可降尿酸的鲟鱼肽复合粉的制作方法

[0001]
本发明涉及一种以鲟鱼肉及软骨为原料深加工产品，尤其是一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉。


背景技术：

[0002]
高尿酸血症是由于嘌呤代谢异常等所引起的代谢性疾病，以血尿酸升高为主要特征。研究表明，长期高尿酸症状对血管、心脏、肝脏、肾脏都会产生损害，并常伴有高血压、高血脂、肥胖等疾病。目前，临床常用的药物主要有别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂，长期服用会导致肝肾损害。
[0003]
鲟鱼（sturgeon）具有丰富的营养成分，是一种对人体极为有益的水产品。据《本草拾遗》记载：“鲟鱼，肉味甘，平，无毒。主治补虚益气，令人肥健。煮汁饮，治血淋。鼻肉主治补虚下气。子主治食之肥美，杀腹内小虫”。《中国药用动物原色图鉴》写道：肉滋补强壮，益气补虚，补血。用治脾虚泄泻、营养不良、气虚筋骨无力、病后体弱、贫血、营养不良、血淋刺痛、前列腺炎、淋巴结肿大。目前有报道鲟鱼肉可以通过酶解手段制成益于人体吸收的鲟鱼肽，不同的酶解方法使得所制备的鲟鱼肽具有不同的生物活性，如有效清除自由基、提高机体免疫力，抑制血管紧张素转移酶（ace）活性及保护肝脏等等。
[0004]
专利号为zl2016112086708的中国发明专利公开了一种鲟鱼复合粉、鲟鱼骨酒及应用，其中的鲟鱼复合粉是按如下步骤制备：a. 将宰杀后的鲟鱼洗净，取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%，将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉；b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm的鲟鱼纳米粉；c. 向鲟鱼纳米粉中加入ph 7~8的0.01~0.1m磷酸缓冲液及复合酶，酶解12~48 h；所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1：1~10，所述复合酶添加量为10~25活力单位：1克鲟鱼纳米粉，所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3：3：4比例混合；d. 离心取上清，采用截留分子量为10000 da以下的超滤膜分离器分离，收集透过超滤膜的液体，将所收集的液体通过hpd系列大孔吸附树脂及活性炭后喷雾干燥，制得鲟鱼复合粉。
[0005]
所获得的鲟鱼复合粉的肽结构是在酶的作用下随机产生的片段，具有有效清除自由基、提高机体免疫力的作用。迄今为止，并没有关于可降尿酸的鲟鱼肽复合粉的相关报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉。
[0007]
本发明的技术解决方案是：一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉，按照如下步骤制备：
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净，取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%，将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉；b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm的鲟鱼纳米粉；c. 向鲟鱼纳米粉中加入ph 7~8的0.01~0.1m磷酸缓冲液及复合酶，酶解12~48 h；所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1：1~10，所述复合酶添加量为10~25活力单位：1克鲟鱼纳米粉，所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3：3：4比例混合；d. 离心取上清，采用截留分子量为10000 da以下的超滤膜分离器分离，收集透过超滤膜的液体，真空冷冻干燥，制得中间产物；e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液a，加入溶液a质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶及溶液a质量份数1%的谷氨酸，所述海洋酸性蛋白酶的活力单位≥2500u/mg，调节ph=4.8，于37℃酶解2h，真空冷冻干燥，得到鲟鱼肽复合粉。
[0008]
本发明是以鲟鱼肉及软骨为原料，通过复合酶进行酶解、超滤膜分离器分离及干燥后得到中间产物，然后再利用酶解反应的逆反应及谷氨酸对中间产物进行改进，进而获得能够显著抑制黄嘌呤脱氢酶（氧化酶）活性的鲟鱼肽复合粉，具有降尿酸作用，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
附图说明
[0009]
图1是本发明实施例所得鲟鱼肽复合粉的一级质谱图。
[0010]
图2~图5是本发明实施例所得鲟鱼肽复合粉的二级质谱图。
具体实施方式
[0011]
实施例1：一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉，按如下步骤制备：a. 将宰杀后的鲟鱼洗净，取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%，将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉；b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm 的鲟鱼纳米粉；c. 向鲟鱼纳米粉中加入ph 7~8的0.05m磷酸缓冲液及复合酶，酶解30 h；所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1：5，所述复合酶添加量为15活力单位：1克鲟鱼纳米粉，所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3：3：4比例混合；d. 离心取上清，采用截留分子量为10000 da以下的超滤膜分离器分离，收集透过超滤膜的液体，真空冷冻干燥，制得中间产物；e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液a，加入溶液a质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶aspergillus sp.及溶液质量份数1%的谷氨酸，所述海洋酸性蛋白酶aspergillus sp.的活力单位≥2500u/mg，用稀盐酸调节ph=4.8，于37℃酶解2h，真空冷冻干燥，得到鲟鱼肽复合粉。
[0012]
实施例2：一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉，按如下步骤制备：a. 将宰杀后的鲟鱼洗净，取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%，将冻干的鲟鱼
肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉；b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm 的鲟鱼纳米粉；c. 向鲟鱼纳米粉中加入ph 7~8的0.1m磷酸缓冲液及复合酶，酶解12 h；所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1：10，所述复合酶添加量为25活力单位：1克鲟鱼纳米粉，所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3：3：4比例混合；d. 离心取上清，采用截留分子量为10000 da以下的超滤膜分离器分离，收集透过超滤膜的液体，真空冷冻干燥，制得中间产物；e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液a，加入溶液a质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶aspergillus sp.及溶液质量份数1%的谷氨酸，所述海洋酸性蛋白酶aspergillus sp.的活力单位≥2500u/mg，用稀盐酸调节ph=4.8，于37℃酶解2h，真空冷冻干燥，得到鲟鱼肽复合粉。
[0013]
实施例3：一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉，按如下步骤制备：a. 将宰杀后的鲟鱼洗净，取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%，将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉；b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm 的鲟鱼纳米粉；c. 向鲟鱼纳米粉中加入ph 7~8的0.01m磷酸缓冲液及复合酶，酶解48 h；所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1：1，所述复合酶添加量为10活力单位：1克鲟鱼纳米粉，所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3：3：4比例混合；d. 离心取上清，采用截留分子量为10000 da以下的超滤膜分离器分离，收集透过超滤膜的液体，真空冷冻干燥，制得中间产物；e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液a，加入溶液a质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶aspergillus sp.及溶液质量份数1%的谷氨酸，所述海洋酸性蛋白酶aspergillus sp.的活力单位≥2500u/mg，用稀盐酸调节ph=4.8，于37℃酶解2h，真空冷冻干燥，得到鲟鱼肽复合粉。
[0014]
将实施例1所得到的冷冻干燥物制备成8mg/ml的去离子水溶液，使用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，一级质谱图如图1所示，二级质谱图如图2~图5所示。在ncbi上进行blast的分析，得到m/z为821.4062氨基酸序列为ceeeiak、m/z为834.3734氨基酸序列为sqevedk、m/z为882.4296氨基酸序列为veheklk以及m/z为887.4255氨基酸序列为emtnhqk的四个肽。
[0015]
实验例：选取40只清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，于12 h黑暗、12 h光亮的塑料饲养箱内饲养，室温20
±
2℃，湿度40% ~ 60%，自由采食和饮水，适应性饲养3d后，随机分为4组，分别为空白组、模型组、别嘌醇阳性组、本发明实施例1组，每组10只。其中模型组、别嘌醇阳性组及本发明实施例1组腹腔注射以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂的氧嗪酸钾（po）溶液（浓度300mg/kg），0.2ml/10g连续注射15d，建立高尿酸血症模型。空白组注射0.5%羧甲基纤维素钠（0.2ml/10g）。造模成功后，别嘌醇阳性组与本发明实施例1组每天给药1次（0.1ml/10g），连续灌胃15d，别嘌醇阳性组给药为allopurinol, apl, 浓度5 mg/kg，本发明实施例1组给药为实施例1所得鲟鱼肽复合粉，浓度80mg/kg；空白组及模型组给予等体积
蒸馏水灌胃。末次给药后禁食24h后，用水合氯醛麻醉小鼠，眼眶后静脉取血，将采集的全血于37℃恒温30 min，然后于4℃冰箱中1h，在3000rpm下离心3 min，分离血清。测定血清中尿酸（ua）及黄嘌呤氧化酶（xod）的含量，如表1。
[0016]
表1取50μl本发明实施例1组小鼠血清和模型组小鼠血清，均采用去血清高丰度亲和色谱柱agilent multiple affinity removal lc column-mouse 3获得小鼠血清中低丰度蛋白组分。各样品血清低丰度蛋白组分经过超滤浓缩后加入等体积sdt裂解液，沸水浴裂解15 min，于14000
×
g条件下离心20 min。采用bca法对上清液进行定量，分别为样品1、样品2。
[0017]
采用filter aided proteome preparation (fasp)方法对样品1、2进行酶解：取样品1和样品2各30 μl，分别加入0.003 mmol dtt，沸水浴5 min后冷却至室温；加入200 μl尿素缓冲液（8 mol/l尿素，150 mmol/l tris-hcl，ph8.0）混匀后，在10 kd超滤离心管中于14000
×
g离心15 min，弃滤液，重复该步骤一次。加入100 μl 100 mm iaa缓冲液（以尿素缓冲液溶解），在600 rpm条件下振荡1 min，室温避光30 min后于相同离心条件下进行离心；重复该步骤一次。加入100 μl 25 mm nh
4
hco
3
溶液，相同离心条件下离心两次。加入40 μl 0.1 g/l胰蛋白酶缓冲液（以100 mm nh
4
hco
3
溶液配制），600 rpm振荡反应1 min，37℃静置16 h。换新收集管，相同离心条件下离心；再加入40 μl 25 mm nh
4
hco
3
，在相同离心条件下离心并收集滤液。通过c18 cartridge脱盐冻干后以40 μl 0.1%甲酸溶液复溶，测定280 nm吸光值。
[0018]
根据fasp酶解后样品od280定量结果，各取2 μg酶解后的样品1及样品2进行lc-ms/ms分析。样品先经过rp-c
18
毛细管高效液相色谱柱（thermo easy column sc200 150 μm
×
100 mm）的纳升流速hplc液相系统easy-nlc1000，以甲酸乙腈水溶液进行梯度分离。预柱为rp-c18 thermo easy column sc001 traps 150 μm
×
20 mm。a液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为2%），b液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。梯度条件为：0～100 min，b液线性梯度0%～45%；100～108 min，b液线性梯度45%～100%；108～120 min，b液维持在100%。分离后用q-exactive质谱仪进行质谱分析。预分析时长60min, 正式分析时长120min。
[0019]
质谱分析原始数据为raw文件，采用maxquant软件（版本号1.3.0.5）进行查库鉴定，并根据label free算法进行定量分析，结果如表2所示。
[0020]
表2
结果表明，本发明实施例1组小鼠血清和模型组小鼠血清相比，其中胞质中c-1-四氢叶酸合成酶（c-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic，ac：q922d8）和肌肉中糖原磷酸化酶显著增加，黄嘌呤脱氢酶（氧化酶）（xanthine dehydrogenase/oxidase，ac：q00519）显著减少，表明本发明的鲟鱼肽复合粉具有较强的降尿酸作用。