用于递送生物活性剂的组合物及其用途的制作方法

1.本发明总体上涉及用于递送生物活性剂的组合物。具体而言，本发明涉及用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物及其用途，所述组合物包含短生物相容性聚合物纤维(short biocompatible polymer fibres)。
2.背景
3.所有参考文献，包括在本说明书中引用的任何专利或专利申请，都通过引用并入，以便能够完全理解本发明。然而，这些参考文献不应被理解为承认这些文献中的任何一个在澳大利亚或任何其他国家形成本领域公知常识的一部分。
4.虽然生物活性剂在治疗中的功效关键取决于所用的剂的作用机制，但在引发最佳或适当的应答方面，其他因素也可能很重要。关于待治疗的疾病或紊乱的发作，可耐受剂量和施用时间通常是关键的考虑因素。还有许多也可能有助于预期的治疗应答的涉及药代动力学和药效学特征的复杂问题。
5.先前的研究已经对大量的治疗剂进行了研究，以便建立递送活性剂(包括治疗剂)的最佳策略。生物活性剂可以被掺入许多不同的剂型或递送媒介物中，用于通过不同途径施用，剂型或递送媒介物的选择通常由预期的施用途径决定。合适的剂型或递送媒介物的说明性实例包括片剂、胶囊、喷雾剂、软膏或贴剂，用于通过诸如血管内(例如静脉内)、皮下、腹膜内、肌内、口服、舌下、经粘膜和经皮(transdermal)施用途径递送生物活性剂。
6.一般认为，许多生物活性剂不适合特定的施用途径。例如，许多生物活性剂容易被蛋白水解酶和/或胃酸降解，或者它们可能由于诸如分子量和/或电荷的限制而不能充分吸收到体循环中，特别是当通过口服、经粘膜或经皮途径施用时。
7.许多生物活性剂也需要在一段时间内重复施用，以达到或保持所需的治疗应答。这在例如免疫治疗中是明显的，其中免疫通常需要施用多次接种疫苗、加强剂和/或高剂量的疫苗组合物，导致患者和医疗保健部门的经济成本增加。
8.这些缺点已经通过使用小直径颗粒得到部分缓解，该小直径颗粒包封生物活性剂，并且从而在施用后保护其不降解。这种颗粒通常由合成的可降解聚合物形成，该聚合物在生物环境中分解以在一段时间内释放包封的剂。
9.涉及使用递送媒介物的策略已经显示出作为优化药物和其他生物活性剂的递送特性的一种方式的希望，所述递送媒介物能够以允许保护和控制释放的方式封装活性剂。这样的媒介物提供了用剂的全身半衰期和药代动力学/药效学谱对治疗功效可以至关重要的剂成功治疗和控制许多疾病的可能性。然而，由于生物活性剂的不同化学性质，持续递送媒介物通常需要特别设计以适应待递送的剂，并且以与剂的化学性质无关的方式。
10.颗粒和囊泡生物可降解聚合物平台是用于优化多种疾病和状况的预防和治疗方法的有前景的技术的一个实例，特别是用于免疫治疗。说明性的实例包括脂质体，其可以被修饰以包封小的亲水分子和蛋白质。然而，这些制剂的稳定性和脂质体包封的剂的释放谱可能不容易控制。另一方面，可生物降解的固体颗粒相对稳定并且具有可控的释放特性。然而，它们对治疗剂的简易封装和控制释放造成了复杂性。可生物降解的固体颗粒也可能很
难通过注射施用，因为它们的粘度相对较高。
11.因此，尽管最近取得了进展，仍然迫切需要能够为生物活性剂提供快速和持续释放谱的更好的组合物。
12.发明概述
13.本公开内容至少部分地基于发明人的惊人发现，即短生物相容性聚合物纤维(spf)是用于快速和持续递送生物活性剂的合适的生物相容性递送媒介物进行预期。本发明人还已经意外地发现，本文公开的spf可以在延长的时间内保护生物活性剂，并且因此有助于生物活性剂快速和随着时间持续地递送，而不会损害生物活性剂的完整性。
14.因此，在本文公开的一个方面，提供了一种用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物，该组合物包含：
15.短生物相容性聚合物纤维(spf)，其具有在约1μm至约3mm的范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm的范围中的平均直径，其中spf装载有一种或更多种生物活性剂，
16.其中，当被施用时，该组合物提供一种或更多种生物活性剂从spf的持续释放。
17.在本文公开的另一方面，提供了一种用于向有相应需要的受试者快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的方法，该方法包括向受试者施用如上所述的组合物。
18.在另一方面，提供了一种治疗或预防有相应需要的受试者的疾病或紊乱的方法，该方法包括向受试者施用如上所述的组合物。
19.在一种实施方案中，该组合物向受试者皮下施用。
20.在另一方面，提供了一种如本文所述的组合物，用于向有相应需要的受试者递送一种或更多种生物活性剂。
21.在另一方面，提供了一种如本文所述的组合物，当向有相应需要的受试者施用时用于治疗或预防疾病或紊乱。
22.本公开内容还延伸至如本文所述的组合物在制备用于治疗或预防有相应需要的受试者的疾病或紊乱的药物中的用途。
23.在本文公开的另一方面，提供了一种用于制备用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物的方法，该方法包括：
24.(a)将生物相容性聚合物纤维形成液的流引入具有在约1至100厘泊(cp)的范围中的粘度的分散介质中；
25.(b)在分散介质中由(a)的纤维形成液的流形成长丝(filament)；
26.(c)在允许长丝断裂和形成短生物相容性聚合物纤维(spf)的条件下剪切(b)的长丝，其中spf具有在约1μm至约3mm的范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm的范围中的平均直径；和
27.(d)用一种或更多种生物活性剂装载(c)的spf。
28.在本文公开的又另一方面，提供了一种用于制备用于持续释放一种或更多种生物活性剂的组合物的方法，该方法包括：
29.(a)提供包含(i)可生物降解的聚合物纤维形成液和(ii)一种或更多种生物活性剂的混合物；
30.(b)将(a)的混合物的流引入具有在约1至100厘泊(cp)的范围中的粘度的分散介质中；
31.(b)在分散介质中由(a)的流形成长丝；
32.(c)在允许长丝断裂和形成短生物相容性聚合物纤维(spf)的条件下剪切(b)的长丝，其中spf具有在约1μm至约3mm的范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm的范围中的平均直径。
33.本文还公开了通过本文所述的方法制备的组合物。
34.本公开内容还延伸至疫苗组合物，其包含短生物相容性聚合物纤维(spf)，其中spf包含聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)，平均直径在约15nm至约5μm的范围中，并且平均长度在约1μm至约3mm的范围中；和
35.其中所述spf装载有(i)选自由肿瘤细胞裂解物和癌症相关抗原组成的组的免疫原；(ii)细胞因子和(iii)佐剂。
36.另一方面，提供了一种疫苗组合物，其包含短生物相容性聚合物纤维(spf)，其中spf包含聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)，平均直径在约15nm至约5μm的范围中，并且平均长度在约1μm至约3mm的范围中；和
37.其中所述spf装载有(i)胶质母细胞瘤的肿瘤细胞裂解物和/或癌症相关抗原；(ii)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)；和(iii)cpg寡核苷酸(cpg)。
38.本发明的其他方面和说明性实施方案也在下面的详细描述中描述。
39.附图简述
40.现在将参考以下非限制性的附图来描述本发明的示例实施方案，其中：
41.图1显示了示出生物材料掺入到同一种spf中的显微照片。含有荧光标记的(a)肽(绿色/光)、(b)14kda蛋白(蓝色/光)和(c)dna(红色/光)的官能化spf的荧光图像与(d)相应的亮场图像相比较。(e-h)是在相同条件下拍摄的对照未标记的spf。
42.图2显示了从spf释放后的hrp酶活性。将hrp-spf在盐水中孵育7天。在第1、2、3、6和7天取等分试样，并用颜色测定法监测hrp活性，所得颜色变化在420nm测量。
43.图3使用ova抗体和荧光488二抗显示ova掺入spf的显微照片。(a)装载ova蛋白的spf(荧光图像-左图；亮场-右图)；(b)对照/空载的spf(荧光图像-左图；亮场-右图)。
44.图4显示了使用免疫测定法检测plga spf中的生物素-cpg。将约100μg生物素-cpgodn掺入到2ml plga中以产生spf。将对应于1.5ml plga和0.5ml plga的spf各添加到一个孔中。将spf暴露于hrp-链霉亲和素复合物。使用tmb底物试剂(3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺)确定定量，并且所导致的颜色变化在450nm读取。与普通(裸)spf相比，检测到的颜色变化表明spf中存在生物素-cpgodn。
45.图5显示了在28天期间(时间/天；x轴)gm-csf(pg/ml；y轴)从spf的释放动力学。在(ii)中，gmcsf-spf累积释放曲线下降。在28天的时间内，通过免疫测定检测由gmcsf-spf释放的活性gmcsf。释放曲线显示，gmcsf的释放持续了全部28天，最大释放在第7天。在制造纤维期间，添加了大约5μg的gmcsf。显示了标准误差线。
46.图6显示了(i)在384小时的时间段内，从plga spf释放ova的概况。检测通过bca测定确定。spf由总共1.8mg ova制成；(ii)2小时内的蛋白质释放曲线。将含有0.5mg gmcsf或ova的spf在1ml pbs中孵育2小时，并收集蛋白质。样品(30μl、3μl和0.3μl)以普通spf和ova为标准进行分析。
47.图7显示了与0.5％dmso、0.5％pbs或单独细胞相比，spf在存在可溶性plga或spf
的情况下在3天内对tf-1(a)和aml-193(b)细胞系的毒性。细胞活力显示在y轴上(细胞数量)。所有处理在培养物中是无毒的。
48.图8显示了在存在(图a、c、e、g)或不存在(图b、d、f、h)spf的情况下培养的tf-1细胞(上图)和aml-193细胞(下图)的显微照片。在存在spf的情况下，细胞表现出健康的形态学，没有可观察到的细胞死亡或细胞空间组织的破坏(例如，不排斥细胞)。
49.图9显示了装载了gm-csf的spf的生物活性。将装载有gm-csf的spf完整地或溶解地与gm-csf饥饿的tf-1细胞(a)或aml-193细胞(b)一起孵育4天，并使用mts测定(abcam,usa)测量细胞数量。对照：5和10,000ng/ml的gm-csf和0.5％的dmso(溶解的spf的载体)。
50.图10显示了代表用tf-1或aml-193细胞培养5天的装载gm-csf的spf的生物活性可视化的显微照片。显示了在存在完整或溶解在dmso中的装载gm-csf的spf或空载spf的情况下生长的tf-1细胞(a)和aml-193细胞(b)(放大100倍)的亮场图像。
51.图11显示，在培养物中spf保护gm-csf活性。在存在gm-csf(5mg/ml)、仅在培养开始时加入gm-csf(1000ng/ml)、每天新鲜加入gm-csf(5ng/ml)、装载gm-csf的spf和溶解在dmso中的装载gm-csf的spf的情况下培养的aml-193细胞的细胞增殖率。将数据与对照进行比较，其中细胞在不存在gm-csf的情况下、在存在普通(空载的)spf、溶解于dmso的普通(空载的)spf和仅dmso的情况下培养。细胞数量显示在y轴上；时间(天)显示在x轴上。
52.图12显示了培养中的aml-193细胞的gm-csf剂量要求。aml-193细胞被gm-csf饥饿24小时，并且随后在不存在gm-csf或存在不同浓度的gm-csf(0.1-10ng/ml；x轴)的情况下培养。细胞增殖被测量为在培养四天后与未处理的细胞相比细胞数量(y轴)的增加。细胞数量通过mts测定确定。数据显示，aml-193细胞需要大于0.5ng/ml的gm-csf用于细胞生长。显示了标准误差线。
53.图13显示，在培养物中，spf保护gm-csf活性。(a)将装载有gm-csf的spf加入到细胞培养基中，并且随后在第3、7、14、21和28天收集并替换，以产生条件培养基。然后将条件培养基(cm)加入到gm-csf饥饿的tf-1细胞中，并在5天后使用mts测定测量细胞增殖。图(b)显示了tf-1细胞的gm-csf剂量响应。
54.图14显示了示出gm-csf的spf递送促进了thp-1细胞的树突状细胞分化的显微照片。将装载gm-csf的spf或普通(空载)spf在细胞培养基中孵育2天，并且然后加入到thp-1单核细胞中，观察向树突状细胞的分化。通过从圆形(单核细胞，白色箭头)到细长细胞(树突状细胞；黑色箭头)的形态学变化观察到分化：(a)gm-csf阳性对照；(b)未经处理的细胞；(c)装载gm-csf的spf；(d)普通(空载)spf。
55.图15显示了示出gm-csf和cpg的spf递送驱动了thp-1单核细胞的树突状细胞分化的显微照片。将装载gm-csf的spf或装载有gm-csf和cpg的spf在细胞培养基中孵育两天，并且然后加入到thp-1细胞中，以观察分化为树突状细胞的程度。通过从圆形(单核细胞，白色箭头)到细长细胞(树突状细胞；黑色箭头)的形态学变化观察到分化：(a)普通(空载)spf；(b)gm-csf+cpg；(c)装载gm-csf的spf；(d)装载gm-csf+cpg的spf。
56.图16显示了树突状细胞分化的验证。树突状细胞标志物cd14和cd40用于监测人类单核细胞的分化。表达cd14的单核细胞在分化后显示cd14表达减少，而cd40表达增加，表明向树突状细胞表型分化。
57.图17显示了表达cd8+和siinfekl t细胞表面识别标志物两者的细胞的流式细胞
术分析。(a-h)疫苗spf、(i-o)普通spf、(p-s)单独疫苗、(t-v)盐水。
58.图18显示了ova t细胞的检测。与spf(p《0.01)或单独的盐水(p《0.01)相比，使用spf施用的疫苗显示出更高的ova激活的t细胞。空载的spf表现与盐水对照相同。条等于范围。(n＝8，疫苗spf；n＝7，普通spf；n＝4，单独疫苗；n＝3，盐水)。
59.图19显示了用siikfekl肽攻击时表达ifnγ的cd8+t细胞的流式细胞术分析。(a-h)普通spf、(i-p)疫苗spf、(q-r)单独盐水。
60.图20显示了细胞毒性t细胞的检测。在用siinfekl肽攻击的细胞中检测ifnγ，与单独spf(p《0.0001)、单独盐水(p《0.005)或单独疫苗(p《0.05)相比，在通过spf施用疫苗的小鼠中鉴定出更高数量的细胞毒性细胞。盐水对照显示了不存在细胞毒性细胞。条等于范围。(n＝8，spf和spf疫苗；n＝4，仅疫苗；n＝2，盐水)。注意，一只盐水小鼠被确定患有不相关的感染。
61.图21显示了表达ifnγ的脾细胞在用siinfekl肽攻击时的elispot测定。小鼠1-4接受spf+ova(药物)注射，而小鼠5和6仅接受spf。
62.详述
63.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。
64.冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“免疫原”是指一种免疫原或一种以上的免疫原；“细胞因子”指一种细胞因子或一种以上的细胞因子；等等。
65.如本文所用，术语“约”是指相对于参考量、水平、值、维度、尺寸或数量变化高达10％(例如，变化10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的量、水平、值、维度、尺寸或数量。
66.在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包含陈述的步骤或要素，或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素，或步骤或要素的组。
67.如本文别处所公开的，本公开内容至少部分地依据发明人的惊人发现，即短生物相容性聚合物纤维(spf)是用于快速和持续递送生物活性剂的合适的生物相容性递送媒介物。本发明人还已经意外地发现，spf的组合物可以长时间保护生物活性剂，并且因此能够促进活性剂的快速和持续递送，而不损害活性剂的完整性。
68.因此，在本文公开的一个方面，提供了一种用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物，该组合物包含：
69.短生物相容性聚合物纤维(spf)，其具有在约1μm至约3mm的范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm的范围中的平均直径，其中spf装载有一种或更多种生物活性剂，
70.其中，当被施用时，该组合物提供一种或更多种生物活性剂从spf的持续释放。
71.短生物相容性聚合物纤维
72.术语“短生物相容性聚合物纤维”、“短聚合物纤维”和“spf”在本文中可互换使用，以描述具有在约1μm至约3mm范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm范围中的平均直径的短聚合物纤维。
73.在一种实施方案中，spf具有在约40nm至约5μm的范围中，或者优选在约50nm至约3μm的范围中的平均直径。在一种实施方案中，spf具有在约100nm至约2μm的范围中的平均直径。在优选的实施方案中，spf具有在约15nm至约5μm的范围中的平均直径。在另一种实施方案中，spf具有在约50nm至约500nm的范围中的平均直径。在更优选的实施方案中，spf具有在约50nm至约300nm的范围中的平均直径。
74.spf的平均直径可能受到参数诸如剪切应力、纤维形成物质的量和制造过程中的温度的影响。因此，可以改变这些参数以获得具有期望平均直径或直径范围的spf。例如，在所有其他参数相同的情况下，较低的聚合物浓度通常会提供具有较小平均直径的spf。spf的多分散性可以通过优化上述实验参数来降低。因此，spf的平均直径通常由制造过程中设定的参数决定，例如如在wo 2013/056312中描述的，并且将具有基本上由这些因素决定的可控直径。
75.在一种实施方案中，spf将具有单分散的直径，由此每个spf将具有相同或基本相同的直径。然而，应当理解，本文所述组合物的spf不需要具有相同或基本相同的直径，并且只要spf具有在本文所述范围中的平均纤维直径，它们就可以以相似的方式起作用，以提供其中装载的一种或更多种生物剂的快速和持续递送。
76.在一种实施方案中，本文所述组合物的spf将具有双峰或多峰纤维直径分布。这可以通过在分散剂中注入纤维形成液期间改变注入速度或剪切速率来实现，例如如在wo 2013/056312中所述的。本文所述组合物的spf可以具有低的纤维直径分布(即窄的多分散性)。在一种实施方案中，spf包含的直径分布偏离组合物的spf的平均直径不超过约50％，优选地不超过约45％，甚至更优选地不超过约40％。
77.本文公开的组合物的spf可以由任何长度形成，并且也可以获得宽的长度分布。在一种实施方案中，本文所述组合物的spf具有至少约1μm的平均长度。在一种实施方案中，本文所述组合物的spf具有在约1μm至约3mm范围中的平均长度。在一种实施方案中，spf具有在约1μm至约20μm范围中的平均长度。在优选的实施方案中，spf具有在约1μm至约10μm范围中的平均长度。施加到长丝的剪切应力可影响所得的spf的长度，高剪切应力通常提供较短的纤维长度。因此，如本文所述，可以通过改变操作参数来调整spf的纤维长度。
78.在一些实施方案中，spf将具有单分散的长度，由此每个spf将具有相同或基本相同的长度。应当理解，本文所述组合物的spf不需要具有相同或基本相同的长度，并且只要spf具有通常在1μm至约3mm范围中的纤维长度，它们就可以以相似的方式起作用，以提供其中分散或装载的一种或更多种生物剂的快速和持续递送。
79.在一种实施方案中，spf将具有双峰或多峰纤维长度分布。这可以通过在分散剂中注入纤维形成液期间改变注入速度或剪切速率来实现，例如如在wo 2013/056312中所述的。本文所述组合物的spf可以具有低的纤维长度分布(即窄的多分散性)。在一种实施方案中，spf包含的纤维长度分布偏离组合物的spf的平均直径不超过约50％，优选地不超过约45％，甚至更优选地不超过约40％。
80.wo 2013/056312中描述了合适的spf的说明性实例，其内容通过引用全文并入本文。在一种实施方案中，spf具有wo 2013/056312中描述的或通过wo 2013/056312中描述的方法产生的spf的纤维直径和长度特征。
81.spf将具有基本上细长的形状，通常是基本上圆柱形的形状。spf的物理特性，诸如
形状、直径和长度，可以使用本领域技术人员已知的常规技术来确定，其说明性实例包括光学显微术或扫描电子显微术。
82.spf可以适当地交联。为了形成交联的spf，在spf制造过程期间，交联剂可以被包含在纤维形成溶液和/或分散介质中。可以使用的合适交联剂的说明性实例包括戊二醛、多聚甲醛、同-双官能或异-双官能有机交联剂和多价离子，诸如ca
2+
、zn
2+
、cu
2+
。交联剂的选择可取决于用于形成spf的纤维形成物质的性质。驻留在分散介质中的所形成的spf的交联可以通过适当引发交联反应而发生，例如通过加入引发剂分子或通过暴露于适当波长的辐射，诸如uv光。spf的交联可用于进一步提高spf的稳定性，使得如果需要，它们可容易地从一种介质转移到另一种介质。
83.术语“持续的”、“持续释放”和“持续递送”在本文中可互换使用，是指通常在体内施用或递送之后一种或更多种生物活性剂的递送，由此剂从spf的释放速率比剂直接施用于受试者(即，在不存在spf的情况下)时将发生的释放速率慢。持续释放通常将发生在比快速递送显著长的时间段。如本文所述，一种或更多种生物活性剂的持续释放通常将在更长的时间段提供一定剂量的一种或更多种生物活性剂，并且因此有助于延长一种或更多种生物活性剂提供的生物(例如治疗)效果。在一些实施方案中，一种或更多种生物活性剂的持续释放发生持续至少24小时(例如，24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天等)的时间段。在一种实施方案中，组合物在施用后至少24小时的时间段、优选地至少3天的时间段、优选地至少7天的时间段、优选地至少14天的时间段、优选地至少21天的时间段、或更优选地至少28天的时间段提供一种或更多种生物活性剂的持续释放。在一种实施方案中，组合物在施用后约3天至约14天的时间段、优选地约4天至约9天的时间段、更优选地在施用后约7天的时间段提供一种或更多种生物活性剂的峰值释放。在一些实施方案中，一种或更多种生物活性剂的持续释放持续至少一天、优选地至少一周、或更优选地至少一个月的时间段。
84.本发明人还已经出乎意料地表明，本文公开的spf具有使其适合作为生物剂的持续递送媒介物的有利性质，包括它们(i)在溶液中具有足够低的粘度以允许通过注射施用，和(ii)对细胞(包括免疫细胞)无毒(或基本无毒)。
85.在一些实施方案中，spf可以适当地由“智能”聚合物制成，诸如温度或ph响应的聚合物材料或生物聚合物(例如，胶原、壳聚糖、明胶或这些的混合物)，以提供可为期望的应用而操作的另外的独特性质。合适的智能聚合物，包括温度和ph响应的聚合物材料，对本领域技术人员来说是熟悉的，其说明性实例在cohen stuart等人(2010；nature materials,9:101-113)中描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
86.也可以使用例如标准的湿化学方法(例如，通过将官能团结合到纤维表面)来官能化spf，以便允许活性部分(包括本文别处所述的生物活性剂)的附着。可应用于本文公开的spf的用于官能化聚合物材料的合适方法对于本领域技术人员来说是熟悉的，其说明性实例在gong和chen(2016；saudi pharm.j.24(3):254
–
257)中描述。
87.本文所述的spf可用作多种生物活性剂的载体，如本文别处所述。这些可以从功能性小分子(即药物、除草剂等)到更大的生物分子(例如，蛋白质、肽、酶、寡聚体等)。活性剂可以在产生spf后装载到聚合物纤维上。可选地，或者另外，活性剂可以在产生spf的过程中被装载到聚合物纤维中，例如如在wo 2013/056312中所述。
88.术语“装载”应理解为是指一种或更多种生物活性剂被整合、掺入、分散或以其他方式与spf紧密结合，由此活性剂在例如在体内递送组合物时从spf释放。不受理论或特定作用模式的限制，生物活性物质从spf的持续释放至少部分地归因于spf随时间的降解，特别是当装载的spf暴露于促进spf随时间降解的环境中时，如将spf皮下、肌内、经皮(例如，通过经皮贴剂)或血管内施用于受试者的情况。生物活性物质从spf的持续释放也可以至少部分地归因于活性剂以独立于spf降解的方式从spf扩散到环境中。在本文公开的实施方案中，组合物是可注射的组合物。在一种实施方案中，组合物被配制成通过22-25号针头施用。
89.生物相容性聚合物
90.spf可以由任何合适的生物相容性聚合物形成，其说明性实例是本领域技术人员已知的。
91.如本文所用，术语“生物相容性聚合物”通常指当引入生物系统(例如，体外、离体或体内)时，对生物系统或其一部分没有或基本上没有不利影响的聚合物材料。“基本上没有不利影响”应理解为是指聚合物可能对其接触的生物系统有一些(负面和/或正面)影响，但是任何这种影响的程度将是最小的，并且不会导致例如组合物的治疗功效降低。
92.生物相容性聚合物可以是合成的或天然的(即天然存在的)聚合物。合适的天然聚合物的说明性实例包括蛋白质诸如白蛋白、胶原、明胶和醇溶谷蛋白，例如玉米醇溶蛋白，和多糖诸如藻酸盐、纤维素衍生物和聚羟基链烷酸酯，例如聚羟基丁酸酯。
93.生物相容性聚合物可以是可生物降解的聚合物、不可生物降解的聚合物或基本上不可生物降解的聚合物。然而，应该理解，通常期望生物相容性聚合物是可生物降解的，或者基本上可生物降解的，以便避免或最小化聚合物随着时间本来可能对生物系统的影响。
94.在一种实施方案中，生物相容性聚合物是可生物降解的聚合物。合适的可生物降解的聚合物对本领域技术人员来说是已知的，其说明性实例包括多肽、藻酸盐、壳聚糖、淀粉、胶原蛋白、丝心蛋白(silk fibroin)、聚氨酯、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚烯烃、硼酸官能化聚合物、聚乙烯醇、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺和聚乙烯吡咯烷酮、聚(乳酸)、聚醚砜、无机聚合物以及任何前述物质的组合。因此，在本文公开的实施方案中，可生物降解的聚合物选自由以下组成的组：多肽、藻酸盐、壳聚糖、淀粉、胶原蛋白、丝心蛋白、聚氨酯、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚烯烃、硼酸官能化聚合物、聚乙烯醇、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺和聚乙烯吡咯烷酮、聚(乳酸)、聚醚砜、无机聚合物以及任何前述物质的组合。
95.可选择可生物降解的聚合物在一天至一年以上、更优选地7天至26周、更优选地7天至20周、或最优选地7天至16周的时间段降解。应当理解，聚合物的选择可以取决于预期的用途。在一些实施方案中，合成聚合物可以是优选的。在其他实施方案中，天然聚合物可以是优选的。合适聚合物的其它说明性实例包括聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚羟基链烷酸酯，诸如聚3-羟基丁酸酯或聚4-羟基丁酸酯；聚己内酯；聚(原酸酯)；聚酸酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚(乙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯，诸如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；其他生物相容性聚酯；聚(二氧环己酮)；聚(亚烷基烷基化物)；亲水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸酯；聚羟基戊酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸酯；聚(马来酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；聚(氧化烯)
(poly(alkylene oxides))，诸如聚乙二醇(peg)；衍生化纤维素，诸如烷基纤维素(例如甲基纤维素)、羟烷基纤维素(例如羟丙基纤维素)、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物或其共聚物或衍生物，包括酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)(本文统称为“聚丙烯酸”)、以及其衍生物、共聚物和掺合物。如本文所用，“衍生物”包括具有本领域技术人员通常对上述聚合物主链进行取代、添加化学基团和其他修饰的聚合物。天然聚合物，包括蛋白质诸如白蛋白、胶原蛋白、明胶、醇溶谷蛋白诸如玉米醇溶蛋白和多糖诸如藻酸盐和果胶，也可以掺入到spf中。
96.在一种实施方案中，生物相容性聚合物选自由以下组成的组：多肽、藻酸盐、壳聚糖、淀粉、胶原蛋白、丝心蛋白、聚氨酯、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚烯烃、硼酸官能化聚合物、聚乙烯醇、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺和聚乙烯吡咯烷酮、聚(乳酸)、聚醚砜、无机聚合物以及任何前述物质的组合。
97.在一种实施方案中，生物相容性聚合物包括聚(乳酸)。
98.在另一种实施方案中，聚(乳酸)是聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)。在一些实施方案中，聚(乳酸-共-乙醇酸)是聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。
99.在一种实施方案中，聚(乳酸-共-乙醇酸)具有约85:15的丙交酯:乙交酯比率。
100.在一种实施方案中，聚(乳酸-共-乙醇酸)，例如聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)，具有约50kda至约75kda的mw。在另一种实施方案中，聚(乳酸-共-乙醇酸)的mw为约190kda至约240kda。在一种实施方案中，生物相容性聚合物包含具有约50kda至约75kda的mw的第一聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物组分和具有约190kda至约240kda的mw的第二聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物组分的组合。mw是聚合物的重均分子量。在一种实施方案中，plga可以适当地包括不同形式的plga的组合，包括本文描述的那些。优选地，不同形式的plga可以以适于产生具有本文所述的期望性质的spf的比例或绝对量组合。合适的组合可以使用本领域技术人员已知的方法来确定，其说明性实例包括具有约50kda至约75kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)和具有约190kda至约240kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)的组合。因此，在一种实施方案中，plga包含具有约50kda至约75kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)和具有约190kda至约240kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。在另一种实施方案中，plga包含约5％至约50％的具有约50kda至约75kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)和约50％至约95％的具有约190kda至约240kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。在另一种实施方案中，plga包含约5％至约20％的具有约50kda至约75kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)和约80％至约95％的具有约190kda至约240kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。在又另一种实施方案中，plga包含约10％的具有约50kda至约75kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)和约90％的具有约190kda至约240kda的mw的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。
101.在一种实施方案中，组合物包含一种或更多种可交联的spf，该spf包含一个或更多个可光聚合的基团，允许悬浮液中的spf交联。合适的可光聚合基团的说明性实例包括乙烯基基团、丙烯酸酯基团、甲基丙烯酸酯基团和丙烯酰胺基团。可光聚合的基团，当存在时，可以掺入在可交联的spf的主链内、可交联的spf的一个或更多个侧链内、可交联的spf的一
个或更多个末端或它们的组合。
102.在一种实施方案中，spf包含1％w/vrg 858 s(酯封端的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)，丙交酯:乙交酯85:15，mw 190-240kda)和0.234％聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。0.234％的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)可以具有50-75kda的mw。
103.spf可以适当地包含至少一种添加剂。添加剂可以通过在聚合物纤维形成液和/或用于制备spf的分散介质中加入至少一种添加剂而引入到spf中。添加剂可以在制造/挤出过程期间被包含在纤维形成液和/或分散介质中。可选地，或者另外地，添加剂可以通过在制造spf之后将添加剂加入到spf中而被引入到spf中。合适的添加剂的说明性实例包括着色剂(例如荧光染料和颜料)、增味剂、除味剂、增塑剂、抗冲击改性剂(impact modifier)、填充剂、成核剂、润滑剂、表面活性剂、湿润剂、阻燃剂、紫外光稳定剂、抗氧化剂、杀生物剂、增稠剂、热稳定剂、消泡剂、发泡剂(blowing agent)、乳化剂、交联剂、蜡、颗粒、流动性促进剂、凝结剂(包括：水、有机和无机酸、有机和无机碱、有机和无机盐、蛋白质、配位络合物和两性离子)、多功能连接剂(linker)(例如均质多功能和异质多功能连接剂)和添加用来增强聚合组分的可加工性或最终使用性能的其他物质。这些添加剂可以以本领域技术人员已知的常规量使用。
104.生物活性剂
105.如本文所用，术语“生物活性剂”是指无论在体外、离体还是在体内，能够在生物系统中引发生理应答的任何合成或天然来源的分子。
[0106]“一种或更多种生物活性剂”是指1、2、3、4、5、6、7种等生物活性剂。在一种实施方案中，组合物包含至少1种生物活性剂、优选地至少2种生物活性剂、优选地至少3种生物活性剂、优选地至少4种生物活性剂、优选地至少5种生物活性剂、优选地至少6种生物活性剂、优选地至少7种生物活性剂、优选地至少8种生物活性剂、优选地至少9种生物活性剂、或更优选地至少10种生物活性剂。
[0107]
合适的生物活性剂对本领域技术人员来说是已知的，其选择可能取决于本文公开的组合物的预期治疗、预防和/或诊断用途，诸如待治疗的疾病或紊乱的性质或类型。合适的生物活性剂的说明性实例包括小分子药物、激素、抗微生物化合物、抗微生物蛋白、抗病毒剂、类固醇、化疗药物、配体、结合剂(例如适体、小干扰rna、抗体及其抗原结合片段，包括治疗性抗体及其抗原结合片段)、细胞裂解物、细胞因子、生长因子、融合蛋白、免疫原、抗原、病毒、病毒蛋白、细菌、细菌蛋白及其片段、细菌细胞裂解物、激素和核酸分子，包括编码任何一种或更多种前述物质的核酸分子。应当理解，本文公开的组合物可以包含一种或更多种选自一个或更多个类别的生物活性剂，包括一个或更多个前述类别。相反，当本文公开的组合物包含两种或更多种生物活性剂时，生物活性剂可以属于同一类活性剂。
[0108]
在一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂选自由以下组成的组：激素、抗微生物剂、抗病毒剂、类固醇、化疗药物、治疗性结合剂(例如适体、抗体或其抗原结合片段)、细胞因子、免疫原和核酸分子。
[0109]
在一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括免疫原。术语“免疫原”被理解为是指能够在体内引起免疫应答，包括体液(抗体)应答的肽或蛋白质。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在最广泛的意义上可互换使用，指两个或更多个氨基酸残基或氨基酸类似物的分子。氨基酸残基可以通过肽键连接，或者可选地通过其他键例如酯、醚等连接，但大多数情
况下会通过肽键连接。术语“氨基酸”或“氨基酸残基”在本文中用于涵盖天然和非天然或合成氨基酸二者，包括d-或l-形式二者以及氨基酸类似物。“氨基酸类似物”应理解为在一个或更多个原子处不同于其相应天然存在的氨基酸的非天然氨基酸。例如，半胱氨酸的氨基酸类似物可以是高半胱氨酸。合适的免疫原将是本领域技术人员熟悉的，注意免疫原的选择也将在很大程度上取决于预期的治疗或预防用途。合适的免疫原的说明性实例包括肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、病毒、病毒抗原、细菌、细菌细胞裂解物、癌症相关抗原和编码任何一种或更多种前述物质的核酸分子。因此，在本文公开的实施方案中，免疫原选自由以下组成的组：肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、病毒、病毒抗原、细菌、细菌细胞裂解物、癌症相关抗原和编码任何一种或更多种前述物质的核酸分子。
[0110]
在另一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括融合蛋白。如本文所用，术语“融合蛋白”通常是指以在自然界中原本不会发生的产生肽的方式连接两个或更多个肽序列(例如免疫原)。在一种实施方案中，融合蛋白包含两个或更多个彼此首尾相连的肽序列。在一种实施方案中，融合蛋白包含通过合适的连接部分(在本文中也称为接头)以线性配置相互连接的两个或更多个肽序列。连接肽序列的合适方法将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括肽(酰胺)键和接头。如本文所用，术语“接头”是指插入本文所述的任何两个相邻肽序列之间的短多肽序列。在一种实施方案中，接头是1至10个氨基酸，优选地1、2、3、4或5个天然或非天然存在的氨基酸的多肽接头。在一种实施方案中，接头是碳水化合物接头。合适的碳水化合物接头是本领域技术人员已知的。在本文公开的另一种实施方案中，融合蛋白包含一个或更多个肽或多肽接头以及一个或更多个其他非肽或非多肽接头。此外，不同类型的接头，肽的或非肽的，可以根据需要掺入同一融合肽中。在使用肽或多肽接头来连接两个相应的肽序列的情况下，接头将被有利地掺入，使得其n末端通过肽键结合到一个肽序列的c末端，并且其c末端通过肽键结合到另一个肽序列的n末端。融合蛋白内的单个肽序列也可以在一个末端或两个末端，优选地在c末端，添加一个或更多个氨基酸。因此，例如，可以将接头或间隔氨基酸添加到肽的n末端或c末端或n末端和c末端二者，以连接肽并允许肽方便地彼此偶联和/或偶联到递送系统，诸如用作锚的载体分子。合适的肽接头的说明性实例是lp(亮氨酸-脯氨酸)。本文还设想了融合蛋白，其包含串联重复连接两次或更多次的至少两个肽序列。不受理论或特定应用模式的限制，应当理解，如本文所述，将两种或更多种不同的肽序列掺入融合肽中可以通过引发与包含本文公开的单个肽序列的免疫原相比更高的抗体滴度来产生更有益的免疫应答。如本文所述，制备融合蛋白的合适方法将是本领域技术人员熟悉的。一个说明性的实例包括肽合成，其包括顺序形成肽键，将本文所述的每个肽序列连接到其各自相邻的肽序列，并回收所述融合肽。说明性的实例包括“amino acid and peptide synthesis”(oxford chemistry primers；john jones,oxford university press)中描述的方法。合成肽也可以在不同的固体支持物(例如聚苯乙烯、聚酰胺或peg)上通过液相合成或固相肽合成(spps)来制备。spps可以包括使用f-moc(9h-芴-9-基甲氧羰基)或t-boc(叔丁氧羰基)。定制肽也可从许多商业制造商处获得。可选地，可以通过重组方法制备融合蛋白。例如，可以将包含编码融合蛋白的核酸序列的核酸分子转染到能够表达所述核酸序列的合适宿主细胞中，在适合于表达所述核酸序列的条件下孵育所述宿主细胞，并回收所述融合蛋白。基于遗传密码的知识，用于制备编码融合蛋白的核酸分子的合适方法对于本领域技术人员来说也是已知的，可能包括基于用于表达和/或分泌重
组融合蛋白的宿主细胞(例如微生物)的性质优化密码子。合适的宿主细胞也是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括原核细胞(例如大肠杆菌(e.coli))和真核细胞(例如巴斯德毕赤酵母(p.pastoris))。参考“short protocols in molecular biology,5th edition,2volume set:a compendium of methods from current protocols in molecular biology”(frederick m.ausubel(作者,编者),roger brent(编者),robert e.kingston(编者),david d.moore(编者),j.g.seidman(编者),john a.smith(编者),kevin struhl(编者),j wiley&sons,london)。
[0111]
在一种实施方案中，免疫原是肿瘤细胞裂解物。本领域技术人员将理解，肿瘤细胞裂解物的选择将取决于待治疗或预防的疾病或紊乱的类型。肿瘤细胞裂解物通常从源自癌症的肿瘤细胞样品制备。例如，当癌症是肝部的癌症时，肿瘤细胞裂解物可以合适地从一种或更多种来源于待治疗的受试者的肿瘤的癌细胞制备。在一种实施方案中，肿瘤细胞是胶质母细胞瘤肿瘤细胞。在优选的实施方案中，胶质母细胞瘤是多形性胶质母细胞瘤。
[0112]
在一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括细胞因子。合适的细胞因子是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括白细胞介素4(il-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。因此，在本文公开的实施方案中，细胞因子是gm-csf。
[0113]
在另一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括激素。合适的激素是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括胰岛素和生长激素(somatotropin)，以及类固醇激素，诸如皮质类固醇、雌激素、孕激素和雄激素。本公开内容还扩展到肽激素的使用。“肽激素”通常被理解为对受试者的内分泌系统有影响的肽或蛋白质。合适的肽激素的说明性实例是生长激素。生长激素刺激人类和非人类动物的生长、细胞繁殖和细胞再生，并且对生长和发育很重要。
[0114]
在本文公开的另一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括结合剂，其说明性实例是本领域技术人员已知的，并且包括适体、抗体及其抗原结合片段。结合剂可以是针对感兴趣的靶抗原，诸如病毒蛋白或癌症相关抗原的治疗性抗体。在其他实施方案中，抗体可用于将装载的spf靶向感兴趣的生物位点(即靶向抗体或其结合片段)。
[0115]
在一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括癌症相关抗原。术语“癌症相关抗原”、“与癌症相关的抗原”、“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”、“癌症抗原”等在本文中可互换使用，表示在癌细胞或组织中异常表达的抗原。在一些实施方案中，抗原可以在正常条件下在有限数量的组织和/或器官中或在特定的发育阶段中表达。例如，抗原可以在正常条件下在胃组织中特异性表达，并且在一种或更多种癌细胞中表达或异常表达(例如过表达)。抗原的表达可以在癌细胞或组织中重新激活，而与癌症的来源无关。在一些实施方案中，癌症相关抗原包括分化抗原，优选地细胞类型特异性分化抗原(即，在正常条件下在某一分化阶段在某一细胞类型中特异性表达的蛋白质)、癌症/睾丸抗原(即，在正常条件下在睾丸中，有时在胎盘中特异性表达的蛋白质)和种系特异性抗原。
[0116]
在一种实施方案中，癌症相关抗原在癌细胞的细胞表面上表达，并且优选地在正常细胞和组织上不表达或仅很少表达。优选地，抗原或抗原的异常表达识别癌细胞，优选地肿瘤细胞。在一些实施方案中，受试者(例如，罹患癌症的患者)中由癌细胞表达的抗原是一种自身蛋白。然而，应当理解，在正常条件下，在携带抗原的受试者(通常为没有癌症的健康患者)中，通常没有发现可检测水平的针对该抗原的自身抗体，或者这种自身抗体只能以低
于损伤携带抗原的组织或细胞必需的阈值浓度的量被发现。合适的癌症相关抗原对本领域技术人员来说是已知的，其说明性实例包括egfr(例如，her2/neu、her-1)、bage(b黑色素瘤抗原)、cea (癌胚抗原)、cpg(胞嘧啶-磷酸二酯鸟嘌呤)、gp100(糖蛋白100)、h-tert(端粒酶逆转录酶)、mage(黑色素瘤抗原编码基因)、melan-a(t细胞识别的黑色素瘤抗原)和muc-1(粘蛋白-1)。因此，在一种实施方案中，癌症相关抗原选自由以下组成的组：egfr(例如，her2/neu、her-1)、bage(b黑色素瘤抗原)、cea(癌胚抗原)、cpg(胞嘧啶-磷酸二酯鸟嘌呤)、gp100(糖蛋白100)、h-tert(端粒酶逆转录酶)、mage(黑色素瘤抗原编码基因)、melan-a(t细胞识别的黑色素瘤抗原)和muc-1(粘蛋白-1)。还应当理解，将是通过本文公开的方法产生的疫苗组合物的靶的抗原的选择通常将取决于疫苗组合物的预期用途。例如，如果疫苗组合物旨在治疗患有乳腺癌的受试者，则抗原通常将是与乳腺癌相关(例如，由乳腺癌过度表达)的抗原。与乳腺癌相关的抗原的合适实例将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括表皮生长因子受体her2/neu和her1。合适的癌症相关抗原的其他说明性实例包括肾母细胞瘤-1(wt1)、存活蛋白(survivin)和巨细胞病毒(cmv)。
[0117]
在本文公开的一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括选自由肾母细胞瘤-1(wt1)、存活蛋白和巨细胞病毒(cmv)组成的组的癌症相关抗原。
[0118]
在本文所述组合物的装载spf中的一种或更多种生物活性剂的量将根据例如spf的溶解度和生物活性剂的特性(例如，生物活性剂的大小、净电荷、分子量)而变化。这在本文也称为“装载率”；也就是说，装载spf中生物活性剂的量占装载spf的总重量的比例。在一种实施方案中，装载spf中的一种或更多种生物活性剂的量为装载spf总重量的按重量计约5％至约95％。在一种实施方案中，装载spf中一种或更多种生物活性剂的量为装载spf的总重量的按重量计约10％至约60％。在一种实施方案中，装载spf中的一种或更多种生物活性剂的量为装载spf的总重量的按重量计约20％至约50％。在一种实施方案中，装载的spf中一种或更多种生物活性剂的量为装载的spf总重量的按重量计约30％至约50％。
[0119]
在本文公开的一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂通过与接头或掺入到spf中的其他功能部分附着而间接掺入到spf中。合适的接头和功能部分将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括生物素、链霉亲和素、免疫球蛋白及其抗原结合片段(例如，fab、scfv)和核酸分子。例如，spf可以装载生物素，并且装载生物素的spf随后与一种或更多种已经附着了链霉亲和素的生物活性剂组合，由此链霉亲和素-剂复合物结合装载spf内的生物素，以产生装载有一种或更多种生物活性剂的spf。类似地，spf可以装载特异性结合生物活性剂的免疫球蛋白或其抗原结合片段，并且装载spf随后在允许剂结合免疫球蛋白或其抗原结合片段的条件下与生物活性剂组合以产生装载有一种或更多种生物活性剂的spf。本公开内容延伸到接头或功能部分通过共价或非共价力结合到一种或更多种生物活性剂的实施方案。
[0120]
佐剂
[0121]
在一种实施方案中，一种或更多种生物活性剂包括佐剂。本文使用的术语“佐剂”是指能够增强受试者对一种或更多种生物活性剂的生理应答的化合物或物质。在一种或更多种生物活性剂包含免疫原的情况下，佐剂可以通过增加对免疫原的抗体应答来增强受试者对免疫原的免疫应答并从而延长免疫反应的持续时间。因此，与单独施用一种或更多种生物活性剂或不存在佐剂相比，佐剂可与有助于促进受试者对一种或更多种生物活性剂的
更有效的生理应答。
[0122]
在一些实施方案中，佐剂可用于改变生物活性剂在体内的释放。与单独施用生物活性剂或不施用佐剂相比，调节释放可以使用更少量或更少剂量(fewer doses)的生物活性剂提供更持久或更高水平的递送。
[0123]
佐剂可以存在于组合物的油包水乳液中，并且可以在乳液的油相中或水相中。在组合物的一些实施方案中，乳液的油相和水相可以各自包含佐剂。
[0124]
在本文公开的一种实施方案中，佐剂是亲水性和水溶性的。合适的亲水性佐剂将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括明矾、耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)的水溶性提取物、合成的n-乙酰基-胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺、单酰基脂肽和toll样受体的配体。这样的佐剂可以掺入水性液体中和/或在水相的水凝胶颗粒中。
[0125]
在一种实施方案中，佐剂是亲脂性和油溶性的。在一些实施方案中，油本身可以是佐剂，并且因此油相包含佐剂油。使用佐剂油可以是期望的，因为它避免了在本发明的组合物中掺入单独的佐剂化合物的需要。合适的佐剂油的说明性实例将是本领域技术人员熟悉的。
[0126]
在其他实施方案中，佐剂是溶解或悬浮在非佐剂(被动)油中的亲脂性佐剂。
[0127]
如本文别处所述，合适的佐剂是本领域技术人员已知的。可用于本文公开的组合物的佐剂可以是无机佐剂或有机佐剂。本领域技术人员将理解，特定佐剂的选择可能取决于待递送给受试者的一种或更多种生物活性剂、待由活性剂治疗的疾病或紊乱以及一种或更多种生物活性剂所需的释放曲线。合适佐剂的说明性实例包括不完全弗氏佐剂(ifa)、佐剂65(含有花生油、甘露醇单油酸酯和单硬脂酸铝)、油乳剂、ribi佐剂、pluronic多元醇、多胺、avridine、quil a、皂苷、mpl、qs-21、矿物凝胶和铝盐诸如氢氧化铝和磷酸铝。其他说明性实例包括水包油乳液，诸如saf-1、saf-0、mf59、seppic isa720，以及其他颗粒佐剂，诸如iscom和iscom基质。
[0128]
在一种实施方案中，佐剂是toll样受体(tlr)激动剂。合适的tlr激动剂将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例在smith m.等人.(2018；oncoimmunology,7(12):e1526250)中描述。在一种实施方案中，tlr激动剂是cpg寡核苷酸(cpg-odn)。
[0129]
在一种实施方案中，cpg-odn在装载到spf上之前与蛋白质、化学物质或肽分子缀合。
[0130]
在一种实施方案中，佐剂包含病原体相关分子模式分子(pamp)靶向部分。pamp是与被先天免疫系统的细胞识别的病原体群相关的小分子基序。它们被植物和动物二者中的toll样受体(tlr)和其他模式识别受体(prr)识别。它们通过识别一些保守的非自身分子来激活先天免疫应答，保护宿主免受感染。例如，一种在细菌的细菌细胞膜上发现的内毒素细菌脂多糖(lps)，被认为是原型pamp。lps被先天免疫系统的识别受体tlr 4特异性识别。合适的pamp的其他说明性实例包括细菌鞭毛蛋白(由tlr 5识别)、来自革兰氏阳性细菌的脂磷壁酸、肽聚糖和由tlr 3识别的通常与病毒相关的核酸变体，诸如双链rna(dsrna)或由tlr 9识别的未甲基化cpg基序。一个或更多个pamp可用于增强针对感染性疾病的免疫应答。
[0131]
本文还公开了包含短生物相容性聚合物纤维(spf)的疫苗组合物，其中spf包含聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)，平均直径在约15nm至约5μm的范围中，并且平均长度在约
1μm至约3mm的范围中；并且其中spf装载有(i)选自由肿瘤细胞裂解物和癌症相关抗原组成的组的免疫原；(ii)细胞因子和(iii)佐剂。在本文公开的实施方案中，疫苗组合物是可注射的组合物。在一种实施方案中，疫苗组合物被配制成通过22-25号针头施用。
[0132]
在一种实施方案中，免疫原是肿瘤细胞裂解物。在一种实施方案中，肿瘤细胞是胶质母细胞瘤肿瘤细胞。在一种实施方案中，胶质母细胞瘤是多形性胶质母细胞瘤。在一种实施方案中，细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。在一种实施方案中，佐剂是cpg寡核苷酸(cpg-odn)。
[0133]
在一种实施方案中，本发明提供了一种包含短生物相容性聚合物纤维(spf)的疫苗组合物，其中spf包含聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)，平均直径在约15nm至约5μm的范围中，并且平均长度在约1μm至约3mm的范围中；并且其中spf装载有(i)胶质母细胞瘤的肿瘤细胞裂解物和/或癌症相关抗原；(ii)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)；和(iii)cpg寡核苷酸(cpg-odn)。在一种实施方案中，spf包含1％的rg 858 s、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)和约0.2％的聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)。在本文公开的实施方案中，疫苗组合物是可注射的组合物。在一种实施方案中，疫苗组合物被配制成通过22-25号针头施用。
[0134]
组合物和治疗方法
[0135]
如本文别处所述，本发明人已经惊奇地发现，spf是用于持续递送一种或更多种生物活性剂的合适的生物相容性递送媒介物，并且能够在不损害生物活性剂完整性的情况下做到这一点。因此，spf特别适用于体内递送生物活性剂。因此，在本文公开的一个方面，提供了一种向有相应需要的受试者递送生物活性剂的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的组合物。
[0136]
本文还公开了一种治疗或预防有相应需要的受试者的疾病或紊乱的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的组合物。
[0137]
本文使用的术语“受试者”是指需要治疗或预防的哺乳动物受试者。本发明可针对的对象的说明性实例包括灵长类动物尤其是人类，伴侣动物诸如猫和狗等，工作动物诸如马、驴等，家畜动物诸如绵羊、牛(cow)、山羊、猪等，实验室试验动物诸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等，以及圈养野生动物诸如动物园和野生动物园中的野生动物，鹿、野狗等。因此，应当理解，本文公开的组合物具有临床和兽医应用。在一种实施方案中，受试者是人类。术语“受试者”不表示特定年龄。因此，本文设想了新生儿、青少年、成人和老年受试者。
[0138]
本文公开的组合物也适用于兽医应用。因此，在特定实施方案中，受试者是家畜，诸如牛(cattle)、绵羊或猪。
[0139]
术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文中也可互换使用，表示缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制受试者的疾病或紊乱(包括其一种或更多种症状)的进展。术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文中也可互换使用，表示在可能易患或处于疾病或紊乱风险但尚未被诊断为患有疾病或紊乱的受试者中防止疾病或紊乱的发生或延迟疾病或紊乱的发作或随后的进展。在该上下文中，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等可与术语诸如“预防(prophylaxis)”、“预防(prophylactic)”和“预防(preventive)”互换使用。如本文所用，“治疗”疾病或紊乱的组合物将理想地通过消除疾病或紊乱的潜在原因来完全消除疾病或紊乱，从而疾病或紊乱不会发展或再发展。如本文
所用，“改善”疾病或紊乱的组合物不会消除疾病的潜在原因，但会降低疾病或紊乱的严重程度，如通过任何已建立的分级系统所测量的和/或通过受试者健康状况的改善所测量的，例如疼痛和/或不适的减少。
[0140]
本文还设想了通过使用一种或更多种另外的治疗剂来治疗疾病或紊乱的辅助疗法(adjunct therapy)。不受理论或特定应用模式的限制，通常应理解，如本文所述，使用第二免疫原可为治疗受试者的疾病或紊乱提供增强的免疫应答。
[0141]
在一些体内方法中，组合物以治疗有效量被施用至受试者。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以减轻、减少、缓解、改善或以其他方式抑制受试者疾病或紊乱和/或其一种或更多种症状的进展，或以其他方式提供期望的药理学和/或生理学效果的量。组合物的精确剂量将通常取决于其中装载的一种或更多种生物活性剂的量，并且还可以根据各种另外的因素而变化，诸如受试者相关变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病或紊乱的类型和/或严重程度、以及正在进行的治疗。
[0142]
特别是对于体内应用，本文公开的组合物的合适施用途径将是本领域技术人员熟悉的，并且将可能取决于待治疗疾病或紊乱的类型、严重程度和/或位置。在一种实施方案中，组合物被配制用于向受试者皮下施用。在期望针对免疫原的治疗有效的免疫应答的情况下，皮下施用特别适合于包含免疫原的组合物。例如，在施用后，spf将随着时间而降解，以持续释放免疫原。spf的这一有利特性减缓了免疫原在注射部位的原本立即和迅速的扩散。由于spf在储存期间和施用时也有利地保护免疫原，本文公开的组合物在体内提供了针对免疫原的更有效的局部免疫应答。如本文别处所述，本发明人已经意外地发现，spf的组合物可以在延长的时间段保护一种或更多种生物活性剂的生物活性。“保护”是指被掺入到spf中的一种或更多种生物活性剂的至少一些生物活性被保留，使得在从spf释放后，一种或更多种生物活性剂保持足够量的它们的生物活性。应当理解，从spf释放的生物活性剂不必保持其全部(即100％)生物活性(即，与掺入spf之前的生物活性水平相比时)，并且生物活性剂保持其至少一些生物活性至其能够在释放后发挥其生物活性的程度是足够的。在一种实施方案中，与掺入spf之前的其活性相比，一种或更多种生物活性剂在从spf释放时保持了其生物活性的至少10％(例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。在一种实施方案中，与掺入spf之前的其活性相比，一种或更多种生物活性剂在从spf释放时保持其生物活性的至少10％，优选地其生物活性的至少20％，优选地其生物活性的至少30％，优选地其生物活性的至少40％，优选地其生物活性的至少50％，优选地其生物活性的至少60％，优选地其生物活性的至少70％，优选地其生物活性的至少80％，或更优选地其生物活性的至少90％。本发明人已经令人惊讶地表明，掺入到spf中的剂的生物活性在至少3至28天的时间段(例如，3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天等)得以保持。在本文公开的实施方案中，当掺入到spf中时，一种或更多种生物活性剂保持其生物活性至少3天的时间段、优选地至少7天的时间段、优选地至少14天的时间段、优选地至少21天的时间段或更优选地至少28天的时间段。在一种实施方案中，组合物被配制用于向受试者肌内施用。在一种实施方案中，组合物被配制用于向受试者经皮施用。
[0143]
在一种实施方案中，组合物向受试者皮下施用。
[0144]
应当理解，本文公开的组合物适用于治疗可通过施用一种或更多种生物活性剂治
疗的任何疾病或紊乱，特别是当这种治疗在体内施用时对一种或更多种生物活性剂的持续释放响应时。通过施用本文公开的组合物可以治疗的疾病和紊乱将是本领域技术人员熟悉的。其说明性实例包括癌症、病毒感染、细菌感染和自身免疫性疾病。在一种实施方案中，疾病或紊乱是癌症。可由本文公开的组合物治疗的癌症类型的说明性实例将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括白血病、精原细胞瘤(seminoma)、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌(intestinal cancer)、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌(intestine cancer)、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ent)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌、肺上皮癌、前列腺上皮癌、结肠上皮癌、肾细胞上皮癌、宫颈上皮癌及其转移。在一种实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。在一种实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。
[0145]
在一种优选的实施方案中，本文公开的组合物用作疫苗策略的一部分。例如，组合物可用于递送抗原、免疫刺激剂、佐剂或其组合。在一些实施方案中，组合物包括将递送媒介物导向特定免疫细胞，例如抗原呈递细胞诸如树突状细胞的靶部分。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种展示在外壳上的抗原呈递细胞靶向部分，和tlr配体，单独或与抗原/免疫原组合。抗原/免疫原可以是任何已知的抗原/免疫原，例如来源于细菌、病毒、真菌、寄生虫或另一种微生物的抗原、环境抗原或癌症相关抗原，如本文别处所述。
[0146]
在另一方面，提供了一种如本文所述的组合物，用于向有相应需要的受试者递送一种或更多种生物活性剂。
[0147]
另一方面，提供了一种如本文所述的组合物，当向有相应需要的受试者施用时用于治疗或预防疾病或紊乱。
[0148]
另一方面，提供了如本文所述的组合物在制备用于治疗或预防有相应需要的受试者的疾病或紊乱的药物中的用途。
[0149]
可以使用本文公开的组合物和方法治疗的其他疾病的非限制性实例包括病毒或微生物感染性疾病，其中抗病毒或抗生素联合方案分别是期望的策略。例如，抗hiv制剂可以包括启动hiv复制的激活剂、防止新细胞感染hiv的抑制剂和死亡诱导剂的混合物，死亡诱导剂只在被感染的细胞内被激活，不会对其他细胞造成伤害。spf可以用特异性附着于在所有人类t细胞上表达的分子的抗体(或其抗原结合片段)制造。这用作保护被包裹的组分并与目标t细胞融合的靶向媒介物。
[0150]
本文公开的组合物可用于向需要这样的治疗的个体递送有效量的一种或更多种治疗剂、诊断剂和/或预防剂。向有相应需要的受试者递送的一种或更多种生物活性剂的量可以由处方医生容易地确定，并且可能取决于受试者相关变量，诸如年龄、体重和待治疗疾病或紊乱的性质和/或严重程度。
[0151]
组合物也可用于药物递送(本文所用的“药物”包括治疗剂、营养剂、诊断剂和预防剂)，无论是静脉内、皮下、经皮(例如，通过经皮贴剂)或肌内注射，施用至鼻或肺系统，注射至肿瘤环境，施用至粘膜表面(阴道、直肠、口腔、舌下)，或包封用于口服递送。
[0152]
组合物也可用于多核苷酸的细胞转染。如下所述，转染可以在体外或体内进行，并且可以用于多种应用，包括基因治疗和疾病治疗。
[0153]
可由本文公开的组合物递送的合适的多核苷酸可以由本领域技术人员根据待治
疗的疾病或紊乱容易地确定，并且在一些情况下将编码生物和/或治疗剂，诸如免疫原，包括本文别处描述的那些。多核苷酸可以是感兴趣的基因或cdna、功能性核酸分子诸如抑制性rna、trna、rrna、sirna、shrna、mrna或指导rna或编码感兴趣的基因或cdna、功能性核酸诸如抑制性rna、trna、rrna、sirna、shrna、mrna或指导rna的表达载体。在一些实施方案中，多核苷酸包含官能团。合适的官能团将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括可检测部分(例如，荧光标记/染料、放射性同位素、生物素、链霉亲和素等)。
[0154]
在一些实施方案中，多核苷酸没有被整合到宿主细胞的基因组中，而是保持在染色体外。这样的实施方案可用于多核苷酸的瞬时或调节表达，并可降低插入突变形成的风险。
[0155]
在一些实施方案中，多核苷酸被整合到宿主细胞的基因组中。例如，基因治疗是一种纠正导致疾病发展的缺陷基因的技术。研究人员可以使用若干方法中的一种来纠正有缺陷的基因。例如，(a)可以将正常基因插入基因组内的非特异性位置，以取代无功能基因；(b)可以通过同源重组将异常基因换成正常基因；(c)可以通过选择性反向突变修复异常基因，以期使基因恢复其正常功能；或者(d)可以改变特定基因的调节(基因开启或关闭的程度)。
[0156]
基因治疗可以包括使用病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、aids病毒、神经元营养型病毒(neuronal trophic virus)、辛德比斯病毒和其他rna病毒，包括具有hiv主链的这些病毒。同样有用的是共享使这些病毒适合用作载体的特性的任何病毒家族。通常，病毒载体包含非结构性早期基因、结构性晚期基因、rna聚合酶iii转录物、复制和封装所需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当被工程化为载体时，病毒通常移除了一个或更多个早期基因，并且基因或基因/启动子盒被插入病毒基因组中以代替被移除的病毒dna。
[0157]
通过靶重组诸如同源重组(hr)进行基因靶向是另一种基因纠正策略。靶基因座的基因纠正可以通过与靶基因同源的供体dna片段来介导。一种靶向重组的方法包括使用三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotide，tfo)，其以序列特异性方式作为第三链结合到双链体dna中的高嘌呤/高嘧啶位点。三链体形成寡核苷酸可以与双链或单链核酸相互作用。使用三链体形成寡核苷酸(tfo)和肽核酸(pna)进行靶向基因治疗的合适方法将是本领域技术人员熟悉的，诸如在us 2007-0219122和us 2008-050920中描述的那些方法。
[0158]
双链体形成分子，诸如一对假互补寡核苷酸，也可以在染色体位点诱导与供体寡核苷酸的重组。在us 2011-0262406中描述了在靶向基因治疗中使用假互补寡核苷酸。假互补寡核苷酸是这样的互补寡核苷酸，所述互补寡核苷包含一个或更多个修饰使得所述互补寡核苷酸不相互识别或杂交(例如由于空间位阻)，但是每个互补寡核苷酸可以在靶位点识别互补核酸链并与之杂交。在一些实施方案中，假互补寡核苷酸是假互补肽核酸(pcpna)。与需要靶双链dna中的多嘌呤序列的诱导重组方法诸如三螺旋寡核苷酸和双肽核酸相比，假互补寡核苷酸可以更有效，并提供更高的靶位点灵活性。
[0159]
如本文别处所述，要求初始注射后接着进行一次或更多次后续注射或加强注射的方案可以简化，因为本文公开的组合物提供的延长的生物利用度意味着单次注射可以获得有效的生理益处，因此消除了施用后续或加强注射的需要。例如，本文公开的包含免疫原的
组合物可以在单次注射后在受试者中诱导有效的保护性免疫(即抗体水平)，而不需要随后的单次或多次跟随(follow up)注射。有效的免疫水平可以维持数周。在一些实施方案中，免疫的有效水平可以保持数个月，并且在一种实施方案中，免疫可以维持一年以上。因此，减少注射次数的能力可以为接受注射的受试者提供更多的便利，并为制造商和消费者节省成本。
[0160]
在使用时，该组合物可以被包含在注射器腔室中，并注射通过针头的内腔，用于向受试者施用。在一种实施方案中，组合物可以通过23号针头适当施用。
[0161]
在又另一个方面，本发明提供了一种向受试者递送生物活性剂的方法，包括通过注射向受试者施用本文所述组合物的步骤。
[0162]
本公开内容还延伸至包含装载spf的一个或更多个异质子集的组合物，其中装载spf的每个子集包含不同的生物活性剂。例如，本文所述的组合物可以包含装载有第一生物活性剂的第一spf和装载有第二生物活性剂的第二spf，其中第一生物活性剂不同于第二生物活性剂。如本文所述，当第一和第二生物活性剂的性质由于第一和第二生物活性剂的性质(例如，它们的结构、浓度、溶解度、离子强度等)而不能一起掺入(或有效掺入)到spf中时，这可以是期望的。因此，在期望将第一生物活性剂和第二或随后的生物活性剂掺入到组合物中的情况下，如本文所述，第一生物活性剂可以掺入到spf的第一子集中，并且第二或随后的生物活性剂可以掺入到spf的第二或随后的子集中，并且装载spf的第一和第二和/或随后的子集组合形成本文所述的组合物。可选地，第一生物活性剂可以掺入spf的第一子集中，并且第二和/或随后的生物活性剂可以掺入spf的第二和/或随后子集中，并且装载spf的第一和第二和/或随后子集分别配制用于向有相应需要的受试者顺序施用。
[0163]
制造方法
[0164]
在本发明的一种实施方案中，提供了一种制备用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物的方法，该方法包括：
[0165]
(a)将生物相容性聚合物纤维形成液的流引入具有约1至100厘泊(cp)的范围中的粘度的分散介质中；
[0166]
(b)在分散介质中由(a)的纤维形成液的流形成长丝；
[0167]
(c)在允许长丝断裂和形成短生物相容性聚合物纤维(spf)的条件下剪切(b)的长丝，其中spf具有在约1μm至约3mm的范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm的范围中的平均直径；和
[0168]
(d)用一种或更多种生物活性剂装载(c)的spf；
[0169]
从而产生用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物。
[0170]
在本文公开的另一方面，提供了一种制备用于持续释放一种或更多种生物活性剂的组合物的方法，该方法包括：
[0171]
(a)提供包含(i)可生物降解的聚合物纤维形成液和(ii)一种或更多种生物活性剂的混合物；
[0172]
(b)将(a)的混合物流引入具有在约1至100厘泊(cp)的范围中的粘度的分散介质中；
[0173]
(b)在分散介质中由(a)的流形成长丝；
[0174]
(c)在允许长丝断裂和形成短生物相容性聚合物纤维(spf)的条件下剪切(b)的长
丝，其中所述spf具有在约1μm至约3mm的范围中的平均长度以及在约15nm至约5μm的范围中的平均直径。
[0175]
可选地，或者另外，一种或更多种生物活性剂可以在形成spf之后掺入(即装载)到spf中。例如，本文所述的spf一旦形成，可在足以允许一种或更多种生物活性剂掺入到spf中的条件下和时间内与一种或更多种生物活性剂组合以形成装载spf。因此，在本文公开的实施方案中，提供了一种制备用于快速和持续递送一种或更多种生物活性剂的组合物的方法，该方法包括：
[0176]
(a)提供如本文所述的短生物相容性聚合物纤维(spf)；和
[0177]
(b)在足以允许一种或更多种生物活性剂掺入spf中的条件下和时间内将spf暴露于如本文所述的一种或更多种生物活性剂，从而形成装载有一种或更多种生物活性剂的spf。
[0178]
在一些实施方案中，必要时可以重复步骤(b)，以增加一种或更多种生物活性剂在装载spf中的掺入率。可选地或另外，该方法还可以包括：(c)通过将装载spf暴露于一种或更多种另外的生物活性剂来重复步骤(b)，其中一种或更多种另外的生物活性剂不同于步骤(b)的一种或更多种生物活性剂，从而形成装载有两种或更多种不同生物活性剂的spf。这可以是有利的，例如，在疫苗组合物中，此时期望使用装载spf的单一组合物来提高针对多种免疫原的免疫应答。
[0179]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的材料和方法相似或等同的任何材料和方法可被用来实践或测试本发明，现在描述了优选的材料和方法。
[0180]
现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例说明了本发明的一些优选方面。然而，应当理解，本发明以下描述的特殊性并不取代本发明前述描述的一般性，并且在不脱离本发明精神的情况下，可以进行各种其他修改和/或改变，如本文所公开的。
实施例
[0181]
实施例1-短生物相容性聚合物纤维(spf)的制造
[0182]
通过对先前在wo 2013/056312(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的方法的修改来制造spf。
[0183]
简而言之，将聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(酯封端；分子量50-75kda)(plga1)以不同浓度(0.234％w/v、0.47％w/v和0.94％w/v)与1％w/v的rg 858 s(聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)酯封端，丙交酯:乙交酯85:15，mw 190-240kda)混合在dmso溶液中，或单独在dmso中使用(1.88％w/v和3.75％w/v)。还使用了单独的resomer(dmso中1％w/v、2％w/v和4％w/v)。向1-丁醇(洗涤溶液)中加入5％w/v吐温80作为表面活性剂，以防止spf聚集。研究了多种凝固液(乙醇、80％v乙醇和20％v 1-丁醇)。不同的针头尺寸(23g和25g)与多种洗涤方案一起进行了试验。
[0184]
以下研究中使用的spf制造的最佳方案包括1％w/v的resomer和0.234％w/v的plga1，使用1-丁醇作为胶凝液和25g针头。洗涤液由丁醇中的5％w/v吐温80、80％w/v乙醇中的5％w/v吐温80、盐水中的5％w/v吐温80、盐水中的2％w/v吐温80(两次)、盐水(三次)组成。通过这种方法制造的聚合物纤维在下文中可互换地称为plga-spf或spf。
[0185]
spf一致地形状不均匀且尺寸小，平均长度在约1μm至约3mm的范围中，并且平均直径在约15nm至约5μm的范围中。spf在-80℃冷冻而不经历尺寸或再悬浮性质的显著变化。随后的分析表明合成的spf是无菌的。
[0186]
实施例2-生物材料的掺入和活性保留
[0187]
用荧光标志物加标签的大蛋白(14-100kda)、肽(1kda)和ssdna(22-mer)被成功地掺入到spf中，如使用荧光显微术所示。这些单独(图1(i))或一起(图1(ii))被掺入spf，取得了同样的成功(图1)。随后的分析显示在这种情况下掺入率为约37％。然而，如本文别处所述，生物材料向spf的装载可以根据例如spf的溶解度和待装载的生物材料(例如，大小、净电荷、分子量)而变化。通过使用辣根过氧化物酶(hrp)证明了酶向spf中的掺入和功能的保留。通过在水中孵育1、2、3和6天，在每个时间点取等分试样并储存在-80℃来测定hrp-spf。通过比色测定测量释放的hrp的活性，并显示hrp在多达6天具有酶活性(图2)。
[0188]
荧光标签在治疗产品中并不理想，因此为了消除这些研究中使用的荧光标签对掺入有影响的可能性，测试了未加标签的蛋白质的掺入，以消除掺入期间标签的影响。卵清蛋白(ova)经常在动物实验，包括使用表达ova的gl261-qaud细胞系作为肿瘤替代物的小鼠gbm肿瘤模型中用作模式抗原。由于ova的dmso溶解性差，使用70％的dmso将ova掺入plga。修改了制造方案，排除了过夜孵育，这减少了过夜孵育时出现的plga和ova的过早凝固。在spf形成后，使用免疫荧光技术使用ova抗体和荧光488二抗检测ova掺入(图3)。
[0189]
从dna去除荧光标签影响了向spf的掺入率，这被预测是由于dna在dmso中的不溶性。通过将生物素连接到dna的3’端来生物素化dna克服了这个问题。生物素被tga批准用于医疗用途。生物素-dna复合物被成功掺入plga，并通过使用抗生物素抗体hrp测定检测spf中的生物素进行测量(图4)。
[0190]
实施例3-生物材料的掺入和释放速率
[0191]
通过将已知量的蛋白质加入到spf的制造中并在已知量的dmso中再溶解来测量掺入率。使用分光光度计在od280通过蛋白质估算来确定释放的蛋白质。该方法显示，在plga-spf制造期间，40％-50％的生物剂被成功掺入和释放。
[0192]
采用elisa测定和生物测定相结合的释放研究表明，掺入的组分的生物活性在从spf释放时得以保留。将重组人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)(在免疫应答和树突状细胞分化的调节中发挥作用的细胞因子，并且也是免疫疗法药物混合物的一种成分)掺入plga-spf中，洗涤并研究释放动力学。将装载有gm-csf的spf在盐水中孵育0、1、2、3、7、14、21和28天，并用elisa测定测量gm-csf释放。结果显示，掺入的gm-csf在28天内持续释放，最大释放发生在前3天(7ng/ml)，随后是浓度递减的持续缓慢释放；第7天为4ng/ml，第14天为2ng/ml，第21天为1.8ng/ml，并且第28天为0.4ng/ml(图5)。
[0193]
在16天的释放期内，用在plga中的ova进行了类似的测定，并在2小时后与gmcsf释放一起进行比较(图6)。
[0194]
实施例4-在体外对细胞的毒性和其他影响
[0195]
通过向培养细胞中添加可溶性plga、spf和0.5％dmso来确定这些成分的毒性。在培养中暴露于plga和spf 3天后，aml-193和th-1(白血病细胞系)没有显示出生长抑制或细胞死亡(图7)。细胞形态不受培养物中存在spf的影响，并且spf不引起细胞排斥/聚集，表明在这些培养条件下spf对细胞是惰性的(图8)。
[0196]
实施例5-细胞培养物中生物活性的保持：
[0197]
通过使用对gm-csf敏感的白血病细胞系aml-193和tf-1在体外测试了装载有gm-csf的spf的生物活性。这些细胞在缺乏gm-csf的情况下无法生长。细胞在处理前被gm-csf饥饿24小时。将装载了gmcsf的spf和普通(空)spf与细胞一起孵育4天。还测试了溶于dmso中的spf释放gm-csf。aml-193和tf-1二者在存在完整和溶解的装载gm-csf的spf的情况下生长，但在存在空的或溶解的spf的情况下未能生长(图9和图10)。
[0198]
实施例6-生物活性的spf保护
[0199]
为了确定spf可以向细胞活跃递送功能性gm-csf多长时间，进行了时间过程实验。将aml-193细胞在相同条件下孵育4、7、14和21天(图11)。在培养开始时添加的gm-csf在第14天后失去生物活性，而在存在装载gm-csf的spf的情况下孵育的细胞继续生长21天，类似于在与每3天添加的新鲜gm-csf(5ng/ml)一起孵育的细胞或与1000mg/ml剂量的gm-csf一起孵育的细胞观察到的生长速率。当装载gm-csf的spf溶解在dmso中时，从spf释放的gm-csf只能维持生长持续7天，与gm-csf的预期半衰期一致。这些数据表明，当将gm-csf掺入到spf中时，其生物活性受到保护，并且gm-csf在从spf释放之前保持生物活性。aml-193细胞的剂量要求表明，gm-csf以》0.5ng/ml的最低浓度释放(细胞的敏感性范围)(图12)。
[0200]
为了进一步验证spf对生物活性剂的保护作用，将装载gm-csf的spf在培养基中孵育，并在28天内以规律的间隔收集样品。在第3、7、14、21和28天收集并更换培养基，确保每个时间点内只有新释放的gm-csf，并且然后添加到thp-1gm-csf敏感细胞中并分析细胞生长(图13a)。细胞在从所有时间点收集的培养基中生长，表明如通过tf-1细胞的gm-csf剂量响应确定的，在0.1ng/ml或以上，培养基保持生物活性(图13b)。
[0201]
实施例7-维持免疫治疗的复杂生物功能
[0202]
免疫疗法通常要求许多步骤来对免疫系统进行编程。在说明性的实例中，其中一个步骤包括添加gmcsf，其作用是使单核细胞分化以产生树突状细胞(dc)。这些步骤中的另一个步骤包括添加cpg(一种旨在模拟细菌的dna序列)，以提醒免疫细胞进行攻击。第三步骤包括对dc进行编程，使其向t细胞发出信号，然后t细胞杀死肿瘤细胞。
[0203]
使用人类原代单核细胞测试了前两个步骤中spf介导的免疫疗法的应用。使用thp-1单核细胞系和人类原代单核细胞测试了gm-csf(一种驱动单核细胞分化为树突状细胞dc的细胞因子)和cpg-odn(一种tlr激动剂)在spf介导的免疫疗法中的应用。制造带有或不带有cpg-odn的gm-csf装载的spf，并在细胞培养基中孵育2天。然后收集培养基并用于评估单核细胞分化(通过细胞形态学确定)，将结果与单独的gm-csf、单独的cpg-odn和普通(空)spf进行比较。培养物中的单核细胞通常呈圆形，而dc通常呈细长形。来自装载gm-csf的spf的培养基显示出使thp-1细胞向dc谱系分化，类似于当细胞在存在单独的gm-csf的情况下培养时观察到的效果。相比之下，空的spf未能诱导细胞分化(图14)。类似地，当与空的spf相比时，在存在装载gm-csf-cpg-odn的spf和装载gm-csf的spf的情况下，人类单核细胞显示出向dc谱系分化(图15)。
[0204]
dc生物标志物cd14和cd40用于监测人类单核细胞向dc谱系的分化。分化后，从细胞中收集rna，并通过定量聚合酶链式反应(qpcr)分析这些生物标志物的表达(图16)。单核细胞在分化为dc后，显示降低的cd14表达，而cd40表达增加。与观察到的形态学变化一致，cd14和cd40的基因表达变化也表明当细胞在存在装载gm-csf的spf和装载gm-csf-cpg-odn
的spf的情况下培养时，单核细胞向dc谱系分化。
[0205]
实施例8-在体内维持免疫治疗的复杂生物功能
[0206]
spf已被验证为递送生物材料的概念证明。这包括掺入、保护生物活性和释放。spf已作为免疫疗法生物剂的载体进行试验，并显示免疫系统激活所需的两个步骤已成功实施。重要的是，spf保护并缓慢释放疫苗成分，以允许长时间暴露于免疫系统。我们还表明，装载了gmcsf的spf可以使人类单核细胞分化，产生形态确定的树突状细胞，证实了培养物中的活性。
[0207]
小鼠体内实验研究了耐受性和针对模式抗原(ova)的细胞毒性t淋巴细胞的产生。deakin university动物伦理学批准了这项研究。
[0208]
小鼠治疗组：
[0209]
第1组
–
官能化spf(小鼠gm-csf,cpg odn 2395，ova)
[0210]
第2组-普通spf(阴性对照)
[0211]
第3组-盐水(阴性对照)
[0212]
第4组-单独药物(阳性对照)
[0213]
将官能化spf疫苗皮下注射入c57bl/6j免疫活性小鼠的颈背。注射后第21天，人道地杀死小鼠，并收集动物的血液和脾脏用于分析。
[0214]
使用裂解缓冲液裂解红细胞以产生白细胞群体。将剩余细胞的一半首先用荧光标记的抗小鼠h-2kb染色，所述抗小鼠h-2kb与siinfekl抗体结合，siinfekl抗体是一种特异性检测由卵清蛋白抗原激活的t细胞的抗体。然后用荧光标记的cd8+抗体染色剂对细胞进行染色，以检测所有细胞毒性t细胞。cd8+t细胞通过裂解被感染的靶，保护免受细胞内细菌和寄生虫的感染。大多数细胞毒性t细胞表达能够识别特定抗原的t细胞受体(tcr)。进行流式细胞术分析以计算对照组和治疗组中能够识别ova(ova内的抗原序列siinfekl)的t细胞的百分比(图17)。数据显示，施用官能化spf疫苗(小鼠gm-csf，cpg odn 2395，ova)的小鼠具有更高水平的具有siinfekl表面识别标志物的cd8+t细胞(图18)。
[0215]
干扰素γ(ifnγ)是细胞介导免疫的关键调节剂，对免疫细胞和靶组织具有多种、主要是促炎性作用。最近的研究表明，它可能增强cd8+t细胞的抗肿瘤和抗病毒作用。cd8+t细胞产生ifnγ的能力增强了它们迁移到抗原呈递细胞位点的能力。其通过上调靶细胞上mhc-i的表达，显著增加t细胞介导的杀伤，并可能直接促进靶细胞的分化和死亡。因此，当暴露于识别抗原时产生infγ的抗原特异性cd8+t细胞被预测具有更好的肿瘤杀伤能力。
[0216]
另一半收集的白细胞用于检测当它们再次暴露于ova抗原时产生ifn-γ的t细胞。将细胞与ova 257-264肽(siinfekl)共孵育，以用于检测强的cd8+细胞毒性t细胞应答。加入蛋白质转运抑制剂(golgistop)，然后用cd8+抗体染色剂对细胞进行荧光标记以检测所有细胞毒性t细胞。然后将细胞与使细胞膜可渗透的试剂(cytomix/cytoperm)一起孵育。然后用荧光标记的ifn-γ染色剂对它们进行染色，用于流式细胞术分析(图19)。数据显示，通过spf递送施用疫苗的小鼠具有更高水平的ova识别细胞毒性t细胞，能够检测和破坏表达ova抗原的细胞(图20)。
[0217]
siinfekl在体内诱导cd8+t细胞应答的能力也使用ifnγelispot测定确定。实验结束时，从小鼠脾脏收集脾细胞。分离脾细胞，切开脾脏，并过滤通过70μm筛。用10ml冷rpmi洗涤细胞，并使用1xrbc裂解缓冲液裂解红细胞5分钟。用冷pbs停止反应，将细胞以300g/5
分钟离心，并用10ml冷pbs洗涤。进行细胞计数，并将5x105个脾细胞铺板到每个含有或不含siinfekl的elsispot孔中。pma(10ng/ml)和肌霉素(1mm)(ifnγ激活剂)也被用作阳性对照。将细胞孵育过夜，并通过elispot测定按照制造商的说明确定干扰素-γ的产生。注射含有ova的spf的小鼠产生了针对siinfekl可测量的分泌ifn-γ的细胞，而只有spf的小鼠没有产生分泌ifn-γ的细胞(图21)。
[0218]
结论
[0219]
本发明人首次验证了spf作为快速和持续递送生物活性剂的递送媒介物，并且spf能够随着时间保护生物活性剂，从而在从spf中释放时保持生物活性。重要的是，spf作为理想递送媒介物的这些特性和动力学可以在体内环境中复制。