美白、皱纹改善和抗污染用功能性组合物

1.本发明涉及一种美白、皱纹改善和抗污染(antipollution)用功能性组合物。


背景技术：

2.随着进入现代社会，环境污染增加，生活半径周围的污染物的浓度增加，成为了新兴的社会问题。当这些污染物进入人体并积累时，存在许多问题，例如引起各种疾病。
3.所述污染物不仅会渗透到体内，而且直接接触皮肤也会对皮肤产生不良影响，例如皮炎、皮疹和皮肤坏死等不良影响。因此，对可以保护皮肤免受污染物和紫外线影响的化妆品的需求日益增长。
4.细尘(fine dust)或超细尘(ultra fine dust)是近年来被关注的引起皮肤损害的原因之一，是指直径为2.5～10μm的污染物质(pollution material，pm)或2.5μm以下的污染物质，它直接损害皮肤屏障功能，并加剧皮炎。
5.由于细尘的粒径非常小，它可以穿过毛囊进入皮肤底层。因此，它可以影响特应症或过敏性皮肤患者或敏感性皮肤患者。当细尘渗入皮肤时，它会产生活性氧并损害我们皮肤的线粒体，从而减少胶原蛋白的合成且增加其分解，同时刺激黑色素细胞以诱发色素沉着，因此会加重色素沉着和皱纹毛孔扩张等的皮肤老化现象。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.本发明的目的在于提供一种功能性组合物，其采用天然物来源的成分来表现出抗老化、皮肤皱纹改善和抗污染活性。
8.本发明的目的在于提供一种以包含新型有机化合物作为有效成分的皮肤改善用组合物及其用途。
9.用于解决问题的手段
10.为实现上述目的，本发明的一实施例的皮肤改善用组合物包含以下述化学式1表示的化合物作为有效成分：
11.[化学式1]
[0012][0013]
其中，n为1至5的整数，
[0014]
r1和r2彼此相同或不同，各自独立地选自由氢、卤素、羟基、取代或未取代的碳原子数1至30的烷基、取代或未取代的碳原子数2至30的烯基、取代或未取代的碳原子数2至24的炔基、取代或未取代的碳原子数2至30的杂烷基、取代或未取代的碳原子数5至30的芳基、取代或未取代的碳原子数2至30的杂芳基和取代或未取代的碳原子数1至20个的烷氧基构成的组。
[0015]
以所述化学式1表示的化合物可以是以下述化学式2表示的化合物：
[0016]
[化学式2]
[0017][0018]
其中，r2与化学式1相同，
[0019]
r3和r4彼此相同或不同，各自独立地选自由氢、卤素、羟基、取代或未取代的碳原子数1至30的烷基、取代或未取代的碳原子数2至30的烯基、取代或未取代的碳原子数2至24的炔基、取代或未取代的碳原子数2至30的杂烷基、取代或未取代的碳原子数5至30的芳基、取代或未取代的碳原子数2至30的杂芳基和取代或未取代的碳原子数1至20个的烷氧基构成的组。
[0020]
所述r2是羟基或取代或未取代的碳原子数1至20的烷氧基。
[0021]
以所述化学式1表示的化合物进行1h-nmr光谱的测量时，在7.45至7.47ppm表现出第一峰值，在7.43至7.45ppm表现出第二峰值，在6.80至6.82ppm表现出第三峰值。
[0022]
更具体而言，以下述化学式1表示的化合物可以是以下化合物：
[0023][0024]
所述组合物的特征在于，抗污染、抗氧化、抗老化和皮肤美白改善效果优异。
[0025]
以所述化学式1表示的化合物是从齿叶风毛菊中分离的化合物，是从齿叶风毛菊提取物的级分中分离的化合物。
[0026]
所述齿叶风毛菊(saussurea neoserrata)生长在深山中，高度为50至110cm，茎直立，有时从顶部长出树枝。叶的根延伸到茎，成为茎的翼。花朵盛开时，根部的叶子和底部的叶子凋落，茎上的叶子交错且为披针形或椭圆披针形，长12至15cm。尖端尖，底部窄。它越向顶部越小，并且背面有卷曲的毛，边缘有尖齿。另外，花在八月或九月绽放紫色。头花以伞房花序长在分枝的末端和主茎的末端，花直径为8至10mm。总苞为筒状，长度为8至9mm，直径为4至5mm。苞片排列成4行，边缘是紫色，长有像蜘蛛网一样的白毛。果实是一种瘦果，长约5mm，有黑褐色条纹。冠毛为2行，为棕色。幼芽可食用。齿叶风毛菊为韩国特有种，分布在北部地区。
[0027]
更具体而言，可以从以热水提取方法由齿叶风毛菊提取的热水提取物中进行分级提取的级分中分离出以所述化学式1表示的化合物。
[0028]
所述齿叶风毛菊热水提取物，可利用与常规的热水提取物的制备方法相同的方法来制备。
[0029]
所述齿叶风毛菊热水提取物用水和乙酸乙酯分级提取，对所述水层用正丁醇(n-butanol)再次分级提取。对各层进行减压浓缩，制备了etoac、n-buoh和h2o级分。
[0030]
以所述化学式1表示的化合物是从齿叶风毛菊丁醇级分中鉴定出的，通过图1和图
2的核磁共振(nmr)数据进行了分析。
[0031]
以所述化学式1表示的化合物属于以下述内容为特征的化合物，进行1h-nmr光谱的检测时，在7.45至7.47ppm下表现出第一峰值，在7.43至7.45ppm下表现出第二峰值，在6.80至6.82ppm下表现出第三峰值。
[0032]
所述组合物的抗污染、抗老化和皮肤美白改善效果优异。
[0033]
本发明的另一实施例的抗污染、抗老化和皮肤美白改善用化妆材料组合物可包含所述皮肤改善用组合物。
[0034]
本发明的另一实施例的抗污染、抗老化和皮肤美白改善用食品组合物可包含所述皮肤改善用组合物。
[0035]
本发明的另一实施例的抗污染、抗老化和皮肤美白改善用药物组合物可包含所述皮肤改善用组合物。
[0036]
在本发明中，除非特别限制，“氢”是氢、氕、氘或氚。
[0037]
在本发明中，“卤素基”为氟、氯、溴或碘。
[0038]
在本发明中，“烷基”是指源自碳原子数1至40个的直链或支链的饱和烃的一价取代基。作为例子，可以举出甲基、乙基、丙基、异丁基、仲丁基、戊基、异戊基、己基等，但不限定于此。
[0039]
在本发明中，“烯基(alkenyl)”是指源自具有1个以上碳-碳双键的碳原子数2至40个的直链或支链的不饱和烃的一价取代基。作为例子，可以举出乙烯基(vinyl)、烯丙基(allyl)、异丙烯基(isopropenyl)、2-丁烯基(2-butenyl)等，但不限定于此。
[0040]
在本发明中，“炔基(alkynyl)”是指源自具有1个以上碳-碳三键的碳原子数2至40个的直链或支链的不饱和烃的一价取代基。作为例子，可以举出乙炔基(ethynyl)、2-丙炔基(2-propynyl)等，但不限定于此。
[0041]
在本发明中，“芳基”是指源自单环或两个以上环结合的碳原子数6至60个的芳香族烃的一价取代基。另外，还可以包括两个以上的环彼简单贴附在一起(pendant)或稠合的形式。作为这种芳基的例子，可以举出苯基、萘基、菲基、蒽基、芴基、二甲基芴基等，但不限定于此。
[0042]
在本发明中，“杂芳基”是指源自碳原子数6至30个的单杂环或多杂环芳香族烃的一价取代基。此时，环中一个以上的碳，优选地，1至3个的碳被如n、o、s或se的杂原子取代。另外，也可以包括2个以上的环彼此简单贴附在一起(pendant)或稠合的形式，进而，也可以包括与芳基稠合的形式。作为这种杂芳基的例子，可以举出如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基等6-元单环，如噻吩吩基(phenoxathienyl)、吲哚嗪基(indolizinyl)、吲哚基(indolyl)、嘌呤基(purinyl)、喹啉基(quinolyl)、苯并噻唑(benzothiazole)、咔唑基(carbazolyl)的多环以及2-呋喃基、n-咪唑基、2-异噁唑基、2-吡啶基、2-嘧啶基等，但不限定于此。
[0043]
在本发明中，“烷氧基”可以为直链、支链或环链。烷氧基的碳原子数没有特别的限制，但优选为碳原子数1至20。具体可以为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、异戊氧基、正己氧基、3,3-二甲基丁氧基、2-乙基丁氧基、正辛氧基、正壬氧基、正癸氧基、苄氧基、对甲基苄氧基等，但并非限定于此。
[0044]
在本发明中，“取代”是指与化合物的碳原子键合的氢原子被其他取代基替换，就被取代的位置而言，只要是氢原子被取代的位置，即取代基可取代的位置，则没有特别限制。两个以上被取代时，两个以上的取代基可以彼此相同或不同。所述取代基可以用选自由氢、氰基、硝基、卤素基、羟基、碳原子数1至30的烷基、碳原子数2至30的烯基、碳原子数2至24的炔基、碳原子数2至30的杂烷基、碳原子数6至30的芳烷基、碳原子数5至30的芳基、碳原子数2至30的杂芳基、碳原子数3至30的杂芳基烷基、碳原子数1至30的烷氧基、碳原子数1至30的烷基氨基、碳原子数6至30的芳氨基、碳原子数6至30的芳烷基氨基和碳原子数2至24的杂芳氨基构成的组的一个以上取代基取代，但不局限于所述示例。
[0045]
本发明的皮肤改善用组合物表现出皮肤美白、皱纹改善和抗污染，其可以包含齿叶风毛菊(saussurea neoserrata nakai)提取物。
[0046]
包含齿叶风毛菊提取物时，可以通过抑制黑色素的合成来增加对着色皮肤细胞的美白活性，并且通过抑制皮肤中活性氧的产生，可以展现出改善皮肤皱纹的效果。此外，当包含齿叶风毛菊提取物时，可增加皮肤对细尘的抵抗力。
[0047]
所述提取物的溶剂可以为选自由水、碳原子数1至10的醇和他们的混合物构成的组中的任一个。
[0048]
发明效果
[0049]
本发明提供一种功能性组合物，其采用天然物来源的成分，能表现出抗老化、皮肤皱纹改善和抗污染活性。
[0050]
本发明提供一种以包含新型有机化合物作为有效成分的皮肤改善用组合物及其用途。
附图说明
[0051]
图1是关于本发明的一实施例的组合物的细胞毒性评价结果的图。
[0052]
图2是关于本发明的一实施例的美白活性评价结果的图。
[0053]
图3是关于本发明的一实施例的抗老化和皮肤皱纹改善活性评价结果的图。
[0054]
图4是关于本发明的一实施例的抗污染效果的图。
[0055]
图5是关于本发明的一实施例的抗氧化和抗炎症活性的图。
[0056]
图6是本发明的一实施例的活性物质的1h-nmr分析结果。
[0057]
图7是本发明的一实施例的活性物质的
13
c-nmr分析结果。
[0058]
图8是本发明的一实施例的齿叶风毛菊提取物的细胞毒性实验结果。
[0059]
图9是关于本发明的一实施例的抑制由细尘引起的炎症效果的实验结果。
[0060]
图10是关于本发明的一实施例的抑制由细尘引起的炎症效果的实验结果。
[0061]
图11是关于本发明的一实施例的抗氧化效果的实验结果。
[0062]
图12是关于本发明的一实施例的抗氧化效果的实验结果。
[0063]
图13是关于本发明的一实施例的抗氧化效果的实验结果。
[0064]
图14是关于本发明的一实施例的抗氧化效果的实验结果。
[0065]
图15是关于本发明的一实施例的神经细胞活性物质分泌效果的实验结果。
[0066]
图16是关于本发明的一实施例的神经细胞活性物质分泌效果的实验结果。
[0067]
图17是关于本发明的一实施例的皮肤美白效果的实验结果。
具体实施方式
[0068]
以下，对本发明的实施例进行详细地说明，以使所属本发明的技术领域的技术人员容易地实施。然而，本发明可以以各种不同的形式实现，并不限于本文说明的实施例。
[0069]
在本发明中，“改善”可以指至少减小与状态的缓解或治疗有关的参数(例如症状的程度)的所有行为。
[0070]
在本发明中，“皮肤抗污染(anti-pollution)”是指改善由于细尘等的污染物质引起的皮肤污染、皮肤细胞凋亡或抑制皮肤细胞增殖，或皮肤状态不振。
[0071]
[制备例1：提取物的制备]
[0072]
1.齿叶风毛菊提取物的制备
[0073]
清洗齿叶风毛菊，并细切成一定大小，按照热水提取法制备了齿叶风毛菊提取物(sw)。另外，为确认溶剂的差异，用乙醇作为溶剂制备了齿叶风毛菊提取物(se)。
[0074]
2.其他植物提取物的制备
[0075]
为确认对所述齿叶风毛菊提取物(sw)的协同效应，按照热水提取法制备了作为复合提取物的材料的海竹笋提取物(nw)、鹿角菜提取物(tw)和扁浒苔提取物(ew)。
[0076]
3.混合提取物的制备
[0077]
为了确认根据所述提取物的混合效果的特性，制备了具有下表1所示组成的混合提取物。
[0078]
[表1]
[0079][0080][0081]
(单位：重量份)
[0082]
[实验例1：关于制备例的活性评价]
[0083]
1.细胞毒性评价
[0084]
为确认sw、se和m2、m6和m10的细胞毒性，利用各实施例按浓度处理raw264.7细胞和人皮肤角质细胞(hacat human keratinocyte cell line)，并实施mts分析(assay)。其结果在图1中示出。
[0085]
参照下述图1，在按浓度处理sw、se和m2、m6和m10的组中，可确认不存在细胞毒性的问题。由此可知，根据所述单一提取物和混合提取物的组成时，均不存在细胞毒性的问题。
[0086]
2.美白活性评价
[0087]
为评价所述制备例的细胞内黑色素(melanin)生成抑制活性，利用b16f10细胞系，通过与正常组比较细胞内黑色素(melanin)生成量来评价抑制率。为诱发黑色素(melanin)
生成，在培养基中处理α-msh或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylanthine，ibmx)，以促进黑色素(melanin)生成过程。去除培养基，并用pbs清洗细胞后，用1n氢氧化钠处理沉淀的细胞，离心后回收上清液，并检测吸光度，使用利用合成黑色素的检量线来评价黑色素的量。
[0088]
[黑色素生成抑制率(％)＝[(a-b)/a]*100]
[0089]
将使用纯净水的对照组(control)的黑色素生成率设定为100(％)，比较评价各制备例的黑色素生成率，计算各制备例的黑色素抑制率(％)并显示在下面的图2中。
[0090]
参照图2，可以确认，当使用齿叶风毛菊单一提取物时，可表现出相对优异的美白活性。尤其，可以确认，作为热水提取物的sw和作为乙醇提取物的se均显示优异的美白活性。
[0091]
另一方面，就复合提取物而言，可以确认，混合至一定浓度范围时，表现出协同效应，且就sw和nw的混合而言，使用m2和m3的混合范围时，表现出协同效应。尤其，可知，当超出一定的混合范围时，相比于各单一提取物，黑色素生成抑制率反而会减少。
[0092]
另外，可知tw和ew作为单一提取物本身具有相对较低的美白活性，但是当以如m5和m6的一定的混合比例与sw混合时，由于相互作用而产生的协同效应，与其他简单组合相比表现出非常优异的美白活性。
[0093]
另一方面，可知，将sw、nw、tw和ew全部混合时，可以看出m10和m11表现出相对优异的效果，但与m2、m3或m6、m7的混合物相比，黑色素合成抑制率降低。
[0094]
3.抗老化和皱纹改善活性评价
[0095]
通过对紫外线b(uvb)诱导的细胞凋亡的细胞保护效果，评价了对皮肤皱纹的改善效果。为此，对uvb暴露后的hacat细胞中的细胞存活率进行mtt分析(assay)。利用uvb以290～320nm、30分钟(min)、3次(times)的条件进行处理，并且为了客观比较，将未经所述制备例处理、但用uvb处理的组作为对照组(control)，并通过与所述对照组(control)的细胞存活率(100％)进行比较来完成评价。其结果显示在图3中。
[0096]
参照图3，可以看出，单一提取物中使用sw、se和nw时，由于细胞保护活性，其抗老化效果优异。另外，使用混合组成时，除m2、m3或m6、m7的混合组成之外，细胞保护活性由于混合反而降低。尤其，可以看出，当将sw、nw、tw和ew全部混合时，其细胞保护活性低于单一提取物。
[0097]
因此，可以确认，使用本发明时，可表现出改善由光老化导致的皮肤皱纹的效果。
[0098]
4.抗污染活性评价
[0099]
(1)抗过氧化氢的活性评价
[0100]
对hacat细胞未进行任何处理而设置对照组(control)、处理各制备例并分成各个组后，对各组用过氧化氢进行处理，进行mtt分析以确认对诱导了氧化应激的hacat细胞所产生的影响。通过用各制备例处理的各组与对照组(control)进行比较来评价抗过氧化氢的活性的评价。为进行客观评价，将对照组(control)的结果固定为1，并且将各制备例的结果以1至10的指数进行评价。所述指数越高表示抵抗性越好。
[0101]
其结果在图4中示出。
[0102]
(2)抗甲醛的活性评价
[0103]
用甲醛处理hacat细胞。同时，将未进行任何处理的组作为对照组(control)，并对
处理各制备例的组进行区分及培养。之后，加入mtt溶液(solution)培养后，处理dmso后检测吸光度以评价各实施例的细胞存活率。为进行客观评价，将对照组(control)的结果固定为1，并且将各结果与上述对照组(control)的结果进行比较，并以1至10的指数进行评价。所述指数越高表示抵抗性越好。
[0104]
其结果在图4中示出。
[0105]
(3)皮肤对芳香族化合物的抵抗性评价
[0106]
在洗涤硅胶试片之后，分别涂抹纯净水(对照组，control)和与纯净水混合的各实施例，并在上述硅胶试片浸渍在含500ppm的萘(naphtalene)、苊烯(acenaphthylene)、苊(acenaphthene)、芴(fluorene)、苯并芘(benzopyrene)的溶液后、在低温下干燥。之后，分析残留在各试片中的萘、苊烯、苊、芴和苯并芘的含量，并与对照组(control)进行比较。为进行客观评价，将对照组(control)的结果固定为1，并且将各制备例的结果以1至10的指数进行评价。所述指数越高表示抵抗性越好。
[0107]
其结果在图4中示出。
[0108]
(4)实验结果分析
[0109]
参照图4，就单一提取物而言，nw具有最优异的抗污染效果。而就sw和se而言，可以看出其效果几乎与nw相当。另一方面，就混合提取物而言，可确认使用m2、m3或m6、m7的混合组成时，表现出协同效应，单如果超出所述范围，则可以确认与单一提取物相比抵抗活性降低，或者没有出现由等量水平混合而产生的协同效应。
[0110]
另一方面，证实了当将sw、nw、tw和ew全部混合时，无法观察到对抗污染活性的协同效应。
[0111]
由此可以理解，就所述提取物而言，当将特定组成在特定范围内进行混合时，才能发挥根据相互作用的协同效应，由此提升对各有害物质的抵抗活性。
[0112]
5.抗氧化和抗炎活性评价
[0113]
(1)细胞内活性氧(ros)评价
[0114]
在hacat细胞中，使用二氯二氢荧光素二乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein diacetate，dcf-da)方法来评价由uvb(uvb(100mj/cm2)持续130分钟)产生的细胞内活性氧(ros)水平和本发明的保护作用。进行细胞内ros的影像分析，并将各实施例的结果与未经任何处理的uvb照射的对照组(control)进行比较来进行评价。将对照组(control)的结果固定为1，并且将各制备例的结果以1至10的指数进行评价。
[0115]
其结果在图5中示出。所述指数越高表示对活性氧的去除活性越好。
[0116]
(2)抗炎活性评价
[0117]
在区分处理所述制备例的组和未经处理的组(对照组，control)的hacat细胞中，用微粒pm10进行处理，并分析作为炎症介质因子的前列腺素e2(prostaglandin e2)的产生以测试对由细尘引起的炎症的抑制活性。评价结果与对照组(control)进行比较，将对照组(control)的指数固定为1，并且将各制备例的结果以1至10的指数进行比较评价。
[0118]
其结果在图5中示出。所述指数越高表示对由细尘引起的炎症的抑制活性越好。
[0119]
(3)实验结果分析
[0120]
参照图5，可以看出，使用sw或se时，可表现出优异的抗氧化和抗炎活性。另外，就混合提取物而言，可以看出，使用m2、m3或m6、m7的混合组成时，可表现出协同效应。与此相
反地，可确认，即使使用了混合提取物，但超出m2、m3或m6、m7的混合组成的情况下，抗氧化和抗炎症活性则会下降。另外，可知将sw、nw、tw和ew全部混合时，抗氧化和抗炎症活性比sw或se的单一组合物低。
[0121]
因此可以看出，单独使用sw或se或使用m2、m3或m6、m7范围的混合组成时，能够提供优异的功能性食品或外用剂。
[0122]
[制备例2：对齿叶风毛菊提取物的分级提取]
[0123]
对干燥并粉碎的齿叶风毛菊进行热水提取后，过滤以制备齿叶风毛菊提取物，并在45℃下减压浓缩，并将该浓缩物用水和乙酸乙酯(ethyl acetate)分级提取，水层用正丁醇(n-butanol)再次分级提取。对各层进行减压浓缩，制备了乙酸乙酯(etoac)、正丁醇(n-buoh)和水(h2o)级分。
[0124]
对n-buoh分级提取物实施硅胶柱色谱(silica gel columnchromatography)(chcl
3-meoh＝1:9)，以获得级分。其中，对级分(2fr.)(82mg)实施硅胶柱色谱(chcl
3-meoh＝1:9，)，以获得级分。分离纯化部分级分。将分离纯化的部分级分用sephdex lh-20柱层析(chcl3:meoh＝1:9，:meoh＝1:9，)进行纯化，分离出化合物1(fa，10.4mg)。
[0125]
[实验例2：从齿叶风毛菊分离的活性物质的分析]
[0126]
作为分析方法，通过1h-nmr和
13
c-nmr分析来分析活性成分。使用布鲁克(bruker)avance ii 400(1h nmr at 400mhz，
13
c nmr at 100mhz)进行分析。
[0127]
所述分析结果如图6和图7。
[0128]
就1h-nmr光谱而言，从δh7.46(1h，br.s，h-2)、δh7.44(1h，dd，j＝8.0，2.0hz,h-6)和δh6.81(1h，d，j＝8.0hz,h-5)中确认了三个烯烃次甲基质子信号(olefin methine proton signal)。由此，预期存在1,3,4三取代的苯环(benzene ring)。就
13
c-nmr光谱而言，确认了7个碳信号(carbon signal)。从δc170.8(c-7)的信号(signal)中，确认了羰基碳(carbonyl carbon)，从δc151.3(c-4)、δc145.9(c-3)、δc124.0(c-1)、δc123.9(c-6)、δc117.8(c-5)和δc115.8(c-2)的信号(signal)中，确认了1,3,4-苯环(1,3,4-benzene ring)的存在。
[0129]
根据分析结果，分析出以下述化学式表示的化合物对应于活性物质：
[0130][0131]
[实验例3：活性评价]
[0132]
1.材料和试剂
[0133]
作为细尘(urban particulate matter)使用了从城市空气污染源捕集的(pm10，sigma-aldrich，darmstadt，germany)平均粒径为10μm以下细尘。作为天然物使用了通过热水提取获得的海竹笋和齿叶风毛菊，而鹿角菜由康氏化妆品(gangs cosmetic)提供。齿叶风毛菊鉴定物质使用了从上述实验例1中分离的化合物，并购买使用作为类似物的原儿茶
酸烷基酯(protocatechuic acid alkyl ester)。
[0134]
本实验中使用的hacat、raw264.7、melan-a和hdf细胞系(cell line)购买自韩国细胞银行(korea cell line bank)，并使用含有1％抗菌-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)和10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，在37℃、5％co2的co2恒温箱中孵育。
[0135]
2.细胞毒性检测(ldh assay)
[0136]
hacat细胞(cell)的细胞毒性检测是通过利用乳酸脱氢酶(lactase dehydrogenase，ldh)释放的非放射性细胞毒性检测(non-radioactive cytotoxicity assay)进行检测的，将raw264.7细胞(cell)和hacat细胞以1
×
105细胞/孔(cells/well)接种在48孔板(48-well plate)(spl，韩国)中，培养18小时后，同时用各不同浓度的齿叶风毛菊水提取物进行处理，并培养24小时。在收集培养基之前的45分钟，将对照组细胞(control cell)用1x裂解缓冲液(lysis buffer)(promega，usa)进行处理并培养45分钟后，将培养基以3000rpm离心5分钟。加入50μl的离心获得的培养基和50μl重组底物混合物(reconstituted substrate mix)(promega，usa)，并在室温下反应30分钟，然后加入50μl终止液(stop solution)(promega，usa)以终止反应。使用酶标仪(microplate reader)在490nm处检测吸光度。并且，获得各样品组的平均吸光度值，并通过将其与对照组的吸光度值进行比较来检测出细胞毒性。
[0137]
实验结果如图8，确认到齿叶风毛菊热水提取物没有细胞毒性。
[0138]
3.抗细尘功效检测试验
[0139]
通过前列腺素e2(prostaglandin e2，pge2)表达效果试验来检测了由细尘pm10引起的炎症表达效果。将皮肤角质细胞(epithelial keratinocyte hacat cell)以1
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105细胞/孔(cells/well)接种在48孔板(48-well plate)(spl，韩国)中，培养18小时后，按各不同浓度处理细尘pm10，并培养24小时。在收集培养基之前的45分钟，将对照细胞(control cell)用1x裂解缓冲液(lysis buffer)(promega，usa)处理并培养45分钟后，将培养基以3000rpm离心5分钟。使用pge2 elisa测定试剂盒(pge2 elisa assay kit)(r&d system，usa)检测所获得的上清液的pge2表达量。将所有样品冷冻以-20℃以下的温度进行保存，直至定量。图9显示了在由细尘pm10引起的炎症表达中诱导前列腺素e2(prostaglandin e2，pge2)表达的效果，并且证实了在25μg/ml下诱导pge2表达的效果最高。
[0140]
将所述25μg/ml作为对照组，将齿叶风毛菊热水提取物(saussurea neo serrata)、原儿茶酸(protocatechuic acid)和原儿茶酸烷基酯(protocatechuic acid alkyl ester)分别以1μg/ml和2μg/ml进行处理，确认对由细尘pm10引起的pge2的抑制效果。实验结果如图10，可以看出，相比于仅使用齿叶风毛菊提取物的情况，单独用实验例2中分离的活性物质进行处理时，pge2抑制效果最优异。鉴于所述实验结果，可以说从齿叶风毛菊中分离出的活性物质对由细尘引起的炎症介质因此具有优异的抑制效果。
[0141]
4.细胞内抗氧化效果检测
[0142]
(1)照射紫外线b
[0143]
去除培养基后，用pbs洗涤hacat细胞，并添加能稍微覆盖细胞的程度的pbs，以此状态进行uvb照射。将细胞置于uv照射器中，并使用tl 20w/12rs荧光日光灯(fluorescent sun lamp)(飞利浦，荷兰)以275～380nm(最高达290～320nm)的波长进行照射。此时，附着ta 401/407kodacel滤光片(filter)(柯达，美国)，以去除从灯(lamp)中照射出的紫外线c
(uvc)，并用紫外辐照计(uv meter)(ultra-violet products ltd.，uvp，美国)检测照射到细胞的uv强度。
[0144]
(2)细胞内活性氧生成抑制效果检测(hydroxyl radical)
[0145]
为了在hacat细胞(cell)中，测量齿叶风毛菊提取物对通过uvb照射的细胞中羟自由基(hydroxyl radical)生成的抑制效果，用uvb(100mj/cm2)照射130分钟后，使用荧光探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(probe2',7'-dichlorofluorescein diacetate)(dcf-da：分子探针(molecular probe))检测细胞中的羟自由基(hydroxyl radical)浓度的变化。
[0146]
作为非荧光物质的dcf-da通过与细胞内的羟自由基(hydroxyl radical)和过氧化氢反应而转换为能发出荧光的二氯荧光素(dcf)，从而显示出绿色的荧光，因此基于上述原理，可通过dcf-da检测ros。将1
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104个hacat细胞(cell)接种到96孔板(96-well plate)(spl，韩国)中并培养18小时，同时以各不同浓度的齿叶风毛菊水提取物进行处理并培养24小时。培养完成后，去除培养基，然后用pbs洗涤(washing)两次。在各孔(well)中添加10μm的dcf-da，并在37℃、5％co2的培养箱中孵育90分钟，之后通过流式细胞仪检测荧光强度，并使用激光荧光显微镜(lsm 510，carl zeiss，德国)在
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400放大倍数下，以488nm(氩激光(argon laser))观察激发(excitation)波长，以505nm观察发射(emission)波长。由此观察给药后的细胞内荧光强度的变化。
[0147]
另外，还分别以1μg/ml的浓度利用原儿茶酸(protocatechuic acid)(作为从齿叶风毛菊提取物中分离出的活性物质)和原儿茶酸烷基酯(protocatechuic acid alkyl ester)，并使用相同方法比较和分析细尘pm10对pge2的抑制效果。
[0148]
实验结果如图11至14。图11是作为对照组测量由uvb照射引起的荧光强度的变化，而图12至图14是在此之后进行pge2抑制效果的试验结果，从实验结果可以看出，在作为从齿叶风毛菊提取物中分离出的活性物质的原儿茶酸(protocatechuic acid)处理组中，pge2抑制效果最优异。
[0149]
5.神经细胞活性物质分泌验证
[0150]
作为人源皮肤成纤维细胞使用了hdf细胞系(hdf cell line)，并利用10％fbs、100mg/l链霉素(streptomycin)、100000u/l青霉素(penicillin)的dmem培养基在37℃、10％co2的恒温箱中进行培养。
[0151]
将细胞以5
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105个细胞/孔(cells/well)的密度分配到6孔板(6well plate)稳定细胞后，针对每个孔(well)，将利用无血清培养液溶解的提取物以各不同浓度进行处理，孵育24小时后，去除培养基，并添加能稍微覆盖细胞的程度的pbs，之后进行uvb照射。
[0152]
将细胞置于uv照射器中，并使用tl20w/12rs荧光日光灯(fluorescent sun lamp)(飞利浦，荷兰)以275～380nm(最高达290～320nm)的波长进行辐照。此时，附着ta401/407kodacel滤光片(filter)(柯达，美国)，以去除从灯(lamp)中照射出的uvc，并用紫外辐照计(uv meter)(ultra-violet products ltd.，uvp，美国)检测照射到细胞的uv强度。
[0153]
将hdf细胞用提取样品和uvb处理后培养48小时，然后回收培养液，仅收集上清液，并使用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)试剂盒(kit)检测神经生长因子β(nerve growth factor-β)和神经营养因子-3(neurotrophin-3)的生成浓度。
[0154]
实验结果如图15和图16，可以看出，相比于其他组，齿叶风毛菊提取物处理组的神
经生长因子β(nerve growth factor-β)和神经营养因子-3(neurotrophin-3)的生成浓度低。
[0155]
6.美白功效检测试验
[0156]
melan-a细胞为永生化黑色素素细胞戏(immortalized melanocyte cell line)，将其用10％fbs、200nm tpa、100mg/l链霉素(streptomycin)、100000u/l青霉素(penicillin)的rpmi培养基在37℃的、10％co2恒温箱中进行培养。
[0157]
在6孔板(6well plate)中以每孔(well)2
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105个细胞的浓度分配细胞，48小时后，处理3天样品并收获细胞后，用1n naoh制备10％的dmso并溶解细胞(cell)，并在475nm处检测吸光度，并以相对于对照值的比率来表示样品处理组的黑色素(melanin)生成抑制功效。
[0158]
实验结果如图17，与已知对皮肤美白效果优异的熊果苷(arbutin)相比，可以看出，从齿叶风毛菊分离的活性物质表现出非常优异的黑色素生成抑制效果，由此可确认具有优异的美白活性功效。
[0159]
尽管上面已经详细描述了本发明的优选实施例，但是本发明的权利范围不限于此，利用在权利要求书中定义的本发明的基本概念的本领域技术人员的各种变形和改良也属于本发明的权利范围中。