玫瑰树碱盐酸盐在制备抗猪链球菌溶血素的药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明涉及微生物传染病及医药领域，具体涉及玫瑰树碱盐酸盐在制备抗猪链球菌溶血素的药物中的应用。


背景技术：

[0002]
猪链球菌是最重要的人畜共患病病原体之一，严重威胁人类健康和养猪业的发展，在世界范围内造成重大经济损失。据不完全统计，自丹麦1968年第一例猪链球菌感染病例以来，已报道人类感染猪链球菌1600余例。猪链球菌感染可导致多种疾病，包括败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎，其中死亡率最高的是猪链球菌导致的中毒休克样综合征(stsls)。stsls的特征是细菌负荷、炎性细胞因子风暴、多系统器官衰竭，最终导致宿主急性死亡。常用的抗生素虽然可以杀死猪链球菌，但是无法缓解猪链球菌stsls对机体的影响。现有的研究已经证实猪链球菌溶血素(sly)是导致stsls的主要原因，因此寻找一种能拮抗猪链球菌溶血素的药物是治疗猪链球菌感染的关键。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于提供兽用驱虫药玫瑰树碱盐酸盐新的应用，即提供玫瑰树碱盐酸盐在制备抗猪链球菌溶血素的药物中的应用。
[0004]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0005]
本发明发现玫瑰树碱盐酸盐能够中和猪链球菌溶血素的毒性，并对猪链球菌感染的小鼠有保护效果。基于此，本发明提供如下应用：
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玫瑰树碱或其药学上可接受的盐在制备抗猪链球菌溶血素的药物中的应用。
[0007]
玫瑰树碱或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪链球菌感染的药物中的应用。
[0008]
上述玫瑰树碱药学上可接受的盐优选为玫瑰树碱盐酸盐。
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玫瑰树碱或其药学上可接受的盐在制备抗细菌溶血素的药物中的应用。
[0010]
玫瑰树碱或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗产溶血素细菌感染的药物中的应用。
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本发明具有如下优点和有益效果：
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(1)本发明发现了玫瑰树碱盐酸盐新的药用价值，为猪链球菌感染提供了新的防治药物。
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(2)玫瑰树碱盐酸盐可以中和猪链球菌的主要毒力因子-溶血素，减轻stsls对机体的损伤。
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(3)玫瑰树碱盐酸盐通过中和细菌毒力因子发挥作用，降低了细菌的变异率。
附图说明
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图1是玫瑰树碱盐酸盐对红细胞的溶血毒性结果统计图。
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图2是猪链球菌sc19培养上清对红细胞的裂解结果统计图。
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图3是玫瑰树碱盐酸盐对猪链球菌sc19培养上清溶血活性抑制的结果统计图。
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图4是玫瑰树碱盐酸盐对猪链球菌sc19溶血素蛋白抑制的结果统计图。
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图5是玫瑰树碱盐酸盐对金黄色葡萄球菌溶血素蛋白抑制的结果统计图。
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图6是溶血素蛋白与玫瑰树碱盐酸盐的分子对接模式图，a：溶血素蛋白的活性口袋分析；b玫瑰树碱盐酸盐通过两个氢键(虚线)结合在溶血素蛋白的活性域中。
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图7是玫瑰树碱盐酸盐与溶血素蛋白的热量摩尔比曲线图。
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图8是玫瑰树碱盐酸盐与溶血素蛋白的动力学反应曲线图。
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图9是猪链球菌sc19感染小鼠的存活曲线图。
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图10是小鼠肺部切片图，图中显示eh治疗组相对于未治疗组，组织的充血和间质增生明显减少。
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图11是小鼠血清中il-6和tnf-α检测结果图。
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图12是小鼠血液生化水平检测结果图。
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图13是小鼠肺、脾、肾和肝的组织载菌量检测结果图。
具体实施方式
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以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
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下述实施例中所用到的猪链球菌sc19菌株为2005年中国四川省疫情爆发时从死猪脑中分离的毒力株；实施例结果统计分析采用双尾非配对t检验，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。
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实施例1
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(1)在96孔板中，将50μl悬浮在pbs中的2％绵羊红细胞添加到50μl在pbs中连续稀释的玫瑰树碱盐酸盐(eh)中，于37℃下孵育1小时，其中，eh浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128μg/ml，2.5％tritonx-100作为阳性对照。然后将板以500g离心5分钟，并将来自测定板每个孔的50μl上清液转移至新鲜的96孔板中。通过目视观察和测量543nm处的吸光度来确认溶血。
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结果见图1，玫瑰树碱盐酸盐自身并不能引起红细胞溶血。
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(2)将猪链球菌sc19菌株37℃培养12h，4℃、10000rpm离心10min，收集上清。将不同体积的培养上清加到含2％脱纤维绵羊血磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph 7.4)中(总体积1ml)，37℃孵育30分钟。最后，在4℃条件下1000rpm离心5min。随后，收集上清200μl样本，在543nm处用生物pectrometer(eppendorf)测定其光密度。同时将含2％脱纤维绵羊血磷酸盐缓冲(pbs，ph 7.4)溶液用2.5％tritonx-100处理设置为100％阳性对照。sc19培养上清溶血活性通过各样品的od543数值与阳性对照的比值来评估。结果见图2，sc19培养上清为125μl时可以裂解95％以上的红细胞。
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(3)将猪链球菌sc19菌株37℃培养12h，4℃、10000rpm离心10min，收集上清。将125μl含不同浓度eh(0、2、4、8、16、32μg/ml)的上清在37℃下孵育30min。然后加入875μl含2％脱纤维绵阳羊磷酸盐缓冲(pbs，ph 7.4)溶液，37℃孵育30分钟。最后，在4℃条件下，1000rpm离心5min，收集上清200μl样本，在543nm处用生物pectrometer(eppendorf)测定其
光密度。同时将含2％脱纤维绵羊血磷酸盐缓冲(pbs，ph 7.4)溶液用2.5％tritonx-100处理设置为100％阳性对照。eh对sc19培养上清溶血活性的影响通过各样品的od543数值与阳性对照的比值来评估。
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结果见图3，玫瑰树碱盐酸盐明显抑制sc19培养上清的溶血活性，并呈现浓度依赖性。
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(4)将纯化的猪链球菌sc19溶血素蛋白(100ng/ml)与不同浓度(0、2、4、8、16和32μg/ml)的eh共孵育，并按照(3)中的方法评估eh的抗溶血素蛋白作用效果。
[0037]
结果见图4，与(3)中结果一致，玫瑰树碱盐酸盐抑制猪链球菌溶血素蛋白的溶血活性。
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(5)将纯化的金黄色葡萄球菌α溶血素蛋白(100ng/ml)与不同浓度(0、2、4、8、16和32μg/ml)的eh共孵育，并按照(3)中的方法评估eh的抗溶血素蛋白作用效果。
[0039]
结果见图5，表明玫瑰树碱盐酸盐同样能抑制金黄色葡萄球菌溶血素蛋白的溶血活性。
[0040]
实施例2
[0041]
(1)在sly与eh对接过程中，使用autodock4.2分析了sly与eh的分子对接模式。sly的晶体结构来源于蛋白质数据库(pdb)http://www.rcsb.org/structure/3hvn。eh的2d和3d结构分别由chembiodraw ultra 14.0和chembio3d ultra 14.0绘制。通过计算模拟方法，预测了蛋白质与小分子结合口袋如图6a，玫瑰树碱盐酸盐结合在溶血素蛋白的pose1区域。此外，如图6b所示，氨基酸i87、d86、l110、n112、d111、t195、k190、n50、t191、s374、n82等11个氨基酸组成很好的疏水口袋空腔，疏水性口袋与小分子平面疏水性质形成很好的疏水作用模式，并在作用中占据主导地位，而且氨基酸s84、l110与小分子之间形成较好的氢键作用。
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(2)采用等温量热滴定(itc)在体外测定sly蛋白与eh的相互作用。将纯化的溶血素(sly)蛋白、和eh分别溶于ph 7.4的pbs中使其终浓度为0.02mmol/l、0.2mmol/l。将eh(总体积为50μl)注射到装有300μl纯化的sly蛋白的样品池中，每次注射2.5μl，注射重复20次，注射间隔为200s，实验在25℃下进行。通过nanoanalyzer软件计算平衡离解常数(kd)、化学计量学(n)、焓(δh)和熵(δs)如图7，kd＝1.235
×
10-7
mol/l，n＝2.079，δh＝-142.8，δs＝-362.2j/mol/k，表明玫瑰树碱盐酸盐与溶血素有良好的结合力。
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(3)通过表面等离子共振(lspr)技术确定sly和eh的平衡解离常数，进一步证明sly蛋白与eh的相互作用。sly蛋白固定在cooh传感器芯片(nicoya,canada)上。pbs(ph 7.4)冲洗芯片，获得稳定的检测基线。将浓度升高(1.272mg/l、2.545mg/l、5.090mg/l、10.179mg/l)的eh注射到芯片中。设置pbs作为阴性对照。设定每个周期的速度为20μl/min。使用trace drawer软件对测定所得数据进行分析。利用结合反应动力学参数评价sly与eh的相互作用。如图8所示，通过trace drawer软件计算出sly和eh的平衡解离常数(kd)为1.86
×
10-6
m，进一步表明玫瑰树碱盐酸盐与溶血素有很强的结合力。
[0044]
通过该实施例可以得知，玫瑰树碱盐酸盐同样能和与猪链球菌溶血素蛋白结构相似的其他细菌溶血素结合，抑制其溶血活性。
[0045]
实施例3
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下述实验所用小鼠为七周龄雌性balb/c小鼠，购自中国三峡大学。动物实验符合
动物伦理，所有实验均在华中农业大学动物实验保护监督控制委员会(hzaumo-2019-011)指导下进行。
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(1)存活率实验
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小鼠随机分成eh治疗组、未治疗组两组，每组10只。将过夜培养的sc19按体积比1:100转入tsb培养基中，37℃培养至od600＝0.6。4℃、10000rpm离心10min后收集菌体，用pbs(ph 7.4)悬浮。在存活率实验中，每只小鼠注射2.5
×
108cfu的菌量。感染2小时后，小鼠腹腔注射eh。给药剂量为5mg/kg，间隔12小时给药一次，连续治疗三天。未治疗组注射同体积的pbs(ph 7.4)。根据实验结果构建的小鼠生存曲线如图9所示，与对照组相比，eh治疗组的小鼠存活率达到60％左右。
[0049]
(2)切片、炎症因子、血液生化和组织载菌量检测
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小鼠随机分成未治疗组、eh治疗组、空白对照组，每组5只小鼠。未治疗组、eh治疗组腹腔注射浓度为5
×
107cfu的sc19，空白对照组注射同样体积的pbs。感染2小时后，eh治疗组小鼠腹腔注射eh，给药剂量为5mg/kg；未治疗组和空白对照组注射同体积的pbs。在注射12小时后，处死小鼠并收集血液和组织，用全自动血液生化分析仪分析eh对sc19感染小鼠的血液生化(alt、ast、ck)水平的影响。此外，将肺、脾、肾和肝研磨、稀释，并接种到含有5％胎牛血清的tsa平板上，37℃培养过夜，计数细菌。使用敏感的电化学发光平台(quickplex,)检测炎症细胞因子。最后用4％多聚甲醛固定肺组织，通过石蜡切片分析其病理变化。结果如下：
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如图10所示，eh治疗小鼠后，肺部病理损伤明显改善，炎性细胞浸润减少。
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如图11所示，eh可以明显抑制感染小鼠il-6和tnf-α的产生。
[0053]
如图12所示，eh治疗小鼠明显降低血液生化水平。
[0054]
如图13所示，eh能够明显降低感染小鼠肺、脾、肾和肝的组织载菌量。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。