Eflornithine在制备抗冠状病毒感染药物中的应用及药物

eflornithine在制备抗冠状病毒感染药物中的应用及药物
技术领域
1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及eflornithine及其药学上可 以接受的盐在制备预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒属于单正链rna病毒，冠状病毒家族主要包括新型冠状病毒 (sars-cov-2)，sars冠状病毒(sars-cov)，中东呼吸综合征冠状病毒 (mers-cov)，hcov-229e，hcov-oc43，hcov-nl63、hcov-hku。冠状病毒 通常导致呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。这些疾病的感染严 重影响了人们的健康。冠状病毒的反复发作，提示人类对于其研究知之甚 少，开发治疗新冠病毒的药物迫在眉睫。
3.木瓜样蛋白酶(plpro)是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp3上的水 解酶，主要功能为酶切多聚蛋白pp1a上nsp1-2，nsp2-3，nsp3-4之间特 异性四肽结构lxgg，该多聚蛋白需要被水解后成为成熟的功能蛋白；另外， 木瓜样蛋白酶具有从宿主细胞里脱离泛素的附加功能，该功能保护冠状病 毒进而规避宿主固有的免疫反应。因此，木瓜样蛋白酶对于病毒的生命周 期至关重要，可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。
4.eflornithine(二氟甲基鸟氨酸)具有抗肿瘤活性，eflornithine不可 逆地抑制鸟氨酸脱羧酶，一种多胺生物合成所需的酶，从而抑制了肿瘤细 胞的形成和增殖。多胺参与核小体的寡聚化和dna构象，从而创造了一种 染色质环境，刺激了细胞的肿瘤转化。该试剂已显示出诱导平滑肌瘤细胞 凋亡的作用。该试剂处于活跃临床试验中。本专利证实了eflornithine化 合物对新冠病毒木瓜样蛋白酶的抑制能力，由于冠状病毒的木瓜样蛋白酶 具有高度相似性，这种抑制能力普适于冠状病毒木瓜样蛋白酶。经查阅相 关资料，未见eflornithine化合物作为冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制 剂的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明针对冠状病毒引起的肺部，呼吸道和肠道疾病、神经系统症状 和心肌炎等相关炎症疾病缺乏有效防治药物的问题，指出eflornithine化 合物及其药学上可以接受的盐在制备抗冠状病毒炎症药物中的应用。
6.本发明技术是以新型冠状病毒(sars-cov-2)为模型，基于sars-cov-2 plpro的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库，临床化合物库，抗病 毒药物库的数千个化合物进行理论筛选，得到可能对新型冠状病毒plpro 有抑制的化合物。然后，我们利用前期构建的sars-cov-2木瓜样蛋白酶抑 制剂筛选试剂盒，实验筛选出了eflornithine及其药学上可以接受的盐对 sars-cov-2木瓜样蛋白酶的抑制作用。
7.经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示eflornithine(式 一)对sars-cov-2木瓜样蛋白酶的抑制作用。
[0008][0009]
上述化合物对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)的抑制效果明显， 表明这类化合物能够有效的抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性。并且， 鉴于文献报道的冠状病毒木瓜样蛋白酶具有高度相似性，我们推理该类化 合物也能够有效抑制其它冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性，尤其是对于 sars-cov，mers-cov，hcov-229e，hcov-oc43，hcov-nl63和hcov-hku。 优选地，具有抑制效果的eflornithine还包括各种旋光异构体、其水合物 及其与酸形成的可药用的盐。将式ⅰ化合物与药学上可接受的辅剂结合， 可以制备治疗和预防新型冠状病毒感染的药物。所述辅剂(药物学上可接 受的载体或辅料)包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、 湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。 该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂使用。其给药 途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
附图说明
[0010]
图1为实施例1抑制剂eflornithine不同浓度下底物肽在木瓜样蛋白酶代 谢下荧光强度随时间变化效果图
[0011]
图2为实施例2化合物eflornithine对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制 曲线
具体实施方式
[0012]
下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于更加清楚的说明本 发明，而不能视为对本发明的限制。
[0013]
整个实验过程中，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等， 都是根据该技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
[0014]
下述实施例中所用的抑制剂分子，部分购自mce(medchemexpress)或 其他普通商业途径。
[0015]
本发明所用的抑制剂筛选试剂盒为本实验室发明的(申请专利号为 202010674650.x)，包括以下组分：
[0016]
sars-cov-2木瓜样蛋白酶、
[0017]
底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)、
[0018]
硼酸硼砂缓冲液。
[0019]
所述sars-cov-2木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/ml；
[0020]
优选地，所述底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)的浓度为 0.1mm-5mm；其中dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4
’-
羧酸，edans是 荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；
[0021]
优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；所述硼酸 硼砂缓冲液的ph为7-9。
[0022]
其中采用的sars-cov2木瓜样蛋白酶购自crystalo biopharma，底物 dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)委托gl biochem定制合成，硼酸硼砂缓冲 液购自雷根生物。
[0023]
本实施例采用的试剂为：
[0024]
sars-cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/ml)，底物肽 dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)(浓度为0.1mm-5mm)，硼酸硼砂缓冲液 (ph＝7-9)。
[0025]
本发明实验过程用荧光酶标仪进行荧光检测。
[0026]
实施例1：抑制剂eflornithine不同浓度下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下 荧光强度随时间变化
[0027]
具体实施过程为：
[0028]
1)sars-cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0029]
2)将sars-cov2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/ml)在冻存板(-4至4℃) 里室温下融化，取1ul稀释于98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加 入检测板中；
[0030]
3)将不同浓度的抑制剂(eflornithine，浓度为0，0.025mm，0.125mm， 0.25mm，0.5mm，1mm，2.5mm)分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶 液中；
[0031]
4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中， 使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm 处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；
[0032]
5)抑制剂存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果 如下图1，其结果显示，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被抑制剂 eflornithine所抑制，并且这种抑制作用随浓度增加而增强。
[0033]
实施例2：eflornithine对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制能力测试 具体实施过程如下：
[0034]
1)sars-cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0035]
2)将sars-cov2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取 1ul稀释于98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；
[0036]
3)将不同浓度的抑制剂(eflornithine，浓度为0，0.025mm，0.1mm，0.25mm， 0.5mm，1mm，2.5mm)分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；
[0037]
4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中， 使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处 的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；
[0038]
5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组 (抑制剂浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同抑制组的孵育 前后荧光变化值与之相比得到剩余活性值(residualactivity)。使用 graphpad prism6软件，以抑制剂浓度的对数值(log(inhibitor))为横 坐标，对应的剩余活性值(residualactivity)为纵坐标。结果如图2所 示，得到抑制剂的ic
50
值。表1列举了化合物1-3对sars-cov2 plpro抑 制的活性数据。ic
50
计算的公式为y＝100/(1+10^((x-logic50)))，其中y 代表剩余活性分数,x代表抑制剂化合物浓度的常用对数,∧指的是幂算法。 图2所示为所示为不同抑制剂浓度对抑制酶活性比例作图，可以得到该化 合物的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示。
[0039]
表1：化合物1结构和抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)ic
50
值
[0040][0041]
本发明所述的eflornithine对冠状病毒尤其是新型冠状病毒的靶点木 瓜样蛋白酶plpro的酶活性有较强抑制作用，可用于制备抗冠状病毒尤其 是抗新型冠状病毒感染的药物。