一种牡丹花提取物复合脂质体的制备方法

本发明涉及牡丹花总黄酮应用技术领域，尤其涉及一种牡丹花提取物复合脂质体的制备方法。

背景技术：

牡丹（peaoniasuffruticosaandr.）属毛茛科芍药属灌木，有“花中之王”的美誉，在我国各地均有广泛种植，尤以菏泽、洛阳牡丹为最。除了作为一种观赏性植物外，牡丹根皮部位也是一种重要的中药。牡丹花的研究多集中在具有优良抗氧化功效的黄酮类化合物，此外，牡丹花中含有丰富的糖苷类化合物，以及天然香味物质，如香茅醇、香叶醇、芳樟醇等挥发油。目前，已在食品、饮料及日用化工方面对牡丹进行了综合利用及开发。牡丹花含黄芪苷，能调经活血，治妇女月经不调，经期腹痛，相关研究发现黄酮类化合物是其重要的活性成分。对牡丹花的护肤活性研究主要集中在抗氧化/抗衰老和美白方面。多数研究通过抑制羟自由基、超氧自由基、dpph等自由基的试验验证牡丹花提取物具有显著的抗氧化功效，且牡丹花提取物具有延缓皮肤光老化的潜力。

目前牡丹花在一些美白和抗衰老的产品中已有应用，但相对于牡丹根提取物，现有的牡丹花提取物的护肤机制还不够清晰，在应用方面还存在着植物提取物的普遍问题，例如：由于牡丹花提取物存在溶解性问题，稳定性较差，透皮吸收不确定，且配方应用时颜色气味限制等原因，这些因素极大限制了以牡丹花提取物作为主要功效原料的化妆品相关制剂的开发应用，亟需寻找新的提取方式或者原料形式解决现有问题，才能真正让牡丹花大范围应用到化妆品上。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种牡丹花提取物复合脂质体的制备方法，利用牡丹花提取物中的总黄酮与总糖与其他的复配物进行复配后制备成复合脂质体，解决了牡丹花提取物溶解性、稳定性、透皮吸收不稳定的问题，还能够与具有其他化妆品功效的复配物进行复配，从而缩短后期产品应用时的开发时长。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种牡丹花提取物复合脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

s1：从牡丹花中提取牡丹花提取物；

s2：测定牡丹花提取物中总黄酮和总糖的含量；

s3：利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体。

进一步的，步骤s1从牡丹花中提取牡丹花提取物的具体操作包括，

s11：称取牡丹干花10g，按料液比1:30-70加入质量浓度为30-70%乙醇，并加入0.25-8.5%纤维素酶，50℃、超声功率100hz条件下超声提取0.5-2h；反复提取2次，过滤后，合并提取液；

s12：将合并后的提取液减压浓缩至200ml，-20℃冷冻过夜，真空干燥，得牡丹花提取物干粉。

进一步的，步骤s11中料液比为1:40，乙醇的质量浓度为50%，纤维素酶的加入量为1%，超声提取1h。

进一步的，步骤s3利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体的具体操作包括，

s31：精密称取磷脂40-150mg，胆固醇10-150mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；

s32：恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

s33：称取5-50mg步骤s1中提取的牡丹花提取物和一定量的复配物，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入步骤s32得到的干燥物中，37℃水浴常压水合；

s34：脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜即得牡丹花提取物复合脂质体。

进一步的，步骤s31中所述磷脂为氢化大豆卵磷脂。

进一步的，步骤s31中氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg。

进一步的，步骤s32中成膜温度为40℃。

进一步的，步骤s33中所述的一定量的复配物为30-200mg烟酰胺、0.2-10ml肌肽、0.2-10ml九肽-1。

进一步的，步骤s33中加入的牡丹花提取物和复配物具体为20mg牡丹花提取物干粉、100mg烟酰胺、0.5ml肌肽、0.3ml九肽-1。

进一步的，步骤s33中水合时间为0.5h。

本发明的有益效果是：

1、本发明在低于60℃条件下，采用酶加超声的辅助提取方法，完整的保留了牡丹花中的全部有效活性成分，提高了牡丹花提取物的提取率，而且利用本发明中牡丹花提取物的提取方法提取出来的牡丹花提取物中总黄酮含量不低于15%，多糖含量不低于18%；

2、本发明中将牡丹花提取物与具有其他功效的化妆品原料进行复配，然后采用薄膜分散法将其制备成复合脂质体，解决牡丹花提取物溶解性、稳定性、透皮吸收不稳定的问题，且制备的脂质体形态较好、分散体系稳定、分布均匀、包封率好；且制备方法简单，原料易得，制备得到的牡丹花提取物复合脂质体具有良好的生物利用度；

3、利用本发明中复合脂质体的制备方法制备出来的复合脂质体可以广泛应用于化妆品开发，做到全面、环保、健康提取。

附图说明

图1为本发明芦丁对照品溶液浓度对吸光度的标准曲线图。

图2为本发明无水葡萄糖对照品溶液浓度对吸光度的标准曲线图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例一：

实施例一研究从牡丹花中提取牡丹花提取物，具体的，

具体的，s11：称取牡丹干花10g，按料液比1:40加入质量浓度为50%的乙醇，并加入1%的纤维素酶，50℃、超声功率100hz条件下超声提取1h；反复提取2次，过滤后，合并提取液；

s12：将合并后的提取液减压浓缩至200ml，-20℃冷冻过夜，真空干燥，得牡丹花提取物干粉。

利用公式：牡丹花提取物提取率（%）=牡丹花提取物干粉重量（g）/牡丹花干花重量（g）*100%，计算牡丹花提取物的提取率，可以得出，本实施例中牡丹花提取物的提取率为45.58%。

作为对比，在步骤s11中不加入纤维素酶对牡丹花提取物进行提取。

进一步的，测定牡丹花提取物中总黄酮和总糖的含量；

具体的，测定牡丹花提取物中总黄酮含量的具体操作包括以下步骤：

s21、对照样品溶液的配制：取芦丁对照品2.5mg，精密称定，80%乙醇定容至25ml，得0.1mg/ml芦丁对照品溶液；

s22、供试品溶液的配制：分别精密称定加入纤维素酶和不加纤维素酶提取的牡丹花提取物约0.1g，用水稀释至50ml容量瓶中，取1ml至10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得供试品溶液1。取1ml样品1至5ml容量瓶中，加水至5ml刻度，摇匀，得供试品溶液2。

s23、显色剂的配制：所述显色剂包括5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液和4%氢氧化钠溶液；

称取亚硝酸钠0.5g，加水溶解，定容至10ml，即得5%亚硝酸钠溶液；

称取硝酸铝1g，加水溶解，定容至10ml，即得10%硝酸铝溶液；

称取氢氧化钠1g，加水溶解，定容至25ml，即得4%氢氧化钠溶液。

s24、使用对照品溶液绘制标准曲线；

具体的，分别精密移取0.2、1、2、3、4ml步骤s21中制得的芦丁对照品溶液，置于10.0ml的容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.2ml，摇晃均匀后静放7min；再加入10%硝酸铝溶液0.2ml，摇晃均匀后静放10min；再加入4%氢氧化钠溶液2ml，80%乙醇稀释定容至刻度，摇晃均匀后静置15min，用试剂作空白参照试验，在510nm下测定其吸光度，绘制标准曲线，如附图1所示。

根据附图1可拟合出标准曲线方程为a=0.0155c-0.0006（r²=0.9999），该标准曲线在芦丁浓度为2.0-40ug/ml范围内线性良好。

s25、使用对照品溶液进行吸光度测定，验证实验仪器的精密度和溶液配制方法的稳定性；

具体的，取0.1mg/ml芦丁对照品溶液，利用紫外可见分光光度计，在510nm处重复测定五次吸光度，计算rsd，验证实验仪器的精密度，结果如表1所示。

表1精密度实验结果

从表1中可以看出，rsd<2%，说明紫外可见分光光度计的精密度良好。

取0.1mg/ml芦丁对照品溶液，利用紫外可见分光光度计，分别在0、5、10、20、30min在510nm测定吸光度，并计算rsd值，验证溶液配制方法的稳定性。结果如表2所示。

表2稳定性实验结果

由表2可以得出，rsd<2%，说明该黄酮含量测定方法稳定性良好。

s26、通过加样回收实验，验证方法的稳定性；

取1ml步骤s22中的供试品溶液，分别加入不同量芦丁对照品溶液，利用紫外可见分光光度计测定吸光度，并计算rsd值，结果如表3所示。

表3加样回收实验结果

由表3可以看出，rsd<2%，说明该黄酮含量测定方法稳定性良好。

s27、牡丹花提取物中牡丹花总黄酮含量测定：分别精密量取2ml步骤s22中的供试品溶液，测得吸光度，代入标准曲线计算牡丹花提取物中总黄酮含量，结果如下表4所示。

表4牡丹花提取物中总黄酮含量测定结果

从总黄酮测定结果可以明显看出，在从牡丹花中提取牡丹花提取物时，加入1%的纤维素酶可以明显提高牡丹花提取物中总黄酮的含量。

进一步的，测定牡丹花提取物中总糖含量的具体操作包括以下步骤：

s28、对照品溶液的配制：精密取无水葡萄糖对照品100mg，置1000ml量瓶中，加水适量溶解，稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水葡萄糖0.1mg）；

s29：精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml分别置具塞试管中，分别加水补至2.0ml，各精密加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5ml，摇匀，放置10分钟，置80℃水浴中保温15分钟，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外可见分光光度法在490nm的波长处测定吸光度，结果如表4所示，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如附图2所示。

表5对照品溶液总糖含量测定时吸光度测定结果

s210、牡丹花提取物多糖溶液配制：精密称定供试品约0.1g，用水稀释至50ml容量瓶中，取1ml至10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得供试品溶液1。取1ml样品1至5ml容量瓶中，加水至5ml刻度，摇匀，得供试品溶液2。

s211、牡丹花提取物多糖含量测定：分别精密称定加入纤维素酶和不加纤维素酶提取的牡丹花提取物约0.1g，用水稀释至50ml容量瓶中，取1ml至10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得供试品溶液1。取1ml样品1至5ml容量瓶中，加水至5ml刻度，摇匀，得供试品溶液2；分别取供试样品溶液2ml进行多糖含量测定，以相应的试剂为空白，照紫外可见分光光度法在490nm的波长处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中多糖浓度，以此计算样品中的多糖含量，结果如表6所示。

表6牡丹花提取物中多糖含量测定结果

从多糖测定结果可以明显看出，在从牡丹花中提取牡丹花提取物时，加入1%的纤维素酶可以明显提高牡丹花提取物中多糖的含量。

实施例二：

实施例二在实施例一的基础上，利用牡丹花提取物制备复合脂质体，具体的，

s1：从牡丹花中提取牡丹花提取物；

s11：称取牡丹干花10g，按料液比1:40加入质量浓度为50%的乙醇，并加入1%的纤维素酶，50℃、超声功率100hz条件下超声提取1h；反复提取2次，过滤后，合并提取液；

s12：将合并后的提取液减压浓缩至200ml，-20℃冷冻过夜，真空干燥，得牡丹花提取物干粉。

s2：测定牡丹花提取物中总黄酮和总糖的含量；

根据实施例一中的测定结果，牡丹花提取物中总黄酮的含量为21.34%，多糖的含量为56.07%。

s3：利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体。

具体的，精密称取氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

称取20mg牡丹花提取物干粉、50mg烟酰胺，量取0.5ml肌肽、0.5ml九肽-1，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入磷脂胆固醇干燥物中，37℃水浴常压水合；脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜，即得牡丹花提取物复合脂质体1。

实施例三：

实施例三与实施例二的区别仅在于步骤s3利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体的具体操作，其他操作均相同；

具体的，精密称取氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

称取20mg牡丹花提取物干粉、100mg烟酰胺，称量1ml肌肽、0.5ml九肽-1，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入磷脂胆固醇干燥物中，37℃水浴常压水合；脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜即得牡丹花提取物复合脂质体2。

实施例四：

实施例四与实施例二的区别仅在于步骤s3利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体的具体操作，其他操作均相同；

具体的，精密称取氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

称取50mg牡丹花提取物干粉、50mg烟酰胺，称量0.5ml肌肽、0.5ml九肽-1，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入磷脂胆固醇干燥物中，37℃水浴常压水合；脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜即得牡丹花提取物复合脂质体3。

实施例五：

实施例五与实施例二的区别仅在于步骤s3利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体的具体操作，其他操作均相同；

具体的，精密称取氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

称取20mg牡丹花提取物干粉、100mg烟酰胺，称量1ml肌肽、0.3ml九肽-1，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入磷脂胆固醇干燥物中，37℃水浴常压水合；脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜即得牡丹花提取物复合脂质体4。

实施例六：

实施例六与实施例二的区别仅在于步骤s3利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体的具体操作，其他操作均相同；

具体的，精密称取氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

称取20mg牡丹花提取物干粉、100mg烟酰胺，称量0.5ml肌肽、0.3ml九肽-1，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入磷脂胆固醇干燥物中，37℃水浴常压水合；脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜即得牡丹花提取物复合脂质体5。

实施例七：

实施例七与实施例二的区别仅在于步骤s3利用牡丹花提取物制备牡丹花提取物复合脂质体的具体操作，其他操作均相同；

具体的，精密称取氢化大豆卵磷脂80mg，胆固醇40mg，加入20ml氯仿，震荡溶解，至溶液呈透明状；恒温减压除去氯仿，至瓶壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min；

称取50mg牡丹花提取物干粉、50mg烟酰胺，称量1ml肌肽、0.5ml九肽-1，加入pbs溶液定容至20ml，溶解完全后加入磷脂胆固醇干燥物中，37℃水浴常压水合；脱膜完全后超声5-20min以减小粒径，过0.45μm滤膜即得牡丹花提取物复合脂质体6。

对实施例二至实施例七中制备的复合脂质体进行美白功效评价，测定复合脂质体的酪氨酸酶抑制率，结果如表7所示。

表7不同复合脂质体酪氨酸酶抑制率

实验结果表明：复合脂质体3、5的酪氨酸抑制率最高，且优于未包裹脂质体的牡丹花提取物，即复合脂质体3、5抑制酪氨酸途径的美白功效最好。

进一步的，对实施例二至实施例七中制备的复合脂质体相对黑素含量进行测定，结果如表8所示。

表8不同复合脂质体的相对黑素含量

实验结果表明：六种被测复合脂质体中，复合脂质体5、6的相对黑素含量最低，且低于阳性对照及未包裹脂质体的牡丹花提取物，因此复合脂质体5、6黑色素相关的美白功效最好。

进一步的，对实施例二至实施例七中制备的复合脂质体进行稳定性检测，结果如表9所示。

表9不同复合脂质体稳定性检测结果

实验结果表明，复合脂质体5制得的牡丹花提取物脂质体组合物的粒径较小，且分布较均匀。表面电位绝对值较高，表明脂质体间具有较强的静电斥力，稳定性良好。

综上所述，复合脂质体5（20mg牡丹花提取物干粉、100mg烟酰胺，0.5ml肌肽、0.3ml九肽-1）的美白功效最好，而且稳定性最好。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。