一种治疗子宫颈癌的中药泡腾片及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药领域，具体的说涉及一种治疗子宫颈癌的中药泡腾片及其制备方法和应用。

背景技术：

子宫颈癌是全球女性常见的妇科恶性肿瘤，是威胁女性身体健康和生命安全的疑难症之一。who的近期报道显示，世界每年约增加50万个宫颈癌病例，而80％的病例发生在发展中国家。2019年我国癌症中心发布的发病率前十的癌症中宫颈癌排第八位，在青年女性癌症中发病率排第三位，仅次于乳腺癌和甲状腺癌。国内外文献资料显示，近99％的女性患子宫颈癌的原因与致瘤病毒hpv的感染史有关。子宫颈部位的反复感染、发生炎症、宫颈糜烂至癌变是个主要的病理过程。

虽然抗hpv病毒疫苗的试用、抗感染的治疗、积极预防以及癌变子宫颈的放化疗或子宫切除术等一系列措施在运用，但是由于子宫颈癌的生理病理特征的复杂性，此种疾病仍然是需攻克的人类妇科肿瘤中的疑难症。癌症的传统化疗药物虽然疗效高，然而因为对人体产生的严重毒副作用，导致全程化疗难以忍受及不很完善，此病的复发率较高，两年至5年生存率仍较低。

中药和维吾尔药在子宫颈癌的治疗上有一定的意义，然而由于治疗方法比较传统，药物制剂的抗癌药效的物质基础不太明确，制剂工艺简单，活性成分含量低等原因，在宫颈癌的治疗上仍处于不做首选的治疗措施，同时由于原处方中的阴道栓剂对温度比较敏感，遇到较高的气温时容易液化，需要在冰箱里保存，即其稳定性较差，保存和运输不方便。

因此改善中药和维吾尔药的制备工艺，用现代药学方法研发一种有效低毒的、稳定性高的新型抗子宫颈癌制剂是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种以中药和维吾尔药为基础的治疗子宫颈癌的中药泡腾片；

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

治疗子宫颈癌的中药泡腾片，包括以下重量份原料，胀果甘草标准提取物4-10份、石榴皮标准提取物0.1-3份、高良姜标准提取物0.5-4份、没食子标准提取物0.5-3份、柠檬酸1份、碳酸氢钠1份、辅料基质5-20份。

进一步，上述辅料基质为可溶性淀粉、微晶纤维素、明矾、、聚维酮k30、硬脂酸镁中的一种或多种混合。

本发明的有益效果在于：本发明：以维吾尔医学及现代医学理论为指导，在维医中以石榴皮、没食子等为君药的用于杀菌消炎、燥湿收敛、抗宫颈炎和宫颈糜烂的医学配方的基础上，增加胀果甘草和高良姜，优化配方组成；制成宫颈泡腾片，增加了有效组分分量和技术含量、扩大了功效范围、提高了药理效果和应用价值，本发明泡腾片在当前高发妇科肿瘤-子宫颈癌的干预治疗中具有良好的应用价值。

本发明还提供了上述治疗子宫颈癌的中药泡腾片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按上述重量份数称取各原料；

(2)将胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物混合搅拌均匀，得到混合提取物；

(3)将混合提取物与辅料基质分成两份，将柠檬酸和第一份辅料基质混合后加入3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将碳酸氢钠与第二份辅料基质混合后加入3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将制备的软材分别制粒，用鼓风干燥箱进行干燥，将干燥后的颗粒过分别整粒，合并颗粒，加润滑剂混匀后置于单冲压片机，用椭圆形冲模压片制成泡腾片，即得治疗子宫颈癌的中药泡腾片。

进一步，上述胀果甘草标准提取物的制备方法为：将胀果甘草进行粉碎并过筛得到胀果甘草粉，将胀果甘草粉3-8倍量的浓度乙醇超声辅助提取，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏依次用聚酰胺和ab-8大孔吸附树脂进行精制纯化，即得胀果甘草标准提取物；

上述石榴皮标准提取物的制备方法为：将石榴皮进行粉碎并过筛得到石榴皮粉，将石榴皮粉3-12倍量的浓度乙醇提取，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用amberlitexad-16大孔吸附树脂纯化，即得石榴皮标准提取物；

上述高良姜标准提取物的制备方法为：将高良姜进行粉碎并过筛得到高良姜粉，将高良姜粉3-12倍量的浓度乙醇提取，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用xda-6大孔树脂进行精制纯化，即得高良姜标准提取物；

上述没食子标准提取物的制备方法为：将没食子进行粉碎并过筛得到没食子粉，将没食子粉3-9倍量的浓度乙醇提取，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用d301大孔树脂进行精制纯化，即得没食子标准提取物。

采用上述进一步的有益效果在于：本发明制得的胀果甘草标准提取物中有效组分含量为22.5％至58％；石榴皮标准提取物中有效组分含量为12.5％至26.8％；高良姜标准提取物中有效组分含量为35.5％至68.5％；没食子标准提取物中有效组分含量为11.8％至28.1％。本发明提取方法简单、可行性高，提取效果远高于传统方案。

更进一步，上述胀果甘草、石榴皮、高良姜和没食子的过筛粒度均为10-90目。

更进一步，上述胀果甘草粉的乙醇提取浓度为30-95％，提取温度为60-85℃，每次提取时间为0.5-3h，超声辅助提取次数为2-3次；

石榴皮粉的乙醇提取浓度为30-85％，提取温度为50-85℃，每次提取时间为1-6h，提取次数为2-3次；

高良姜粉的乙醇提取浓度为35-95％，提取温度为45-85℃，每次提取时间为0.5-3.5h，提取次数为2-3次；

没食子粉的乙醇提取浓度为25-65％，提取温度为15-45℃，每次提取时间为2-11h，提取次数为2-3次。

进一步，上述步骤(3)中搅拌速率为90转/min，搅拌时间为10min。

步骤(3)中所述泡腾片的制备步骤步骤(3)中所述制粒粒度为14目，整粒粒度为12目；鼓风干燥箱干燥温度为50℃，干燥时间为2.5h。

与现有技术相比本发明的有益效果在于：本发明从中药和天然药物中寻找抗癌活性明确的有效组分和天然有效成分，并将其作为物质基础，用现代药学方法，对有效组分进行富集和精制，通过现代药理实验验证其抗癌活性，并将其作为抗癌药效的物质基础，以天然药为主研发有效低毒的新型抗癌制剂在中药的现代化研究及子宫颈癌的药物干预治疗中具有一定的意义。

附图说明

图1为本发明以胀果甘草对照药材和标志成分甘草查尔酮a来鉴定本发明泡腾片的薄层鉴定特征图；

图2为本发明以高良姜提取物和对照品高良姜素鉴定本发明泡腾片的薄层鉴定特征图；

图3为本发明以石榴皮提取物和鞣酸对照品鉴定本发明泡腾片的薄层鉴定特征图；

图4为本发明以没食子提取物和没食子酸对照品鉴定本发明泡腾片的薄层鉴定特征图；

图5为甘草查耳酮a和顺铂对siha细胞凋亡实验结果图；

图6为甘草查耳酮a和顺铂对siha细胞作用24h周期结果；

图7为甘草查耳酮a不同浓度对mrna相对表达强度影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

治疗子宫颈癌的中药泡腾片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胀果甘草进行粉碎并过筛90目得到胀果甘草粉，将胀果甘草粉8倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为30％，提取温度为85℃，每次提取0.5h，超声辅助提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏依次用聚酰胺和ab-8大孔吸附树脂进行精制纯化，即得胀果甘草标准提取物；

上述石榴皮标准提取物的制备方法为：将石榴皮进行粉碎并过筛得到石榴皮粉，将石榴皮粉3-12倍量的浓度乙醇提取，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用amberlitexad-16大孔吸附树脂纯化，即得石榴皮标准提取物；

将高良姜进行粉碎并过筛90目得到高良姜粉，将高良姜粉12倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为35％，提取温度为85℃，每次提取3.5h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用xda-6大孔树脂进行精制纯化，即得高良姜标准提取物；

将没食子进行粉碎并过筛90目得到没食子粉，将没食子粉9倍量的浓度乙醇提取，没食子粉的乙醇提取浓度为25％，提取温度为45℃，每次提取11h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用d301大孔树脂进行精制纯化，即得没食子标准提取物。

(2)称取胀果甘草标准提取物10kg、石榴皮标准提取物0.1kg、高良姜标准提取物0.5kg、没食子标准提取物3kg、辅料基质13.6kg；

辅料基质为可溶性淀粉、微晶纤维素、明矾、柠檬酸、碳酸氢钠、聚维酮k30、硬脂酸镁；

(3)将胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物混合搅拌均匀，得到混合提取物；

(4)将混合提取物分成两份，一份加柠檬酸和其它辅料基质混合，另一份加碳酸氢钠和其它辅料基质混合，混匀后均加3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将制备的软材分别过14目制粒，50℃鼓风干燥箱干燥2.5h，将干燥后的颗粒过分别12目整粒，合并颗粒，加润滑剂混匀后置于单冲压片机，用椭圆形冲模压片制成泡腾片，即得治疗子宫颈癌的中药泡腾片。

实施例2

治疗子宫颈癌的中药泡腾片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胀果甘草进行粉碎并过筛10目得到胀果甘草粉，将胀果甘草粉3倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为95％，提取温度为6℃，每次提取0.5h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏依次用聚酰胺和ab-8大孔吸附树脂进行精制纯化，即得胀果甘草标准提取物；

将石榴皮进行粉碎并过筛10目得到石榴皮粉，将石榴皮粉3倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为85％，提取温度为50℃，每次提取1h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用amberlitexad-16大孔吸附树脂纯化，即得石榴皮标准提取物；

将高良姜进行粉碎并过筛10目得到高良姜粉，将高良姜粉3倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为95％，提取温度为45℃，每次提取0.5h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用xda-6大孔树脂进行精制纯化，即得高良姜标准提取物；

将没食子进行粉碎并过筛10目得到没食子粉，将没食子粉3倍量的浓度乙醇提取，没食子粉的乙醇提取浓度为65％，提取温度为15℃，每次提取2h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用d301大孔树脂进行精制纯化，即得没食子标准提取物。

(2)称取胀果甘草标准提取物4kg、石榴皮标准提取物3kg、高良姜标准提取物4kg、没食子标准提取物0.5kg、11.5kg；

辅料基质为可溶性淀粉、微晶纤维素、明矾、柠檬酸、碳酸氢钠、聚维酮k30、硬脂酸镁；

(3)将胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物混合搅拌均匀，得到混合提取物；

(4)将混合提取物分成两份，一份加柠檬酸和其它辅料基质混合，另一份加碳酸氢钠和其它辅料基质混合，混匀后均加3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将制备的软材分别过14目制粒，50℃鼓风干燥箱干燥2.5h，将干燥后的颗粒过分别12目整粒，合并颗粒，加润滑剂混匀后置于单冲压片机，用椭圆形冲模压片制成泡腾片，即得治疗子宫颈癌的中药泡腾片。

实施例3

治疗子宫颈癌的中药泡腾片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胀果甘草进行粉碎并过筛60目得到胀果甘草粉，将胀果甘草粉6倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为60％，提取温度为75℃，每次提取2h，超声辅助提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏依次用聚酰胺和大孔树脂进行精制纯化，即得胀果甘草标准提取物；

将石榴皮进行粉碎并过筛60目得到石榴皮粉，将石榴皮粉6倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为60％，提取温度为75℃，每次提取2h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用amberlitexad-16大孔吸附树脂纯化，即得石榴皮标准提取物；

将高良姜进行粉碎并过筛60目得到高良姜粉，将高良姜粉6倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为60％，提取温度为75℃，每次提取2h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用xda-6大孔树脂进行精制纯化，即得高良姜标准提取物；

将没食子进行粉碎并过筛60目得到没食子粉，将没食子粉6倍量的浓度乙醇提取，没食子粉的乙醇提取浓度为50％，提取温度为35℃，每次提取6h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用d301大孔树脂进行精制纯化，即得没食子标准提取物。

(2)称取胀果甘草标准提取物7kg、石榴皮标准提取物1.5kg、高良姜标准提取物2.5kg、没食子标准提取物2kg、辅料基质12kg；

辅料基质为可溶性淀粉、微晶纤维素、明矾、柠檬酸、碳酸氢钠、聚维酮k30、硬脂酸镁；

(3)将胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物混合搅拌均匀，得到混合提取物；

(4)将混合提取物分成两份，一份加柠檬酸和其它辅料基质混合，另一份加碳酸氢钠和其它辅料基质混合，混匀后均加3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将制备的软材分别过14目制粒，50℃鼓风干燥箱干燥2.5h，将干燥后的颗粒过分别12目整粒，合并颗粒，加润滑剂混匀后置于单冲压片机，用椭圆形冲模压片制成泡腾片，即得治疗子宫颈癌的中药泡腾片。

实施例4

治疗子宫颈癌的中药泡腾片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胀果甘草进行粉碎并过筛45目得到胀果甘草粉，将胀果甘草粉4倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为75％，提取温度为65℃，每次提取1h，超声辅助提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏依次用聚酰胺和大孔树脂进行精制纯化，即得胀果甘草标准提取物；

将石榴皮进行粉碎并过筛45目得到石榴皮粉，将石榴皮粉10倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为75％，提取温度为60℃，每次提取4h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用amberlitexad-16大孔吸附树脂纯化，即得石榴皮标准提取物；

将高良姜进行粉碎并过筛45目得到高良姜粉，将高良姜粉10倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为75％，提取温度为60℃，每次提取1.5h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用xda-6大孔树脂进行精制纯化，即得高良姜标准提取物；

将没食子进行粉碎并过筛45目得到没食子粉，将没食子粉5倍量的浓度乙醇提取，没食子粉的乙醇提取浓度为50％，提取温度为30℃，每次提取8h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用d301大孔树脂进行精制纯化，即得没食子标准提取物。

(2)称取胀果甘草标准提取物4.125kg、石榴皮标准提取物2.456kg、高良姜标准提取物3.1427kg、没食子标准提取物0.9285kg、辅料基质10.65kg；

辅料基质为可溶性淀粉、微晶纤维素、明矾、柠檬酸、碳酸氢钠、聚维酮k30、硬脂酸镁；

(3)将胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物混合搅拌均匀，得到混合提取物；

(4)将混合提取物分成两份，一份加柠檬酸和其它辅料基质混合，另一份加碳酸氢钠和其它辅料基质混合，混匀后均加3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将制备的软材分别过14目制粒，50℃鼓风干燥箱干燥2.5h，将干燥后的颗粒过分别12目整粒，合并颗粒，加润滑剂混匀后置于单冲压片机，用椭圆形冲模压片制成泡腾片，即得治疗子宫颈癌的中药泡腾片。

实施例5

治疗子宫颈癌的中药泡腾片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胀果甘草进行粉碎并过筛45目得到胀果甘草粉，将胀果甘草粉4倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为75％，提取温度为65℃，每次提取1h，超声辅助提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，将浸膏依次用聚酰胺和ab-8大孔吸附树脂进行精制纯化，即得胀果甘草标准提取物；

将石榴皮进行粉碎并过筛45目得到石榴皮粉，将石榴皮粉10倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为75％，提取温度为60℃，每次提取4h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用amberlitexad-16大孔吸附树脂纯化，即得石榴皮标准提取物；

将高良姜进行粉碎并过筛45目得到高良姜粉，将高良姜粉10倍量的浓度乙醇提取，乙醇提取浓度为75％，提取温度为60℃，每次提取1.5h，提取3次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用xda-6大孔树脂进行精制纯化，即得高良姜标准提取物；

将没食子进行粉碎并过筛45目得到没食子粉，将没食子粉5倍量的浓度乙醇提取，没食子粉的乙醇提取浓度为50％，提取温度为30℃，每次提取8h，提取2次，提取液经过滤、浓缩至干而得浸膏，再将浸膏用d301大孔树脂进行精制纯化，即得没食子标准提取物。

(2)称取胀果甘草标准提取物9.185kg、石榴皮标准提取物0.25kg、高良姜标准提取物0.7582kg、没食子标准提取物2.57842kg、辅料基质12.8kg；

辅料基质为可溶性淀粉、微晶纤维素、明矾、柠檬酸、碳酸氢钠、聚维酮k30、硬脂酸镁；

(3)将胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物混合搅拌均匀，得到混合提取物；

(4)将混合提取物分成两份，一份加柠檬酸和其它辅料基质混合，另一份加碳酸氢钠和其它辅料基质混合，混匀后均加3.6％的pvpk30无水乙醇溶液制软材，将制备的软材分别过14目制粒，50℃鼓风干燥箱干燥2.5h，将干燥后的颗粒过分别12目整粒，合并颗粒，加润滑剂混匀后置于单冲压片机，用椭圆形冲模压片制成泡腾片，即得治疗子宫颈癌的中药泡腾片。

试验例1

对本发明实施例1-5制得的胀果甘草标准提取物、石榴皮标准提取物、高良姜标准提取物、没食子标准提取物分别进行含量测定，检测结果显示，实施例1-5制得的标准提取物均符合本发明质量检测标准，即胀果甘草标准提取物中有效组分含量为22.5％至58％；石榴皮标准提取物中有效组分含量为12.5％至26.8％；高良姜标准提取物中有效组分含量为35.5％至68.5％；没食子标准提取物中有效组分含量为11.8％至28.1％。

试验例2泡腾片质量检测

一、薄层检测：分别以四种药材中的种属特异性成分及标准对照药材作为对照品，以泡腾片作为被测样品，用适宜的混合有机溶剂为展开剂进行薄层色谱特征鉴定，检测过程如下。

(1)被测样品：取泡腾片，粉碎后用乙醇提取过滤制备；

(2)药材对照品：分别取胀果甘草(经用生药学方法做品种鉴定而确定应为胀果甘草，其他品种的甘草不可用)、石榴皮、高良姜和没食子药材各0.5克，用乙醇提取过滤制备药材对照品溶液备用；

(3)单体对照品：分别紧密称取四种药材的种属特异性成分单体——甘草查尔酮a(来自胀果甘草)、鞣酸(主要来自石榴皮)、高良姜素(来自高良姜)、没食子酸(主要来自没食子)各15mg，分别用乙醇溶解制成单体对照品溶液备用；

(4)薄层板及点样要求：选取硅胶gf254荧光薄层板；分四组点样，即分别取四块薄层板，对每一个薄层板起点线上用铅笔标记1,2,3三个点，分别点样药材对照品、泡腾片样品和单体对照品溶液；

(5)展开剂的配制要求：根据各药材化学组分特点不同，分别配制：

胀果甘草的鉴定以氯仿/甲醇/乙酸乙酯(2～4:0.3～0.9:0.6～1.8比例)的展开剂；

高良姜的鉴定以氯仿/乙酸乙酯(3～6:～0.4～1.8比例)的展开剂；

石榴皮和没食子的鉴定以乙酸乙酯/丙酮/甲酸/水(5～16:0.3～1.9:0.4～2.0:0.5～2.6)的展开剂。

将点样的薄层板分别放在层析缸里展开后取出，晾干，在254nm紫外灯下观察斑点特色，作为薄层鉴定依据。图1为用胀果甘草对照药材和标志成分甘草查尔酮a来鉴定该泡腾片的薄层鉴定特征图，图2为用高良姜提取物和对照品高良姜素鉴定该泡腾片的薄层鉴定特征图，图3为用石榴皮提取物和鞣酸对照品鉴定该泡腾片的薄层鉴定特征图，图4为用没食子提取物和没食子酸对照品鉴定该泡腾片的薄层鉴定特征图，作为鉴定案例提供。

图1的薄层特征说明，本发明中药泡腾片中有胀果甘草和有效成分甘草查尔酮a存在。可用胀果甘草药材及其中的有效成分甘草查尔酮a来可以进行该泡腾片的真伪和质量鉴定，图1中1为胀果甘草提取物，2为本发明泡腾片，3为甘草查耳酮a。

二、常规观察指标

(1)性状：对制备的宫颈泡腾片形状、颜色、气味进行描述：制备的宫颈泡腾片为浅黄色椭圆形片剂，完整光洁，色匀，无畸形或麻斑。

(2)重量差异：检查根据《中国药典》2015年版第四部附录0101片剂的重量差异检查方法。取本品20片，精密称定总重量，求得平均片重，在精密称定每片的重量，每片的重量与平均重量比较，要求超出重量差异限度的不得多于两片。

表1：宫颈泡腾片重量差异测定

m20＝18.71g，m^-＝0.9353g，重量差异范围【0.8885-0.9821】如表所示14号片不在差异范围内，为不合格片，其他均为合格。

(3)发泡量：根据《中国药典》2015年版第四部附录0101片剂的发泡量检查方法。取10支25ml具塞量筒，各精密加水2ml，置37±1℃水浴，5min后，各管分别投入宫颈泡腾片1片，密塞，20min内观察最大发泡量体积。

(4)崩解时限：根据《中国药典》2015年版第四部附录通则0922阴道片检查方法取4片泡腾片，分别置于250ml烧杯中，内盛200ml水，水温37.5℃，有大量气泡放出。当片剂或碎片周围的气体停止逸出时，片剂崩解，分散在水中，无聚集颗粒剩余。各片应在30min内崩解。

(5)酸度：根据《中国药典》2015年版第四部通则0631ph值测定法取宫颈泡腾片5片，研细，置于250ml烧杯中，加水50ml，搅拌使溶解，依法测定测得ph值为4.41。

试验例3

提取物对宫颈癌细胞的抑制作用：以胀果甘草提取物、高良姜提取物和没食子提取物为试药，以宫颈癌siha细胞为体外药理实验模型，通过mtt法测定三种提取物对宫颈癌细胞增殖的抑制作用，具体方法如下。

取siha细胞，接种于含10％胎牛血清、1％双抗和1％谷氨酰胺的dmem的培养液中，在5％co2、37℃的培养箱中培养。将对数生长期的细胞消化、计数并稀释成5×10⁴个/ml的细胞悬液，200μl/孔接种到96孔板中培养24h。以浓度为25、50、100μg/ml的提取物，每个浓度设6个复孔，以只加培养液的细胞悬液为空白组，每孔给药200μl。培养24h后每孔加入20μl5mg/ml的mtt溶液，放入培养箱培养4h，吸出上清液后每孔加入150μldmso，用酶标仪在490nm条件下测定吸光度(od)值，计算其抑制率。抑制率＝[(od空-od测)/od空]×100％，实验数据以均数±标准差表示,结果显示三种提取物对宫颈癌细胞siha有不同程度的抑制作用，如表1。

表1三种提取物对宫颈癌siha细胞的抑制率

(2)甘草查耳酮a对宫颈癌细胞的抑制作用及对肿瘤干细胞标志物的影响：

本实验针对胀果甘草标准化提取物所含的主要活性成分——甘草查耳酮a开展深入的分子生物学实验研究。以宫颈癌siha细胞为体外模型，以0～100μg/ml剂量的甘草查耳酮a干预siha细胞24h，通过mtt法测定甘草查耳酮a对宫颈癌细胞的抑制作用，通过流式细胞仪法测对siha细胞周期的影响和促凋亡作用，通过荧光定量rt-pcr定量分析甘草查耳酮a对cdk-4、bcl-2、aldh1a1、oct4、uhrf1、birc7、tp53和birc5等8种基因表达水平的影响。

mtt实验数据显示：甘草查耳酮a在不同浓度条件下干预siha细胞作用24h、48h和72h后显著抑制siha细胞的增殖。细胞凋亡实验数据显示：不同浓度的甘草查耳酮a干预siha细胞24h后显示不同程度的促凋亡作用，而且其凋亡率随浓度的增加而增加，说明查耳酮a通过诱导siha细胞凋亡而发挥较强的抗宫颈癌活性。周期实验结果显示：与空白组相比，siha细胞用licoa干预后，在30μg/ml时，siha细胞在g0/g1期占比由74.53％降到43.58％，比值减少了30.95％；s期占比从16.19％增加到35.18％,g2/m期的比例由8.56％增加到21.25％，s期和g2/m期分别增加了18.99和12.69，说明licoa可能将siha细胞的增殖周期阻滞在s期和g2/m期。荧光定量rt-pcr数据显示：甘草查耳酮a干预siha细胞后能降低siha细胞中cdk-4、bcl-2、aldh1a1、oct4、uhrf1、birc7、tp53和birc5等8种基因的表达水平。结果见表2-5和图5-7。

表2甘草查耳酮a在不同浓度条件下对siha细胞作用24h、48h和72h的抑制率

表3查尔酮a和顺铂对siha细胞作用24h的凋亡百分比例

表4甘草查耳酮a和顺铂对siha细胞作用24h周期结果

表5不同浓度查尔酮a对siha细胞作用24h后各基因的相对表达量分析(x±s,n＝12)

注：各目的基因的10、25、50、75μg/ml浓度干预组与其0μg/ml比较，*表示p<0.05。