本发明是有关于一种萃取方法，特别是指一种紫皮石斛抗氧化萃取物的制备方法。
背景技术：
抗氧化物，例如黄烷酮类(flavanones)抗氧化剂等，对心血管和神经系统的保护效果已经在许多研究中得到证实，而被广泛地应用于食品、保健品或保养品中。长期以来，人工合成的抗氧化物具有毒性及副作用，以至于广泛地倾向于用天然抗氧化物来取代。因此，如何有效地获得天然的抗氧化物，甚至是具有还原力的天然的抗氧化物，成为研究的重点。
技术实现要素：
本发明的目的，即在提供一种紫皮石斛抗氧化萃取物的制备方法。
于是，本发明紫皮石斛抗氧化萃取物的制备方法包含步骤(a)至步骤(b)。在该步骤(a)中，对紫皮石斛进行碎化处理及干燥处理，形成干燥物。在该步骤(b)中，将该干燥物与碳源、氮源及凝结芽孢杆菌混合，形成待发酵混合物，并对该待发酵混合物进行发酵处理，该氮源选自于奶粉、酵母萃取物、米糠或上述任意的组合。
本发明的有益效果在于：通过该发酵处理，该紫皮石斛抗氧化萃取物的制备方法能够有效地获得含有大量黄烷酮类(flavanones)的抗氧化物质的紫皮石斛抗氧化萃取物，甚至能够获得具有优异的还原力的紫皮石斛抗氧化萃取物。
具体实施方式
本发明紫皮石斛抗氧化萃取物的制备方法包含步骤(a)至步骤(b)。在该步骤(a)中，对紫皮石斛进行碎化处理及干燥处理，形成干燥物。在该步骤(b)中，将该干燥物与碳源、氮源及凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans，简称bc)混合，形成待发酵混合物，并对该待发酵混合物进行发酵处理，该氮源选自于奶粉、酵母萃取物、米糠或上述任意的组合。
以下将就本发明内容进行详细说明。
<步骤(a)>
紫皮石斛(学名为dendrobiumdevonianumpaxt)别名为紫皮兰，附生性草本植物，产于广西、贵州、云南及西藏等地，海拔1,850米的山地密林中树枝上。花期为每年4～5月。茎部呈直立圆柱形，多节状，节间长2.5～4厘米。叶质薄，为狭卵状披针形，长3～5厘米，宽0.7～1厘米，先端长渐尖，具有抱茎的鞘。花由茎上长出，为总状花序，具有1～2朵花，花瓣与花萼呈卵形，唇瓣为白色，前部带点紫色，狭短爪，与蕊柱基相连。在本发明的一些实施例中，该紫皮石斛来自中国云南省，且采用该紫皮石斛的茎部。
该碎化处理并无特别限制，只要能让该紫皮石斛变的细小即可。该碎化处理能够利用研磨机、切叶机或辗碎机等机械器具来进行。为避免该碎化处理破坏抗氧化物质，较佳地，该碎化处理是在低温下进行。该碎化处理的温度依据抗氧化物质的特性进行调整，例如但不限于20℃至30℃。该干燥处理并无特别的限制，且能够利用干燥机等机械器具来进行。该干燥机例如冷冻干燥机或热风干燥机等。在本发明的一些实施例中，使用冷冻干燥机，该干燥处理的温度为-35℃至-45℃、且时间为20小时至30小时。该干燥处理条件并不以上述为限，依据该干燥物所需的含水率进行调整，大致上，将该干燥物的含水率控制在6％至12％。该碎化处理与该干燥处理并无顺序或次数上的限制，依据所需的尺寸及含水率进行顺序或次数上的调整。在该碎化处理或该干燥处理后，进行尺寸筛选处理，例如利用筛网进行。在本发明的一些实施态样中，将该干燥物于20℃至30℃的环境下研磨成粉状后，使用网目数范围60目至100目的筛网进行过筛处理。
<步骤(b)>
在本发明的一些实施例的待发酵混合物中，该干燥物的浓度为1毫克/毫升至8毫克/毫升。
该凝结芽孢杆菌例如以寄存编号bcrc10606被寄存于中国台湾的食品工业发展研究所(foodindustryresearchanddevelopmentinstitute，firdi)的生物资源保存及研究中心(biosourcecollectionandresearchcenter，bcrc)的菌株。
在该待发酵混合物中，该氮源的浓度为20毫克/毫升至100毫克/毫升。在本发明的一些实施例的待发酵混合物中，该氮源的浓度为30毫克/毫升至84.1毫克/毫升。为获得具有更优异的还原力及更多的黄烷酮类的抗氧化物质，较佳地，该氮源包含酵母萃取物。
该碳源并无特别的限制，依据凝结芽孢杆菌进行选择。该碳源例如葡萄糖。在本发明的一些实施例中，该碳源为葡萄糖。在该待发酵混合物中，该碳源的浓度为20毫克/毫升至200毫克/毫升。在本发明的一些实施例的待发酵混合物中，该碳源的浓度为50毫克/毫升至174.1毫克/毫升。
在本发明的一些实施例中，该发酵处理的发酵温度为32℃至45℃且发酵时间为48小时。该发酵处理是在摇晃状态下进行。该摇晃状态是利用一台摇晃设备来产生圆周式摇晃。在本发明的一些实施例中，该摇晃状态的操作转速为100rpm。该摇晃设备例如往复式精密恒温振荡设备。
本发明将就以下实施例来作进一步说明，但应了解的是，所述实施例仅为例示说明用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1
步骤(a)：提供中国云南省种植的紫皮石斛，且采用该紫皮石斛的茎部，并利用一台切叶机对所述茎部进行碎化处理，形成平均尺寸为0.2厘米至0.5厘米的碎化物，然后，置于-40℃的环境中进行24小时的干燥处理，获得含水率为8％的干燥物。将该干燥物于25℃至30℃的环境下研磨成粉状后，利用网目数为80目的筛网进行过筛处理，获得过筛粉体。
步骤(b)：提供容置有第一混合液的第一锥形瓶、容置有第二混合液的第二锥形瓶，及第三混合液。以铝箔纸封住该第一锥形瓶及该第二锥形瓶的瓶口，并将该第一锥形瓶及该第二锥形瓶置于高压灭菌釜中，以121℃进行20分钟的灭菌处理，接着，将该第二混合液加入至该第一混合液中，然后，加入1毫升的第三混合液，形成待发酵混合物，在该待发酵混合物中，该干燥物的浓度为3毫克/毫升，葡萄糖(做为碳源)的浓度为100毫克/毫升，而酵母萃取物(作为氮源)的浓度为30毫克/毫升。将该待发酵混合物设置于一台往复式精密恒温振荡设备(厂商：hipoint；型号：sb-9d)的一处理槽内，并于摇晃状态下进行发酵处理，形成含有抗氧化物的混合物。该往复式精密恒温振荡设备的操作转速设定为100rpm。该发酵处理的发酵温度为37℃且发酵时间为48小时。该第一混合液的配制是将3克的酵母萃取物(作为氮源)及0.3克的步骤(a)的干燥物置于该第一锥形瓶中并加入去离子水至总体积为60毫升。该第二混合液的配制是将10克的葡萄糖(做为碳源)置于该第二锥形瓶中并加入去离子水至总体积为40毫升。该第三混合液的配制是利用以下步骤来获得：以三角玻棒均匀地将0.2毫升的包含凝结芽孢杆菌的菌液涂抹在容置有固态培养基的第一培养皿的固态培养基上，以让该菌液被该固态培养基吸收为止，接着，将该第一培养皿倒置并设置于37℃的培养箱中培养48小时，形成含有菌的第一培养物，该固态培养基包含葡萄糖(glucose)、胰化蛋白(tryptone)、酵母萃取物(yeastextract)、mnso4、kh2po4，及mncl2、洋菜粉。利用接种环从该第一培养物中取适量菌，并置于容置有上述固态培养基的第二培养皿中，该固态培养基的表面被划分为四个区域，接着，利用该接种环于该四个区域中划直线，而分离出单菌落，然后，将该第二培养皿倒置并设置于37℃的培养箱中培养48小时，形成含有菌的第二培养物。利用接种环从该第二培养物中取适量菌，并置于容置有液态培养基中，然后，设置于37℃的培养箱中培养48小时，获得该第三混合液。该液态培养基的配制是利用以下步骤来获得：将胰化蛋白、酵母萃取物、mnso4、kh2po4，及mncl2置于含有磁石的锥形瓶中，接着，加入去离子水至总体积为450毫升，然后，以该磁石进行搅拌至均匀，最后，以铝箔纸封住该锥形瓶的瓶口，而获得第一溶液。将葡萄糖置于含有磁石的锥形瓶中，接着，加入去离子水并搅拌至透明清澈，然后，再加入去离子水至总体积为50毫升，最后，以铝箔纸封住该锥形瓶的瓶口，而获得第二溶液。将该第一溶液与该第二溶液置于高压灭菌釜中，并以121℃进行20分钟的灭菌处理，然后，冷却至45℃，接着，将该第二溶液倒入至该第一溶液中，并混合均匀。
步骤(c)：将该含有抗氧化物的混合物进行过滤处理，而获得滤液，即为紫皮石斛抗氧化萃取物。
实施例2至39
实施例2至39与该实施例1的方法类似，不同在于：改变各步骤中的条件，参阅表1至表8。
比较例1
该比较例1与该实施例1的方法类似，不同在于：步骤(b)。在该比较例1的步骤(b)中，提供容置有第一混合液的第一锥形瓶、容置有第二混合液的第二锥形瓶，及第三混合液。以铝箔纸封住该第一锥形瓶及该第二锥形瓶的瓶口，并将该第一锥形瓶及该第二锥形瓶置于高压灭菌釜中，以121℃进行20分钟的灭菌处理，接着，将该第二混合液加入至该第一混合液中，然后，加入1毫升的第三混合液，形成待发酵混合物，在该待发酵混合物中，该干燥物的浓度为3毫克/毫升，葡萄糖(做为碳源)的浓度为100毫克/毫升，而酵母萃取物(作为氮源)的浓度为30毫克/毫升。将该待发酵混合物设置于一台往复式精密恒温振荡设备(厂商：hipoint；型号：sb-9d)的一处理槽内，并于摇晃状态下进行发酵处理，形成含有抗氧化物的混合物。该往复式精密恒温振荡设备的操作转速设定为100rpm。该发酵处理的发酵温度为37℃且发酵时间为48小时。该第一混合液的配制是将3克的酵母萃取物(作为氮源)及0.3克的步骤(a)的干燥物置于该第一锥形瓶中并加入去离子水至总体积为60毫升。该第二混合液的配制是将10克的葡萄糖(做为碳源)置于该第二锥形瓶中并加入去离子水至总体积为40毫升。该第三混合液的配制是利用以下步骤来获得：以三角玻棒均匀地将0.2毫升的包含副干酪乳酸杆菌(lactobacillusparacaseissp.paracasei，简称lpsp)的菌液涂抹在容置有mrs固态培养基的第一培养皿的mrs固态培养基上，以让该菌液被该mrs固态培养基吸收为止，接着，将该第一培养皿倒置并设置于37℃的培养箱中培养48小时，形成含有菌的第一培养物。利用接种环从该第一培养物中取适量菌，并置于容置有mrs固态培养基的第二培养皿中，该mrs固态培养基的表面被划分为四个区域，接着，利用该接种环于该四个区域中划直线，而分离出单菌落，然后，将该第二培养皿倒置并设置于37℃的培养箱中培养48小时，形成含有菌的第二培养物。利用接种环从该第二培养物中取适量菌，并置于容置有mrs液态培养基中，然后，设置于37℃的培养箱中培养48小时，获得该第三混合液，该mrs液态培养基的配制是将4克的mrs培养基置于含有磁石的锥形瓶中，接着，加入去离子水至总体积为500毫升，然后，以该磁石进行搅拌至均匀，最后，以铝箔纸封住该锥形瓶的瓶口。将该锥形瓶置于高压灭菌釜中，并以121℃进行20分钟的灭菌处理，然后，冷却至45℃。
比较例2至8
该比较例2至8与该比较例1的方法类似，不同在于：改变各步骤中的条件，参阅表9及表10。
评价项目
[总多酚类含量量测]
为能够清楚描述量测过程，以下以实施例1的滤液进行说明，而其余实施例及比较例皆依照该过程进行量测。将实施例1的滤液与乙醇溶液(包含乙醇及水，且该乙醇的浓度为95wt％)以振荡摇晃方式混合均匀，接着，利用一台转速设定在3500rpm的离心机进行5分钟的离心处理。接着，吸取1毫升的上清液并与1ml的乙醇溶液(包含乙醇及去离子水，且该乙醇的浓度为95wt％)、5毫升的去离子水、0.5毫升的50％(v/v)的folin-ciocalteu试剂(厂商：merck)混合，然后，静置于35℃的恒温水槽中5分钟，再加入1毫升碳酸钠溶液(包含碳酸钠及去离子水，且该碳酸钠的浓度为5wt％)，接着，静置于35℃的恒温水槽中60分钟，形成待测物，最后，利用一台双光束紫外光可见光光谱仪(厂牌：hitach；型号：u-2009)测定该待测物于波长为725nm的吸光值。提供不同浓度的没食子酸溶液[包含没食子酸(gallicacid)、乙醇、folin-ciocalteu试剂、碳酸钠，及去离子水]与725nm的吸光值的关系坐标图，并获得标准曲线公式。将该待测物的吸光值带入该标准曲线公式，而求得该实施例1的滤液中总多酚类含量，且单位为mg没食子酸/g。
[黄烷酮类含量量测]
为能够清楚描述量测过程，以下以实施例1的滤液进行说明，而其余实施例及比较例皆依照该过程进行量测。将实施例1的滤液与乙醇溶液(包含乙醇及水，且该乙醇的浓度为95wt％)以振荡摇晃方式混合均匀，形成混合液。将该混合液利用一台转速设定在3500rpm的离心机进行5分钟的离心处理。接着，吸取1毫升的上清液并与2ml的2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，简称dnp)溶液及2毫升的甲醇混合，然后，静置于50℃的恒温水槽中50分钟，接着，冷却并加入5毫升的氢氧化钾溶液(包含氢氧化钾及甲醇)，然后，静置2分钟，接着，取出1毫升并加入5毫升的甲醇，然后，利用转速设定在3500rpm的该离心机进行10分钟的离心处理，接着，取出1毫升的上清液并加入4毫升的甲醇，形成待测物，然后，以利用一台双光束紫外光可见光光谱仪(厂牌：hitach；型号：u-2009)测定该待测物于波长为494nm的吸光值。提供不同浓度的橙皮素溶液[包含橙皮素(hesperetin)、dnp溶液、甲醇、氢氧化钾，及去离子水]与494nm的吸光值的关系坐标图，并获得标准曲线公式。将该待测物的吸光值带入该标准曲线公式，而求得该实施例1的滤液中黄烷酮类含量，且单位为mg橙皮素/g。
[还原力量测]
提供ph为6.6的0.2m的磷酸缓冲液，是由0.2m的k2hpo4溶液及0.2m的kh2po4所配制而成。该0.2m的k2hpo4溶液是由0.7克的k2hpo4与20.023毫升的去离子水所形成。该0.2m的kh2po4溶液是由0.5克的kh2po4与18.37毫升的去离子水所形成。为能够清楚描述量测过程，以下以实施例1的滤液进行说明，而其余实施例及比较例皆依照该过程进行量测。将实施例1的滤液与甲醇混合均匀，形成2毫升的混合液。将该混合液与2ml的0.2m的磷酸缓冲液及1％(v/v)的赤血盐溶液以振荡摇晃方式混合均匀，然后，静置于50℃的恒温水槽中20分钟，接着，加入2毫升的10％(v/v)的三氯醋酸溶液，然后，利用一台转速设定在3000rpm的离心机进行10分钟的离心处理，接着，取出2毫升的上层液，并与2毫升的去离子水及0.4毫升的0.1％(v/v)的氯化铁溶液混合均匀，待10分钟后，形成待测物。然后，利用一台双光束紫外光可见光光谱仪(厂牌：hitach；型号：u-2009)测定该待测物于波长为700nm的吸光值。提供不同浓度的2,6-二丁基羟基甲苯(简称bht)溶液(包含bht、甲醇、0.2m的磷酸缓冲液、赤血盐、三氯醋酸、氯化铁，及去离子水)与700nm的吸光值的关系坐标图，并获得标准曲线公式。将该待测物的吸光值带入该标准曲线公式，而求得该实施例1的滤液的还原力，且单位为mg2,6-二丁基羟基甲苯/g。
铁离子还原抗氧化能力(ferricionreducingantioxidantpower，简称frap)量测：提供frap试剂，且该frap试剂是由50毫升且ph为3.6的第一溶液、5毫升的第二溶液及5毫升的第三溶液混合所配制而成，该第一溶液是将0.31克的醋酸钠及1.6毫升的醋酸(醋酸浓度为99.9)混合并加入去离子水至总体积为100毫升，该第二溶液是由20毫升且浓度为10mmol/l的2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪溶液{包含2,4,6-三(2-吡啶基)-s-三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，简称tptz]}与20毫升且浓度为40mmol/l的盐酸水溶液配制而成，而该第三溶液是浓度为20mmol/l的氯化铁溶液(包含氯化铁六水合物与水)。提供不同浓度的数个硫酸铁溶液[包含硫酸铁(feso4)与去离子水]，并将0.1毫升的所述硫酸铁溶液、0.3毫升去离子水及3毫升的frap试剂以振荡摇晃方式混合均匀，形成数个混合液，且将所述混合液置于37℃的水槽中反应30分钟，然后，利用一台双光束紫外光可见光光谱仪(厂牌：hitach；型号：u-2009)测定所述混合液于波长为593nm的吸光值，接着，将所述硫酸铁溶液的浓度与吸光值绘制出一关系坐标图，并获得一标准曲线公式。为能够清楚描述量测过程，以下以实施例1的滤液进行说明，而其余实施例及比较例皆依照该过程进行量测。将实施例1的滤液与甲醇混合均匀，形成2毫升的混合液。将0.1毫升的混合液、0.3毫升去离子水及3毫升的frap试剂以振荡摇晃方式混合均匀，接着，置于37℃的水槽中反应30分钟，形成待测物。然后，利用一台双光束紫外光可见光光谱仪(厂牌：hitach；型号：u-2009)测定该待测物于波长为593nm的吸光值。将该待测物的吸光值带入该标准曲线公式，而求得该实施例1的滤液的铁离子还原抗氧化能力，且单位为mg硫酸铁/g。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
综上所述，通过该发酵处理，该紫皮石斛抗氧化萃取物的制备方法能够有效地获得含有大量黄烷酮类(flavanones)的抗氧化物质的紫皮石斛抗氧化萃取物，甚至能够获得具有优异的还原力的紫皮石斛抗氧化萃取物，所以确实能达成本发明的目的。
惟以上所述者，仅为本发明的实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡是依本发明申请权利要求书及说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆仍属本发明涵盖的范围内。