精油纳米乳雾化吸入液在治疗过敏性鼻炎中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及精油纳米乳雾化吸入液及其在治疗过敏性鼻炎中的应用。


背景技术：

2.精油是从植物中提取所得到的挥发性油状混合成分，通常是从植物的花、叶、根、种子、果实、树皮、树脂、术心等部位通过水蒸气蒸馏法、冷压榨法、脂吸法或溶剂萃取法提炼萃取的挥发性芳香物质，一般安全性强。
3.精油的主要成分是由萜、酚、醇、醛、酮、酯、烯和醚等多种化合物与有机酸组成的混合物，并表现出不同的药理作用。薄荷油的主要成分为薄荷醇，具有清凉、止痛、止痒、祛痰、利胆、解痉、抗炎镇痛、抗菌抗病毒、促渗透和抑制中枢神经系统等多方面的药理作用。茶树油的主要成分为挥发油、萜类、鞣质、脂肪酸和脂类化合物等，有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、止咳化痰、镇静等作用，还有润滑、清新呼吸道系统及调节免疫，增强人体自身抵抗细菌病毒威胁的能力。薰衣草油的主要成分是芳樟醇、乙酸芳樟酯、桉树脑、b-罗勒烯、萜-4-醇和樟脑，可消炎、抗菌、抗病毒、抗痉挛、镇静、利胆等，也可帮助减轻身体过敏症状的影响，在预防过敏性炎症中起作用。柠檬油的主要成分是柠檬烯、柠檬醛、牛儿酸、香茅油、樟烯等，可以减少充血，支持淋巴系统排泄。
4.精油是由一些小分子组成，挥发性很强，一旦接触空气就会很快挥发。这些高挥发物质，可由鼻腔粘膜组织吸收进入身体，但直接作用于鼻黏膜会产生强烈刺激，影响了其应用和推广。
5.过敏性鼻炎是主要由免疫球蛋白e(ige)介导、免疫活性细胞和细胞因子参与的鼻腔黏膜变应性疾病，以阵发性反复打喷嚏、流鼻涕、鼻痒等为主要症状。过敏性鼻炎分为常年性和季节性，是上呼吸道常见的慢性炎症，中国发病率高达30％以上。目前，过敏性鼻炎作为一种慢性疾病已成为全球人类普遍关注的健康问题，不仅严重影响人们的生活质量，还给社会造成了沉重的经济负担。因此，对过敏性鼻炎的预防和治疗研究在现阶段显得尤为重要。过敏性鼻炎临床治疗常用抗组胺、鼻用糖皮质激素、白三烯和色酮类药物，但只能减轻症状，无法治愈，需长期使用，常产生耐受性，不良反应也较多。
6.纳米乳是由水相、油相、乳化剂与助乳化剂等自发形成，粒径在纳米范围的乳剂。它是热力学稳定、各向同性，透明或半透明的均相高度分散体系，可有效包裹油脂类化合物、提高生物利用度、增强靶向性等。
7.雾化吸入给药是将药液用雾化装置雾化成微小液滴，可随呼吸气流进入鼻腔，药物在鼻腔内分布均匀，剂量可控，鼻黏膜接触面积大，有利于发挥药效。局部用药直达病灶，不经过肝脏，肾脏代谢，副作用小，更具有安全性。


技术实现要素：

8.本发明公开了一种精油纳米乳雾化吸入液及其在治疗过敏性鼻炎中的应用。
9.本发明公开的精油纳米乳雾化吸入液，精油来自天然提取的挥发性油状混合成分。精油的种类没有限制，只要能有效治疗过敏性鼻炎就满足要求，优选自薄荷油、茶树油、薰衣草油及柠檬油，更优选的是薄荷油和茶树油。精油纳米乳雾化吸入液优选自薄荷油纳米乳雾化吸入液、茶树油纳米乳雾化吸入液、薰衣草油纳米乳雾化吸入液、柠檬油纳米乳雾化吸入液，更优选的是薄荷油纳米乳雾化吸入液、茶树油纳米乳雾化吸入液。
10.本发明公开的精油纳米乳雾化吸入液，精油能制备成纳米乳并能雾化吸入就可满足本发明的要求。一般地，精油纳米乳雾化吸入液的制备可采用以下步骤：
11.(1)将精油制备成水包油型精油初乳；
12.(2)将精油高度分散制得纳米乳雾化吸入液。
13.精油纳米乳雾化吸入液中，一般含有水相、油相、乳化剂、助乳化剂。乳化剂选自阴离子乳化剂、阳离子乳化剂、非离子型乳化剂、天然乳化剂。阴离子乳化剂选自脂肪酸皂、烷基磺酸酯、烷基苯基硫酸酯、磷酸酯。阳离子乳化剂选自胺类及季胺盐类。非离子型乳化剂选自聚氧乙烯型、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、多元醇的脂肪酸酯、聚乙烯醇。天然乳化剂选自磷脂、羊毛脂、阿拉伯树胶。乳化剂优选的是泊洛沙姆188、磷脂，更优选的是泊洛沙姆188与磷脂共同作为复合乳化剂。助乳化剂选自正丁醇、乙二醇、乙醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯，优选的是乙醇、丙二醇。
14.本发明中精油纳米乳雾化吸入液中乳化剂、助乳化剂的量没有限制，只要满足纳米乳雾化吸入液制剂要求和治疗要求就可以。当选择泊洛沙姆188与磷脂共同作为复合乳化剂、乙醇作为助乳化剂时，优选的泊洛沙姆188与乙醇质量比为1∶20～1∶5，更优选的是1∶10；优选的精油纳米乳雾化吸入液中磷脂含量是0.3％～0.7％，更优选的是0.5％。
15.精油初乳高度分散制得精油纳米乳雾化吸入液的方法可参考相关文献和专业技术数据，工艺过程采用磁力搅拌、匀浆、高压均质、剪切乳化搅拌等，优选的是高压均质、剪切乳化搅拌，更优选的是高压均质。
16.当采用高压均质制备精油纳米乳雾化吸入液时，可以采用下述步骤：将处方量磷脂溶于乙醇；取处方量泊洛沙姆188溶于水，加入精油，混匀；缓慢加入磁力搅拌的磷脂溶液中，得到精油初乳；用高压均质机均质化，得到精油纳米乳雾化吸入液。
17.精油纳米乳雾化吸入液可置于雾化发生器中，按照雾化发生器的使用说明，就可以将精油纳米乳雾化吸入液雾化成极细的精油雾滴。通过吸入精油雾滴，可达到治疗过敏性鼻炎的作用。
18.精油纳米乳雾化吸入液用于治疗过敏性鼻炎。过敏性鼻炎可以是遗传因素导致的过敏性鼻炎；也可以是变应原暴露诱导的过敏性鼻炎，变应原多来源于动物、植物、昆虫、真菌或职业性物质，其成分是蛋白质或糖蛋白，极少数是多聚糖。人或动物的过敏性鼻炎可通过吸入雾化的精油雾滴进行治疗。
19.本发明中的精油纳米乳雾化吸入液选自薄荷油纳米乳雾化吸入液、茶树油纳米乳雾化吸入液、薰衣草油纳米乳雾化吸入液、柠檬油纳米乳雾化吸入液，优选自薄荷油纳米乳雾化吸入液、茶树油纳米乳雾化吸入液，更优选的是薄荷油纳米乳雾化吸入液。精油纳米乳雾化吸入液经雾化吸入对过敏性鼻炎有较强的治疗效果，特别是薄荷油纳米乳雾化吸入液对过敏性鼻炎的治疗效果最佳，茶树油纳米乳雾化吸入液次之。精油纳米乳雾化吸入液雾化后形成均匀细小的液滴吸入分布于鼻黏膜，局部用药直达病灶，疗效高、刺激小、顺应性
好。薄荷油市场易得，制成的纳米乳具有安全性高、效果好、成本低的优势。
20.本发明针对精油易产生鼻黏膜刺激性的问题，设计并制备了高度分散和稳定的精油纳米乳雾化吸入液，并采用雾化吸入给药方式，不仅提高了精油的稳定性，而且达到很好的过敏性鼻炎治疗效果。本发明为过敏性鼻炎的治疗提供了一种新方法，具有较高的实际应用价值。
附图说明
21.图1.精油纳米乳雾化吸入液外观照片(a)不同分散方法对薄荷油纳米乳雾化吸入液外观的影响(a，磁力搅拌；b，高速分散；c，高压均质1次；d，高压均质2次；e，高压均质3次)(b)高压均质2次制备的各精油纳米乳雾化吸入液(f，薄荷油纳米乳雾化吸入液；g，茶树油纳米乳雾化吸入液；h，薰衣草油纳米乳雾化吸入液；i，柠檬油纳米乳雾化吸入液)
22.图2.各精油纳米乳雾化吸入液对过敏性鼻炎小鼠治疗后鼻腔黏膜组织he染色病理切片照片(
×
200)(healthy：健康对照组；model：鼻炎模型组；bn：空白纳米乳雾化吸入液对照组；pon：薄荷油纳米乳雾化吸入液治疗组；tton：茶树油纳米乳雾化吸入液治疗组；laon：薰衣草油纳米乳雾化吸入液治疗组；leon：柠檬油纳米乳雾化吸入液治疗组；pulmicort：吸入用布地奈德混悬液组
23.图3.小鼠血清中ige(a)、ifn-γ(b)、il-4(c)和il-6(d)的含量(healthy：健康对照组；model：鼻炎模型组；bn：空白纳米乳雾化吸入液对照组；pon：薄荷油纳米乳雾化吸入液治疗组；tton：茶树油雾化吸入液纳米乳治疗组；laon：薰衣草油纳米乳雾化吸入液治疗组；leon：柠檬油纳米乳雾化吸入液治疗组；pulmicort：吸入用布地奈德混悬液组。n＝3，
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p＜0.05，
##
p＜0.01，
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p＜0.001vs.healthy；
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，vs.model.)
具体实施方式
24.实施例1.薄荷油纳米乳雾化吸入液
25.取0.525g磷脂溶于7g乙醇；另取0.7g泊洛沙姆188溶于105ml水，加入0.525g薄荷油，混匀；缓慢加入磁力搅拌的上述磷脂溶液中，得到薄荷油初乳；然后用高压均质机均质化2次，得到薄荷油纳米乳雾化吸入液。
26.薄荷油纳米乳雾化吸入液外观澄清透明，稳定，不分层(图1f)。用纳米激光粒度仪测得薄荷油纳米乳雾化吸入液的平均粒径约为27.50nm，多分散指数pdi为0.173，电位为-28.6mv。薄荷油纳米乳雾化吸入液置于60℃恒温箱4h，其粒径变为31.59nm，pdi为0.264，电位为-32.0mv；置于-20℃冰箱12h，取出并恢复至室温及复溶后，其粒径变为28.85nm，pdi为0.291，电位为-26.7mv；置于40℃恒温箱5天，其粒径变为27.87nm，pdi为0.256，电位为-26.8mv。薄荷油纳米乳雾化吸入液在各种条件下均未发现分层、破乳、沉淀等现象，保持澄清透明，平均粒径及zeta电位无明显变化。
27.上述结果说明薄荷油纳米乳雾化吸入液可耐受高温和冷冻。按照上述相近步骤制备得到的其他精油纳米乳雾化吸入液也都很稳定。
28.将上述步骤中薄荷油初乳经过磁力搅拌处理，得到的乳液呈不透明浑浊状态(图1a)；如果用机械搅拌桨高速搅拌，得到的乳液也呈不透明浑浊状态(图1b)；如果用高压均
质机均质化1次，得到的乳液呈基本透明状态(图1c)；如果用高压均质机均质化2次，得到的乳液呈透明状态(图1d)；如果用高压均质机均质化2次，得到的乳液呈基本透明状态(图1e)。因为高压均质机均质化可以得到粒径小稳定的精油纳米乳，并且均质化2次和3次基本无区别，所以最后步骤选择将精油初乳进行2次均质化。
29.实施例2.茶树油纳米乳雾化吸入液
30.取0.525g磷脂溶于7g乙醇；另取0.7g泊洛沙姆188溶于105ml水，加入0.525g茶树油，混匀；缓慢加入磁力搅拌的上述磷脂溶液中，得到茶树油初乳；然后用高压均质机均质化2次，得到茶树油纳米乳雾化吸入液。
31.茶树油纳米乳雾化吸入液外观澄清透明，稳定，不分层(图1g)。用纳米激光粒度仪测得茶树油纳米乳雾化吸入液的平均粒径约为20.03nm，pdi为0.287，电位为-26.4mv。茶树油纳米乳雾化吸入液置于60℃恒温箱4h，其粒径变为25.62nm，pdi为0.269，电位为-27.9mv；置于-20℃冰箱12h，取出并恢复至室温及复溶后，其粒径变为22.74nm，pdi为0.124，电位为-26.1mv；置于40℃恒温箱5d，其粒径变为27.49nm，pdi为0.284，电位为-25.6mv。茶树油纳米乳雾化吸入液在上述各种条件下均未发现分层、破乳、沉淀等现象，保持澄清透明，平均粒径及zeta电位无明显变化。因此茶树油纳米乳雾化吸入液可耐受高温和冷冻。
32.实施例3.薰衣草油纳米乳雾化吸入液
33.取0.525g磷脂溶于7g乙醇；另取0.7g泊洛沙姆188溶于105ml水，加入0.525g薰衣草油，混匀；缓慢加入磁力搅拌的上述磷脂溶液中，得到薰衣草油初乳；然后用高压均质机均质化2次，得到薰衣草油纳米乳雾化吸入液。
34.薰衣草油纳米乳雾化吸入液外观澄清透明，稳定，不分层(图1h)。用纳米激光粒度仪测得薰衣草油纳米乳雾化吸入液的平均粒径约为24.28nm，pdi为0.183，电位为-30.5mv。薰衣草油纳米乳雾化吸入液置于60℃恒温箱4h，其粒径变为28.87nm，pdi为0.142，电位为-25.9mv；置于-20℃冰箱12h，取出并恢复至室温及复溶后，其粒径变为26.56nm，pdi为0.233，电位为-25.3mv；置于40℃恒温箱5d，其粒径变为27.59nm，pdi为0.156，电位为-24.4mv。薰衣草油纳米乳雾化吸入液在上述各种条件下均未发现分层、破乳、沉淀等现象，保持澄清透明，平均粒径及zeta电位无明显变化。因此薰衣草油纳米乳雾化吸入液可耐受高温和冷冻。
35.实施例4.柠檬油纳米乳雾化吸入液
36.取0.525g磷脂溶于7g乙醇；另取0.7g泊洛沙姆188溶于105ml水，加入0.525g柠檬油，混匀；缓慢加入磁力搅拌的上述磷脂溶液中，得到柠檬油初乳；然后用高压均质机均质化2次，得到柠檬油纳米乳雾化吸入液。
37.柠檬油纳米乳雾化吸入液外观澄清透明，稳定，不分层(图1i)。用纳米激光粒度仪测得柠檬油纳米乳雾化吸入液的平均粒径约为25.83nm，pdi为0.287，电位为-25.6mv。柠檬油纳米乳雾化吸入液置于60℃恒温箱4h，其粒径变为26.82nm，pdi为0.254，电位为-25.8mv；置于-20℃冰箱12h，取出并恢复至室温及复溶后，其粒径变为21.99nm，pdi为0.282，电位为-32.4mv；置于40℃恒温箱5d，其粒径变为28.44nm，pdi为0.290，电位为-27.5mv。柠檬油纳米乳雾化吸入液在上述各种条件下均未发现分层、破乳、沉淀等现象，保持澄清透明，平均粒径及zeta电位无明显变化。因此柠檬油纳米乳雾化吸入液可耐受高温
和冷冻。
38.实验例1.精油纳米乳雾化吸入液对过敏性鼻炎小鼠的雾化吸入治疗效果
39.材料：按照实施例1制备的薄荷油纳米乳雾化吸入液、实施例2制备的茶树油纳米乳雾化吸入液、实施例3制备的薰衣草油纳米乳雾化吸入液、实施例4制备的柠檬油纳米乳雾化吸入液、吸入用布地奈德混悬液(商品名pulmicort)。按照实施例1的步骤，但不加薄荷油，制备得到空白纳米乳雾化吸入液。
40.方法：用生理盐水配制卵清蛋白ova及al(oh)3均匀混悬液，小鼠腹腔注射上述混悬液0.2ml(含ova 20μg和al(oh)32mg)，每2日注射1次，共7次，首次注射日期作为第1日。第15日用10％ova生理盐水溶液滴鼻，每侧鼻孔各10μl，1日1次，共10次。鼻炎症状评分标准是记录最后一次免疫刺激后30min内，以及治疗结束后30min内地鼻腔症状，包括喷嚏、流涕、鼻痒。各症状分别记分，包括喷嚏1～3个，流涕至鼻孔外，或轻微挠鼻分别计1分；打喷嚏11个以上，涕流满面，或剧烈挠鼻分别计3分；处于上述症状之间分别计2分。5分以上表示过敏性鼻炎模型建立成功。
41.将48只健康雄性balb/c小鼠随机分为8组，每组6只，分别为健康对照组、模型组(不给药)、空白纳米乳雾化吸入液对照组、薄荷油纳米乳雾化吸入液治疗组、茶树油纳米乳雾化吸入液治疗组、薰衣草油纳米乳雾化吸入液治疗组、柠檬油纳米乳雾化吸入液治疗组，以及阳性药吸入用布地奈德混悬液治疗组。除健康对照组及模型组外，其余6组分别给予相应的药物治疗。每组小鼠置于透明密闭长方体容器(25cm
×
20cm
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15cm)。药物雾化后以气溶胶方式充满于上述容器中。每日雾化治疗1次，每次30min，共7次。容器两侧各有一个小孔，用于气溶胶进入和气体流通。治疗结束后，观察小鼠鼻部症状，次日小鼠摘取眼球，取血。血样在室温下放置0.5h，在4℃下4000r/min离心10min，收集上层血清，-80℃保存备用。用elisa试剂盒检测各组血清中ige、ifn-γ、il-4和il-6炎性因子含量。小鼠取血后处死，剔除鼻表面毛，取出鼻翼和鼻中隔黏膜，用4％多聚甲醛固定，he染色，在显微镜下观察鼻黏膜组织。
42.结果：健康对照组小鼠未出现喷嚏、流涕、鼻痒等过敏性鼻炎症状；模型组及空白纳米乳雾化吸入液对照组小鼠仍然表现出喷嚏、流涕、鼻痒等鼻炎症状；其余各精油纳米乳雾化吸入液治疗组小鼠喷嚏、流涕、鼻痒等鼻炎症状减轻明显，均有显著的治疗效果，其中薄荷油纳米乳雾化吸入液、茶树油纳米乳雾化吸入液及吸入用布地奈德混悬液组治疗前后差异较大，表明这两种精油纳米乳雾化吸入液在改善过敏性鼻炎症状方面有显著的疗效，与阳性药吸入用布地奈德混悬液的治疗效果相近。健康对照组小鼠鼻腔黏膜组织结构完整、平滑、没有腺体增生、无炎性细胞浸润；模型组及空白纳米乳雾化吸入液对照组鼻黏膜组织脱落坏死、腺体增生，鼻黏膜水肿、组织间隙出血，有明显炎性细胞浸润；精油纳米乳雾化吸入液治疗组炎性细胞浸润大幅度减少，鼻黏膜肿胀减轻，可见少量腺体组织；吸入用布地奈德混悬液对照组可见少量炎性细胞浸润，腺体增生少见(图2)。模型组小鼠血清的免疫球蛋白ige以及免疫细胞因子il-4和il-6的水平明显高于健康对照组，但ifn-γ水平较低，差异具有统计学意义(p＜0.001)。空白纳米乳雾化吸入液对照组与模型组相比均没有统计学差异。各精油纳米乳雾化吸入液及吸入用布地奈德混悬液治疗组均能降低炎性因子ige、il-4和il-6水平，与模型组相比具有统计学差异(p＜0.05)。而在ifn-γ炎性因子的测定结果中，只有薄荷油纳米乳雾化吸入液、茶树油纳米乳雾化吸入液以及吸入用布地奈德混悬
液治疗组与模型组相比具有统计学差异(p＜0.05)，薰衣草油纳米乳雾化吸入液及柠檬油纳米乳雾化吸入液治疗组与模型组比较无统计学差异。同时各精油纳米乳雾化吸入液及吸入用布地奈德混悬液治疗组与健康对照组比较后发现，ige和il-6均无显著差异，但ifn-γ和il-4呈现不同程度的差异(图3)。
43.实验例2.薄荷油纳米乳雾化吸入液对过敏性鼻炎患者的雾化吸入治疗效果考察
44.材料：按照实施例1制备的薄荷油纳米乳雾化吸入液。
45.方法：对100名过敏性鼻炎患者进行薄荷油纳米乳雾化吸入液雾化吸入治疗，每日雾化治疗2次，每次3～5min，连用5天。治疗结束后，观察患者的症状(鼻子发痒、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、流鼻血、眼睛发痒、咳嗽、头疼、影响睡眠、胸闷)改善情况。
46.结果：薄荷油纳米乳雾化吸入液过敏性鼻炎有良好的治疗效果。其中，对于鼻子发痒症状，明显改善的患者占24％，轻微改善的占31％；对于打喷嚏症状，明显改善的患者占37％，轻微改善的占26％；对于鼻塞症状，明显改善的患者占45％，轻微改善的占27％；对于流鼻血症状，明显改善的患者占46％，轻微改善的占10％；对于眼睛发痒症状，明显改善的患者占35％，轻微改善的占20％；对于咳嗽症状，明显改善的患者占36％，轻微改善的占13％；对于头疼症状，明显改善的患者占50％，轻微改善的占11％；对于影响睡眠症状，明显改善的患者占52％，轻微改善的占26％；对于胸闷症状，明显改善的患者占60％，轻微改善的占7.5％。