，其特征在于：将制得的粘膜微粒填充于肠溶、结肠溶胶囊中。
22.载药粘膜微粒制备过程如下：
23.(1)将壳聚糖加入到冰醋酸溶液中，充分搅拌溶解得到壳聚糖溶液。
24.(2)加入原料药，搅拌溶解后调节至ph至酸性。
25.(3)按相应比例用注射器缓慢滴入交联剂三聚磷酸钠溶液，边滴加边搅拌，搅拌交联后，得到药物壳聚糖粘膜微粒溶液，纯化冷冻干燥后即可得到纳米粒。
26.其中：反应步骤(1)中壳聚糖的分子量为22kda，壳聚糖溶液浓度为0.5-2.5mg/ml，优选壳聚糖溶液浓度为1mg/ml。溶解壳聚糖的冰醋酸溶液的体积浓度为0.5-2.5％，优选冰醋酸溶液的体积浓度为2％；
27.其特征在于：反应步骤(2)所述的原料药包括盐酸二甲双胍、盐酸青藤碱，三七总
皂苷等，优选盐酸二甲双胍。
28.反应步骤(2)中，投药后盐酸二甲双胍浓度为1-8mg/ml，优选投药后盐酸二甲双胍浓度为2 mg/ml；投药后调节的ph＝3.5-5.5，优选投药后调节的ph＝4.2。
29.反应步骤(3)中，三聚磷酸钠溶液的浓度为1mg/ml，壳聚糖与三聚磷酸钠的摩尔比为8-3∶1，优选壳聚糖与三聚磷酸钠的摩尔比为5∶1，
30.反应步骤(3)中，搅拌速度为200-600r/min，搅拌时间为10-60min。优选搅拌速度为450r/min，搅拌时间为40min。
31.所述的原料药包括盐酸二甲双胍、盐酸青藤碱等药物粘膜微粒填充肠溶胶囊中、三七总皂苷等药物粘膜微粒填充结肠溶胶囊中制成。
32.粘膜微粒的纯化及冷冻干燥：减取适宜长度透析袋进行置于双蒸水中进行煮沸10min，活化后将透析袋一头结扎，检查无漏液情况后倒入需纯化的纳米粒混悬液，另一头用夹子加紧，确定不漏液后置于大烧杯中，倒入适宜双蒸水，在磁力搅拌器上低速搅拌，每2h更换一次双蒸水，纯化12h后收集所有纳米粒混悬液，置于-20℃下冷冻6h，再将其冷冻干燥48h。
33.粘膜微粒的表征
34.形态学、显微观察
35.实验制备所得的空白壳聚糖纳米混悬液与载药粘膜微粒混悬液均是微泛蓝光，均一体系。
36.用一次性注射器取适量粘膜微粒混悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片后排除气泡，吸去周围多余的液体后将盖玻片置于倒置荧光显微镜上观察纳米粒的表观形态，图1可知，最优处方制备所得粘膜微粒外观接近球形，且粒径分布均一。
37.粒径分布
38.取最优处方制备盐酸二甲双胍粘膜微粒，用纳米粒径电位分析仪测定其平均粒径、粒径分布和zeta电位。如图2所示，平均粒径为171.3nm，pdi为0.224，zeta电位25mv，说明mh-cs微粒的粒径较小且分布均匀，有较好的物理稳定性。
39.dsc
40.取一干净空铝坩埚，置于天平上称重，校零，精确称取各样品6mg于坩埚内，加上坩埚盖，并在坩埚盖上扎一小孔。如图3所示，纯壳聚糖在所选温度下几乎无放热峰出现，而空白壳聚糖纳米粒中出现两个尖锐的熔融放热峰，表明壳聚糖与三聚磷酸钠之间成功交联且产生了两种新的化学键，载药粘膜微粒也有这两种峰出现，这种熔融峰在药物与壳聚糖及交联剂的物理混合物中未见；且其中出现了与纯盐酸二甲双胍相同的熔融峰，这种熔融峰在药物与壳聚糖及交联剂的物理混合物中亦可见，表明药物被成功载入壳聚糖纳米粒中，且没有与其发生化学反应，是通过静电相互作用等物理结合。
41.傅里叶红外
42.为判断壳聚糖与交联剂及药物之间的相互作用，分别将2mg纯药物、壳聚糖、交联剂及药物的物理共混物mh-cs纳米粒与100mg kbr混合，通过压片法制成薄片，然后用傅立叶变换红外光谱仪对样品进行分析，扫描范围为400-4000cm-1
，结果所示，壳聚糖在 3355.31cm-1
、1590.46cm-1
处的特征峰吸收分别n-h伸缩振动双峰与氨基弯曲振动，此归为壳聚糖中的氨基的特征峰，1376.03cm-1
处为乙酰氨基上的-ch3对称变形振动， 1026.65～
596.24cm-1
之间的重叠峰为壳聚糖中多糖结构的特征结构。与三聚磷酸钠交联后，空白的粘膜微粒中出现了3401.10cm-1
、1636.63cm-1
、1547.18cm-1
、1407.13cm-1
等新的吸收峰，其中氨基中双峰吸收变强，且tpp中在3000cm-1
附近的磷酸基团特征吸收峰在空白粘膜微粒中未出现，表明壳聚糖与磷酸基团通过静电力等作用产生了新的官能团；在载药粘膜微粒中，氨基双峰变单峰，应是盐酸二甲双胍干扰所致，933.92cm-1
、895.33cm-1
、650.70cm-1
归属为盐酸二甲双胍中n-h弯曲振动所致。故，盐酸二甲双胍被成功载入空白壳聚糖纳米粒 (即空白粘膜微粒)中。
43.粘附性实验
44.按上述制备方法，将药物替换成荧光素制备成荧光粘膜微粒。通过倒置荧光显微镜观察荧光粘膜微粒对大鼠小肠的粘附情况。取正常sd大鼠麻醉处死，取出新鮮的小肠，用生理盐水冲洗掉内容物，然后切成5x1cm的肠段。将各肠段固定在半月牙管道上，与水平面成45
°
，37℃预热的100ml ph 6.8的pbs孵育平衡5min。分别称取约10mg的荧光素纳米粒干粉，在肠段粘膜上均匀铺开，其中一段小肠用50ml ph 6.8的pbs持续冲洗，保持流速在8ml/h，另一段小肠置于ph 6.8的pbs中温育相同时间。两段小肠粘液层和粘附的粒子分别在实验后2 h从肠段上被刮下，涡旋2min后，分别滴取适量两段小肠粘液于载玻片上，在倒置荧光显微镜下观察荧光粘膜微粒数量与分布。经过pbs溶液持续冲洗的小肠上所具有的荧光粘膜微粒数量与未冲洗的相比，没有明显减少，且微粒分散更均匀。表明实验所制备得的粘膜微粒在小肠上具有一定的粘附性能。
45.盐酸二甲双胍粘膜微粒肠溶胶囊的制备及释放
46.按照盐酸二甲双胍市售肠溶胶囊规格，将所制备的干燥盐酸二甲双胍粘膜微粒装入普通肠溶胶囊壳，将囊帽与囊体套合后进行体外释放。
47.依照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0931溶出度与释放度测定方法第一法，先以900ml 0.1mol/l的盐酸溶液为释放介质，转速100r/min，温度37.0
±
1.0℃，盐酸二甲双胍肠溶渗透泵胶囊，盐酸二甲双胍壳聚糖粘膜微粒肠溶胶囊先在胃液释放两小时后，再以ph 6.8磷酸缓冲液为释放介质，分别在5min、30min、1h、3h、4h、6h、8h、10h、12h处取样，取样5ml(补充同温同体积的释放介质)；上述样品均在233nm处进样检测，代入标准曲线，计算累积释放度，绘制体外释放曲线。
48.结果显示，盐酸二甲双胍粘膜微粒肠溶胶囊在胃液中基本不释放，表明所选用肠溶胶囊壳质量符合要求；进入肠液后，在2-4h，药物快速释放，在胶囊壳被溶蚀后，粘膜微粒被暴露于介质中，此时位于粘膜微粒表面的盐酸二甲双胍快速溶于介质，且外边面的粘膜微粒开始释药，因此此时间段药物属于突释；在4h过后，释药速率减慢，由于粘膜微粒在灌装过程中被填充压实，而当外层粘膜微粒开始释放的同时，外层也相当于一个凝胶层，阻挡了水进入内层的速度，此后释药是一个慢慢溶蚀过程，因此释药速度会减慢。整个过程既保证了药物进入体内后会立即提供一个有效药效，也会维持后期药物浓度。
49.相对生物利用度
50.以市售普通肠溶胶囊、原研盐酸二甲双胍缓释片、盐酸二甲双胍微孔渗透泵片的auc0→
t
为参比对照，利用以下公式分别计算自制盐酸二甲双胍肠溶渗透泵胶囊和盐酸二甲双胍粘膜微粒的肠溶胶囊的相应相对生物利用度
76.。
51.相对生物利用度：f＝auc(自制制剂)/auc(参比制剂)
×
100％
52.表1自制盐酸二甲双胍肠溶渗透泵胶囊与自制粘膜微粒肠溶胶囊的相对生物利用度
[0053][0054][0055]
自制盐酸二甲双胍肠溶渗透泵胶囊和盐酸二甲双胍粘膜微粒的肠溶胶囊分别与市售普通肠溶胶囊、原研缓释片和市售微孔渗透泵片的相对生物利用度如表1所示。
[0056]
自制盐酸二甲双胍粘膜微粒肠溶胶囊与与市售普通肠溶胶囊相比，其相对生物利用度为 185.28％，与市售微孔渗透泵片相比，其相对生物利用度为126.19％，与原研缓释片相比，其相对生物利用度为105.83％。表明与普通肠溶胶囊相比，自制盐酸二甲双胍肠溶渗透泵胶囊与自制盐酸二甲双胍粘膜微粒肠溶胶囊均明显提高了盐酸二甲双胍的生物利用度，与市售微孔渗透泵片相比，两种自制制剂的生物利用度略微提高，与原研缓释片生物等效。
四、附图说明
[0057]
图1盐酸二甲双胍粘膜微粒的显微镜图
[0058]
图2盐酸二甲双胍粘膜微粒粒径分布
[0059]
图3盐酸二甲双胍粘膜微粒dsc图
五、具体实施方式
[0060]
实例1
[0061]
将2ml冰醋酸加入至100ml容量瓶中并用纯水定容至刻度，得到2％的醋酸溶液；将 100mg壳聚糖溶解在2％醋酸溶液中，过夜搅拌得到壳聚糖溶液后；将200mg盐酸二甲双胍原料药加入壳聚糖溶液中，搅拌溶解后调节至ph＝4.2；将20mg三聚磷酸钠加入到20ml纯水中溶解得到1mg/ml的三聚磷酸钠溶液；再按比例用注射器缓慢滴入三聚磷酸钠溶液，450 rpm转速下搅拌交联40min后，得到盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒溶液，纯化冷冻干燥后即可得到纳米粒。
[0062]
实例2
[0063]
将1ml冰醋酸加入至100ml容量瓶中并用纯水定容至刻度，得到1％的醋酸溶液；将 100mg壳聚糖溶解在1％醋酸溶液中，过夜搅拌得到壳聚糖溶液后；将100mg盐酸二甲双胍原料药加入壳聚糖溶液中，搅拌溶解后调节至ph＝4.2；将20mg三聚磷酸钠加入到20ml纯水中溶解得到1mg/ml的三聚磷酸钠溶液；再按比例用注射器缓慢滴入三聚磷酸钠溶液，450 rpm转速下搅拌交联40min后，得到盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒溶液，纯化冷冻干燥后即可得到纳米粒。
[0064]
实例3
[0065]
将2ml冰醋酸加入至100ml容量瓶中并用纯水定容至刻度，得到2％的醋酸溶液；将
200 mg壳聚糖溶解在2％醋酸溶液中，过夜搅拌得到壳聚糖溶液后；将100mg盐酸二甲双胍原料药加入壳聚糖溶液中，搅拌溶解后调节至ph＝4.2；将20mg三聚磷酸钠加入到20ml纯水中溶解得到1mg/ml的三聚磷酸钠溶液；再按比例用注射器缓慢滴入三聚磷酸钠溶液，450rpm 转速下搅拌交联40min后，得到盐酸二甲双胍壳聚糖纳米粒溶液，纯化冷冻干燥后即可得到纳米粒。
[0066]
实例4
[0067]
将2ml冰醋酸加入至100ml容量瓶中并用纯水定容至刻度，得到2％的醋酸溶液；将 200mg壳聚糖溶解在1％醋酸溶液中，过夜搅拌得到壳聚糖溶液后；将200mg盐酸青藤碱原料药加入壳聚糖溶液中，搅拌溶解后调节至ph＝4.2；将40mg三聚磷酸钠加入到20ml纯水中溶解得到1mg/ml的三聚磷酸钠溶液；再按比例用注射器缓慢滴入三聚磷酸钠溶液，450rpm 转速下搅拌交联40min后，得到盐酸青藤碱壳聚糖纳米粒溶液，纯化冷冻干燥后即可。
[0068]
实例5
[0069]
将2ml冰醋酸加入至100ml容量瓶中并用纯水定容至刻度，得到2％的醋酸溶液；将 200mg壳聚糖溶解在1％醋酸溶液中，过夜搅拌得到壳聚糖溶液后；将200mg三七总皂苷原料药加入壳聚糖溶液中，搅拌溶解后调节至ph＝4.2；将40mg三聚磷酸钠加入到20ml纯水中溶解得到1mg/ml的三聚磷酸钠溶液；再按比例用注射器缓慢滴入三聚磷酸钠溶液，450rpm 转速下搅拌交联40min后，得到三七总皂苷聚糖纳米粒溶液，纯化冷冻干燥后即可。