Ebselen在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂及抗冠状病毒感染的药物中的应用

ebselen在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂及抗冠状病毒感染的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及ebselene在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂及药物中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒是一个大型病毒家族，在目前已知的正链rna病毒中基因组是最大的。根据宿主、血清型基因序列以及结构的不同可将冠状病毒分为四类：α类、β类、γ类和δ类。在这四类α类、β类只会感染哺乳动物，γ类和δ类主要感染鸟类；α属冠状病毒包括人冠状病毒(hcov-229e、hcov-nl63)、长翼蝠冠状病毒(hku1、hku8)、犬冠状病毒(ccov)和猫冠状病毒(fcov)等；β属冠状病毒包括人冠状病毒(hcov-oc43、hcov-hku1)、新型冠状病毒 (sars-cov-2)、sars冠状病毒(sars-cov)，中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、鼠冠状病毒、果蝠冠状病毒hku9等；γ类冠状病毒主要包括禽冠状病毒如鸡传染性支气管炎病毒 (ibv)、土耳其冠状病毒(tcov)等；δ属冠状病毒包括夜莺冠状病毒(bucov hku11)、绣眼鸟冠状病毒(wecov)、野鸭冠状病毒(wicov)、黑水鸡冠状病毒(cmcov)等。
3.冠状病毒主要侵害呼吸道，胃肠道和神经系统等，往往会造成呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。木瓜样蛋白酶(plpro)是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp3上的水解酶，主要功能为酶切多聚蛋白pp1a上nsp1-2，nsp2-3，nsp3-4之间特异性四肽结构lxgg，该多聚蛋白需要被水解后成为成熟的功能蛋白；另外，木瓜样蛋白酶具有从宿主细胞里脱离泛素的附加功能，该功能保护冠状病毒进而规避宿主固有的免疫反应。因此，木瓜样蛋白酶对于病毒的生命周期至关重要，可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。
4.ebselen，中文名称依布硒或依布硒啉、2-苯基苯并异硒唑3-酮，是一种有机硒化合物，可透过血脑屏障，具有抗炎，抗氧化和抗癌活性。ebselen(spi-1005)是一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物，有效的电压依赖性钙通道(vdcc)阻断剂，同时也是hiv-1衣壳ctd二聚化的抑制剂。经查阅相关资料，未发现ebselen作为冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制剂及用于抗冠状病毒感染的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明针对冠状病毒引起的肺部，呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎等相关炎症疾病缺乏有效防治药物的问题，通过对冠状病毒重要靶点木瓜样蛋白酶进行抑制，提出 ebselen及其药学上可以接受的盐在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂药物的应用。
6.本发明提供的第一种技术方案是：ebselen或其药学上可接受的盐在以下至少一种中的应用：
7.(1)在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂中的应用；
8.(2)在制备抗冠状病毒感染的药物中的应用；
9.(3)在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。
10.本发明提供的另一种技术方案是：一种冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂，其活性成分为 ebselen或其药学上可接受的盐。
11.优选地，所述ebselen包括其旋光异构体、或其水合物。
12.优选地，所述其水合物的结晶水数目为1-16中的任意实数。
13.优选地，所述ebselen药学上可接受的盐为ebselen与酸形成的盐；所述的酸选自盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、苹果酸中的任一种。
14.优选地，所述冠状病毒为hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku、sars-cov、 mers-cov、sars-cov-2中的任一种。
15.本发明还提供一种抗冠状病毒感染的药物，所述药物中含有有效剂量的所述冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂。
16.优选地，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。所述药物的给药途径为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
17.本发明还提供一种抑制冠状病毒的产品，该产品包含所述的冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂。
18.本发明提供的技术方案中，ebselen对冠状病毒的靶点木瓜样蛋白酶(plpro)的酶活性有较强抑制作用，作为冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)抑制剂，具有发展为治疗和预防冠状病毒所致疾病尤其是抗新冠病毒感染的药物的潜力，为新冠病毒感染的治疗和预防开辟新的途径。
附图说明
19.图1为实施例1中不同浓度的ebselen下底物肽在木瓜样蛋白酶(plpro)代谢下荧光强度随时间变化的示意图。
20.图2为实施例2中ebselen对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)的抑制曲线。
具体实施方式
21.下面将详细描述本发明的具体实施方式，这些实施例是本发明说明性优选实施方案，仅用于更加清楚的说明本发明，而不能视为对本发明的限制。
22.整个实验过程中，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据该技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
23.下述实施例中所用的化学试剂，均购自mce(medchemexpress)或其他普通商业途径。
24.本发明所用的抑制剂筛选试剂盒为本发明申请人具有自主知识产权的产品(申请号为 202010674650.x)，包括以下组分：
25.sars-cov-2木瓜样蛋白酶、
26.底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)、
27.硼酸硼砂缓冲液。
28.sars-cov-2木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/ml。
29.底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)的浓度为0.1mm-5mm；其中dabcyl是猝灭
剂4-二甲胺偶氮苯4
’‑
羧酸，edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸。
30.硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；硼酸硼砂缓冲液的ph为7-9。
31.其中，采用的sars-cov2木瓜样蛋白酶购自crystalo biopharma，底物 dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)委托gl biochem定制合成，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。 sars-cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/ml)、底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)(浓度为0.1mm-5mm)、硼酸硼砂缓冲液(ph＝7-9)。
32.本发明所使用的试剂盒需要用配合荧光酶标仪进行荧光检测。
33.本发明是以新型冠状病毒(sars-cov-2)为模型，基于新型冠状病毒木瓜样蛋白酶 (sars-cov-2plpro)的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库，临床化合物库，抗病毒药物库的数千个化合物进行理论筛选，得到可能对新型冠状病毒(plpro)有抑制的化合物。然后，我们利用前期构建的sars-cov-2木瓜样蛋白酶抑制剂筛选试剂盒，通过酶活性测试对这些化合物进行实验筛选。
34.按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示化合物ebselen及其药学上可接受的盐对sars-cov-2木瓜样蛋白酶plpro的抑制作用。
[0035][0036]
将式(i)化合物、或其旋光异构体、水合物、及其药学上可接受的盐，与药学上可接受的辅剂结合，可以制备冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)的抑制剂，以及治疗和预防冠状病毒感染的药物。辅剂(药学上可接受的载体或辅料)包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
[0037]
实施例1：ebselen不同浓度作用下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化
[0038]
具体实施过程为：
[0039]
(1)sars-cov-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0040]
(2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1ul稀释于 98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；
[0041]
(3)将不同浓度的ebselen，浓度为0，0.025mm，0.125mm，0.25mm，0.5mm，1mm，2.5mm，分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；
[0042]
(4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；
[0043]
(5)ebselen存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如下图1，其结果显示，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被ebselen抑制，并且这种抑制现象是浓度相关的。
[0044]
实施例2：ebselen对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制能力检测
[0045]
具体实施过程如下：
[0046]
(1)sars-cov-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0047]
(2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1ul稀释于 98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；
[0048]
(3)将不同浓度的抑制剂(ebselen浓度为0，0.025mm，0.125mm，0.25mm，0.5mm，1mm， 2.5mm)分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；
[0049]
(4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；
[0050]
(5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组(ebselen 浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同抑制组的荧光变化值与之相比得到剩余活性值(residual activity)。使用graphpad prism6软件，以ebselen浓度的对数值(logc (inhibitor))为横坐标，对应的剩余活性值(residual activity)为纵坐标。结果如图2 所示，图2所示为不同浓度ebselen对酶活性抑制比例作图，可以得到该化合物对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示。
[0051]
可以看出，ebselen对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)的抑制效果十分明显，ic50 值为0.9277μm，表明ebselen能够有效的抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性。并且，基于序列分析表明冠状病毒木瓜样蛋白酶具有高度相似性，因此，该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性，尤其是对于sars-cov，mers-cov，hcov-229e，hcov-oc43， hcov-nl63和hcov-hku1。有望发掘出ebselen在治疗冠状病毒尤其是新冠病毒感染疾病中的新用途。
[0052]
ic50计算的公式为y＝100/(1+10^((x-logic50)))，其中y代表剩余活性分数，x代表抑制剂化合物浓度的常用对数，∧指的是幂算法。
[0053]
上述实施例中所采用的操作方法和操作步骤以及底物反应条件等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。