包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于治疗代谢性疾病的药物组合物

1.本发明涉及包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于治疗代谢性疾病的药物组合物。


背景技术：

2.由于经济的急速发展带来西式饮食与营养过剩，最近韩国国内的疾病发病状态发生了很大变化，与过去不同，动脉硬化、高血压、癌症、肥胖及糖尿病等之类的慢性退行性疾病开始成为主要的死亡原因。尤其是糖尿病及由其引起的并发症的发病率急剧增加，具体地，上世纪七十年代不足人口1％的糖尿病患者到了上世纪九十年代以后每10万人中就有17.2人因糖尿病死亡。
3.糖尿病为血液中葡萄糖浓度增加的代谢性疾病中的一种，是因胰岛素的分泌量不足或者无法发挥正常功能而导致的疾病。糖尿病大体分为1型和2型，1型糖尿病是因自身免疫机制、病毒、感染等原因而破坏胰腺的b细胞使胰岛素的分泌绝对不足而引起的。另一方面，2型糖尿病则因不分泌胰岛素或者分泌的胰岛素在体内不能正常发挥功能而无法调节血糖，从而出现血糖上升的情况。
4.并且，糖尿病引起视网膜、肾脏及神经等毛细血管并发症以及中风、心绞痛、心肌梗塞及末梢血管疾病之类的大血管并发症。近来，随着糖尿病治疗方法的发展，糖尿病患者的平均寿命得到延长，由急性代谢性并发症引起的死亡率急剧下降，但糖尿病并发症的发生却在增加，对此的治疗问题呈上升的趋势。
5.糖尿病利用药物疗法、运动疗法及饮食疗法进行治疗，根据患者的症状使用胰岛素制剂和各种血糖剂。然而，糖尿病是表现出肝脏内糖的过度生成、胰岛素抗药性、在肌肉和脂肪细胞等中的糖处理能力减少等特征的综合疾病，只依靠特定治疗方法无法阻止诱发多种副作用。尤其，药物疗法使用胰岛素及化学物质，会诱发药物服用的副作用及患者的抗药性。
6.另一方面，外泌体(exosome)为从多种细胞分泌的膜结构的小囊泡，具有约50nm至200nm的直径。根据最近的研究结果，外泌体不是直接从细胞质膜(plasma membrane)脱落的，而是起源于称作多囊体(multivesicular bodies，mvb)的细胞内特定区域并向细胞外放出的。
7.外泌体不仅是在肥大细胞、淋巴细胞、星形细胞、血小板、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞之类的细胞，而且是在几乎所有的真核生物及细菌的代谢活动过程中生成的物质，在包括血液、小便、唾液、母乳、羊水、腹水、脑脊髓液等的所有液体中被分离出来。不仅如此，由于外泌体反映细胞的状态或者细胞膜，包含多种蛋白质、脂质、核酸等，因此，近来作为在诊断上有用的生物学试样而备受瞩目。这是因为外泌体反映起源细胞(供给细胞)特有的生物学功能并含有各种细胞特异性结构成分，从各种细胞分离的外泌体的大小或者蛋白质及核酸的构成互不相同。
8.与此相关地，韩国公开专利第10-2019-0011213号公开了如下内容：从源自脂肪组织的干细胞提取的外泌体表现出促进骨再生及增进骨密度的效果，能够有效用于治疗骨质疏松症。


技术实现要素：

9.技术课题
10.本发明的目的在于，提供源自牛奶的外泌体治疗代谢性疾病的用途。
11.本发明的再一目的在于，提供源自牛奶的外泌体促进胰岛素分泌的用途。
12.本发明的还有一目的在于，提供从牛奶中提取外泌体的方法。
13.解决问题的方案
14.为了实现上述目的，本发明提供包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药物组合物。
15.并且，本发明提供包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于预防或改善代谢性疾病的保健功能食品。
16.并且，本发明提供包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于促进胰岛素分泌的组合物。
17.并且，本发明提供从牛奶中提取外泌体的方法，包括：使用醋酸处理牛奶来获得第一上清液的步骤；使用选自由乙二胺四乙酸(edta，ethylenediaminetetraacetic acid)及盐酸(hcl，hydrogen chloride)组成的组中的一种以上的试剂处理获得的第一上清液来获得第二上清液的步骤；以及从获得的第二上清液中提取外泌体的步骤。
18.并且，本发明提供预防、改善或者治疗代谢性疾病的方法，包括向个体给药源自牛奶的外泌体的步骤。
19.进而，本发明提供源自牛奶的外泌体，用来制备用于预防、改善或者治疗代谢性疾病的药剂的用途。
20.发明的效果
21.本发明的源自牛奶的外泌体包含公知的具有抗糖尿病活性的mi-155及mi-375，在促进有关作为促进胰岛素信号传导因子的胰岛素受体底物-1(irs-1)及葡萄糖转运蛋白4(glut-4)的信使核糖核酸(mrna)的表达的同时，抑制有关作为抑制胰岛素信号传导因子的ccaat增强子结合蛋白β(c/ebpβ)及丙酮酸脱氢酶激酶4(pdk4)蛋白的信使rna的表达，可以有效地用于治疗代谢性疾病。
附图说明
22.图1为通过肉眼确认使用1％(v/v)、2％(v/v)、5％(v/v)、10％(v/v)的醋酸与乙二胺四乙酸或者磷酸盐缓冲溶液(pbs)一起处理牛奶后提取的外泌体的结果的图。
23.图2为示出使用透射电子显微镜(tem)拍摄从牛奶中提取的外泌体的结果(a部分)的图以及示出在提取的外泌体中确认作为外泌体标记蛋白的tsg101蛋白的表达的结果(b部分)的图。
24.图3为在测量从牛奶中提取的外泌体的大小后，示出其大小分布结果的柱状图。
25.图4为示出用于确认从牛奶中提取的外泌体中是否存在mi-155及mi-375的微小核
糖核酸(mirna)的ct值(a部分)、标准熔融曲线(b部分)及差异熔融曲线(c部分)的图标。
26.图5为使用胰岛素处理胰腺癌细胞株后确认是否诱发akt蛋白质的磷酸化的结果的图。
27.图6为使用从牛奶中提取的外泌体处理胰腺癌细胞株后确认有关作为促进胰岛素信号传导因子的胰岛素受体底物-1及葡萄糖转运蛋白4蛋白的信使rna的表达变化的结果的柱状图。
28.图7为使用从牛奶中提取的外泌体处理胰腺癌细胞株后确认有关作为抑制胰岛素信号传导因子的ccaat增强子结合蛋白β及丙酮酸脱氢酶激酶4蛋白的信使rna的表达变化的结果的柱状图。
具体实施方式
29.以下，详细说明本发明。
30.本发明提供包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药物组合物。
31.本说明书中所使用的术语“外泌体(exosome)”是指从多种细胞中分泌的膜结构的小囊泡。上述外泌体发挥与其他细胞或者组织结合来传递膜结构要素、蛋白质、rna等的多种功能，通常具有约50nm至200nm的平均直径。具体地，本发明的外泌体可以具有50nm至250nm、50nm至220nm、50nm至200nm、50nm至180nm、80nm至250nm、80nm至220nm、80nm至200nm、80nm至180nm、100nm至250nm、100nm至220nm、100nm至200nm或者100nm至180nm的平均直径。
32.上述外泌体可以表达外泌体标记蛋白，具体地，上述外泌体标记蛋白可以为tsg101蛋白。上述tsg101蛋白可以包括在通常的技术领域中已知为tsg101蛋白的所有序列，可以与公知的序列具有80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或者99％以上的同源性。作为一例，上述tsg101蛋白可以为由记载为序列7的氨基酸序列构成的多肽。
33.上述外泌体可以包含公知为具有抗糖尿病活性的微小rna(microrna)。具体地，上述微小rna可以为选自由mi-155及mi-375组成的组中的一种以上，更具体地，可以为mi-155及mi-375。上述mi-155可以为由记载为序列8的碱基序列构成的多核苷酸，mi-375可以为由记载为序列9的碱基序列构成的多核苷酸。
34.上述外泌体可以在增加促进胰岛素信号传导机制的因子表达的同时，对抑制胰岛素信号传导机制的因子的表达进行抑制。因此，本发明的外泌体可以用于预防或者治疗代谢性疾病。具体地，上述代谢性疾病可以为肥胖、糖尿病或者糖尿病并发症，上述糖尿病并发症可以为糖尿病视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病足部溃疡或者糖尿病血管并发症。
35.本发明的外泌体可以通过包括如下步骤的方法获得：步骤1)，使用醋酸处理牛奶来获得第一上清液；步骤2)，使用选自由乙二胺四乙酸及盐酸组成的组中的一种以上的溶液处理获得的第一上清液来获得第二上清液；以及步骤3)，从获得的第二上清液中提取外泌体。
36.在上述方法中，能够以1∶5至1∶150、1∶5至1∶120、1∶5至1∶110、1∶5至1∶80、1∶5至1∶60、1∶5至1∶30、1∶5至1∶15、1∶8至1∶150、1∶8至1∶120、1∶8至1∶110、1∶8至1∶80、1∶8至1∶60、1
∶8至1∶30或者1∶8至1∶15的体积比添加牛奶及醋酸。
37.相比于组合物的总重量，本发明的药物组合物可以包含10重量百分比至95重量百分比的作为有效成分的源自牛奶的外泌体。并且，除上述有效成分外，本发明的药物组合物还可以包含表现出相同或者相似功能的一种以上的有效成分。
38.本发明的药物组合物可以包含生物学制剂通常使用的载体、稀释剂、赋形剂或者它们的混合物。药学上可接收的载体只要是适于将组合物传递到活体内的就都可以使用。具体地，上述载体可以为记载于merck index,13th ed.,merck&co.inc.的化合物、生理盐水、灭菌水、林格氏液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或者它们的混合物。并且，可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、静菌剂等之类的通常的添加剂。
39.在配制上述组合物的情况下，可以添加通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或者赋形剂。
40.本发明的组合物可以配制为口服制剂或者胃肠外制剂。口服用制剂可以包括固体制剂及液体制剂。上述固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或者锭剂，这些固体制剂可以通过向上述组合物添加一种以上的赋形剂来制备。上述赋形剂可以为淀粉、碳酸钙、葡萄糖、乳糖、明胶或者它们的混合物。并且，上述固体制剂可以包含润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。另一方面，上述液体制剂可以为悬浮剂、内溶液剂、油剂或者糖浆剂。在此情况下，上述液体制剂可以包含湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等之类的赋形剂。
41.上述胃肠外制剂可以包括注射剂、栓剂、呼吸机吸入用粉末、喷雾用气雾剂、粉末及霜剂等。上述注射剂可以包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮溶剂、油剂等。在此情况下，非水性溶剂或者悬浮溶剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油或者油酸乙酯之累的能够注射的酯类。
42.并且，本发明提供包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于预防或改善代谢性疾病的保健功能食品。
43.上述保健功能食品所包含的作为有效成分的源自牛奶的外泌体可以具有如上所述的特征。作为一例，上述外泌体可以具有50nm至250nm、50nm至220nm、50nm至200nm、50nm至180nm、80nm至250nm、80nm至220nm、80nm至200nm、80nm至180nm、100nm至250nm、100nm至220nm、100nm至200nm或者100nm至180nm的平均直径。并且，上述外泌体可以表达外泌体标记蛋白，具体地，上述外泌体标记蛋白可以为tsg101蛋白。
44.上述外泌体可以包含公知为具有抗糖尿病活性的微小rna。具体地，上述微小rna可以为选自由mi-155及mi-375组成的组中的一种以上，更具体地，可以为mi-155及mi-375。
45.上述代谢性疾病可以为肥胖、糖尿病或者糖尿病并发症，上述糖尿病并发症可以为糖尿病视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病足部溃疡或者糖尿病血管并发症。
46.并且，本发明提供包含源自牛奶的外泌体作为有效成分的用于促进胰岛素分泌的组合物。
47.上述用于促进胰岛素分泌的组合物所包含的作为有效成分的源自牛奶的外泌体可以具有如上所述的特征。作为一例，上述外泌体可以具有50nm至250nm、50nm至220nm、50nm至200nm、50nm至180nm、80nm至250nm、80nm至220nm、80nm至200nm、80nm至180nm、100nm至250nm、100nm至220nm、100nm至200nm或者100nm至180nm的平均直径。并且，上述外泌体可
以表达外泌体标记蛋白，具体地，上述外泌体标记蛋白可以为tsg101蛋白。
48.上述外泌体可以包含公知为具有抗糖尿病活性的微小rna。具体地，上述微小rna可以为选自由mi-155及mi-375组成的组中的一种以上，更具体地，可以为mi-155及mi-375。因此，上述外泌体可以在增加促进胰岛素信号传导机制的因子表达的同时，对抑制胰岛素信号传导机制的因子的表达进行抑制。
49.进而，本发明提供从牛奶中提取外泌体的方法，包括：使用醋酸处理牛奶来获得第一上清液的步骤；使用选自由乙二胺四乙酸及盐酸组成的组中的一种以上的试剂处理获得的第一上清液来获得第二上清液的步骤；以及从获得的第二上清液中提取外泌体的步骤。
50.本发明从牛奶中提取外泌体的方法提供使用醋酸处理牛奶来获得第一上清液的步骤。
51.在上述步骤中，可以为了去除牛奶中包含的蛋白质和脂肪而添加醋酸，在此情况下，能够以0.5％(v/v)至15％(v/v)、0.5％(v/v)至12％(v/v)、0.5％(v/v)至8％(v/v)、0.5％(v/v)至6％(v/v)、0.5％(v/v)至3％(v/v)、0.5％(v/v)至1.5％(v/v)、0.8％(v/v)至15％(v/v)、0.8％(v/v)至12％(v/v)、0.8％(v/v)至8％(v/v)、0.8％(v/v)至6％(v/v)、0.8％(v/v)至3％(v/v)、0.8％(v/v)至1.5％(v/v)的体积比包含醋酸。可以通过离心分离经醋酸处理的牛奶来获得上清液。上述离心分离可以根据本发明所属技术领域通常已知的条件进行，本发明所属技术领域的普通技术人员可以根据需要适当地进行变形。
52.上述步骤还可以包括过滤获得的第一上清液来获得过滤物的步骤。上述过滤可以根据本发明所属技术领域通常已知的方法进行，具体地，可以使用具有0.3μm至0.7μm大小孔隙(pore)的过滤器进行。
53.本发明的从牛奶中提取外泌体的方法提供使用选自由乙二胺四乙酸及盐酸组成的组中的一种以上的试剂处理获得的第一上清液来获得第二上清液的步骤。
54.上述步骤可以为了在已通过醋酸的处理去除蛋白质和脂肪的牛奶中去除酪蛋白之类的残留物而进行。在此情况下，乙二胺四乙酸或者或者盐酸能够以与上述醋酸等量的方式添加。可以通过再次离心分离添加有乙二胺四乙酸或者盐酸的第一上清液来获得第二上清液。上述离心分离可以根据本发明所属技术领域通常已知的条件进行，本发明所属技术领域的普通技术人员可以根据需要适当地进行变形。
55.上述步骤还可以包括过滤获得的第一上清液来获得过滤物的步骤。上述过滤可以根据本发明所属技术领域通常已知的方法进行，具体地，可以使用具有0.1μm至0.5μm大小孔隙的过滤器进行。
56.在上述方法中，能够以1∶5至1∶150、1∶5至1∶120、1∶5至1∶110、1∶5至1∶80、1∶5至1∶60、1∶5至1∶30、1∶5至1∶15、1∶8至1∶150、1∶8至1∶120、1∶8至1∶110、1∶8至1∶80、1∶8至1∶60、1∶8至1∶30或者1∶8至1∶15的体积比添加牛奶及醋酸。
57.本发明的从牛奶中提取外泌体的方法提供从获得的第二上清液中提取外泌体的步骤。
58.在上述步骤中，外泌体的提取能够以通过离心分离获得颗粒(pellet)的方式进行。上述离心分离可以根据本发明所属技术领域通常已知的条件进行，本发明所属技术领域的普通技术人员可以根据需要适当地进行变形。
59.并且，本发明提供预防、改善或者治疗代谢性疾病的方法，包括向个体给药源自牛
奶的外泌体的步骤。
60.为了预防、改善或者治疗上述代谢性疾病而向个体给药的源自牛奶的外泌体可以具有如上所述的特征。作为一例，上述外泌体可以具有50nm至250nm、50nm至220nm、50nm至200nm、50nm至180nm、80nm至250nm、80nm至220nm、80nm至200nm、80nm至180nm、100nm至250nm、100nm至220nm、100nm至200nm或者100nm至180nm的平均直径。并且，上述外泌体可以表达外泌体标记蛋白，具体地，上述外泌体标记蛋白可以为tsg101蛋白。
61.上述外泌体可以包含公知为具有抗糖尿病活性的微小rna。具体地，上述微小rna可以为选自由mi-155及mi-375组成的组中的一种以上，更具体地，可以为mi-155及mi-375。
62.上述代谢性疾病可以为肥胖、糖尿病或者糖尿病并发症，上述糖尿病并发症可以为糖尿病视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病足部溃疡或者糖尿病血管并发症。
63.上述个体可以为哺乳动物，具体地，可以为人类。
64.上述给药可以根据所目的的方法口服或者胃肠外给药。胃肠外给药可以包括腹腔内、直肠内、皮下、静脉、肌肉内或者胸部内注射方式。并且，上述给药能够以药学上的有效的量给药。上述药学上有效的量可以根据疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、患者对药物的敏感度、给药时间、给药途径、治疗期间、同时使用的药物等的不同而不同。但是，为了获得优选的效果，本发明的有效成分能够以0.0001mg/kg至1000mg/kg的量给药，具体地，能够以0.001mg/kg至500mg/kg的量给药，上述给药可以一天一次或者一天数次给药。
65.并且，上述给药能够以单独或者与其他治疗剂并用的方式进行。并用给药时，可以按照顺序或者同时给药。
66.进而，本发明提供源自牛奶的外泌体用来制备用于预防、改善或者治疗代谢性疾病的药剂的用途。
67.用来制备用于预防、改善或者治疗上述代谢性疾病的源自牛奶的外泌体可以具有如上所述的特征。作为一例，上述外泌体可以具有50nm至250nm、50nm至220nm、50nm至200nm、50nm至180nm、80nm至250nm、80nm至220nm、80nm至200nm、80nm至180nm、100nm至250nm、100nm至220nm、100nm至200nm或者100nm至180nm的平均直径。并且，上述外泌体可以表达外泌体标记蛋白，具体地，上述外泌体标记蛋白可以为tsg101蛋白。
68.上述外泌体可以包含公知为具有抗糖尿病活性的微小rna。具体地，上述微小rna可以为选自由mi-155及mi-375组成的组中的一种以上，更具体地，可以为mi-155及mi-375。
69.上述代谢性疾病可以为肥胖、糖尿病或者糖尿病并发症，上述糖尿病并发症可以为糖尿病视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病足部溃疡或者糖尿病血管并发症。
70.实施方式
71.以下，通过下述实施例详细说明本发明，但下述实施例仅用于例示本发明，而不是限制本发明。本发明的发明要求保护范围记载的技术思想及实质上具有与之相同的结构并实现相同效果的一切都应包括在本发明的技术范围内。
72.实施例1.从牛奶中提取外泌体
73.用于有效地从牛奶中提取外泌体的条件确立如下。
74.首先，在37℃的温度下将市面上销售的基于巴氏消毒处理的脱脂牛奶预处理10分
钟后，分别向40ml的牛奶添加1％(v/v)、2％(v/v)、5％(v/v)、10％(v/v)的醋酸并在常温下反应5分钟来使蛋白质和脂肪沉淀。反应结束后，以10000g的条件离心分离10分钟来获得上清液，使用具有0.45μm大小孔隙(pore)的过滤器过滤获得的上清液来获得一次过滤物。以与醋酸相同的量向获得的过滤物添加0.25m的乙二胺四乙酸或者磷酸盐缓冲溶液(pbs，phosphate buffer saline)后，放置在冰块上30分钟使酪蛋白等沉淀后只获取上清液。使用具有0.22μm大小孔隙的过滤器过滤获取的上清液来获得二次过滤物，在210000g、4℃的条件下超高速离心分离90分钟来获得颗粒。使用10mm的磷酸盐缓冲溶液洗涤获得的颗粒后，以与上述相同的条件进行离心分离来最终从牛奶中提取外泌体。通过肉眼观察提取的外泌体的结果的照片如图1所示。另一方面，将提取的外泌体在500μl的10mm磷酸盐缓冲溶液中再悬浮后，直至使用前在4℃(短期保管)或者-80℃(长期保管)的温度下保管。
75.如图1所示，与添加磷酸盐缓冲溶液的情况相比，通过乙二胺四乙酸的牛奶外泌体的提取更为优秀。另一方面，当添加10％(v/v)以下浓度的醋酸时提取效率高，尤其，在添加2％(v/v)的醋酸的情况下，牛奶外泌体的提取效率最高。
76.实施例2.确认从牛奶中提取的外泌体
77.2-1.确认外泌体的形态及大小
78.实施例1中提取的外泌体的形态是通过普通的方法进行阴性染色(negative staining)后利用透射电子显微镜进行分析的。
79.另一方面，外泌体的大小是利用qnano(izon公司，澳大利亚)确认的。具体地，使用200nm的标定粒子(calibration particle)校正仪器后，将外泌体以1/100的稀释系数(dilution factor)稀释于电解质缓冲液(electrolyte buffer)准备为试样。外泌体的大小是通过仪器内置的软件测量的。其结果，使用透射电子显微镜确认的外泌体的形态如图1的a部分所示，示出外泌体的大小分布的柱状图如图2所示。
80.如图2的a部分及图3所示，从牛奶中提取的外泌体的平均直径为109nm，提取的外泌体数量平均为4
×
10
11
particles/ml。
81.2-2.外泌体的确认
82.通过蛋白印迹法确认实施例1中提取的外泌体中是否表达作为外泌体标记蛋白的tsg101蛋白。
83.首先，向外泌体添加ripa缓冲液并充分混合后，将其在冰中搅拌30分钟来使细胞溶解。使用bca蛋白质检测试剂盒(bca protein assay kit，promega公司，美国)定量细胞溶解物种包含的蛋白质后，利用10％的丙烯酰胺凝胶(acrylamide gel)在三甘氨酸-十二烷基硫酸钠(tris-glycine-sds)缓冲液上以100v的电压电泳70分钟。通过考马斯蓝染色确认电泳的蛋白质印记，在250ma的条件下向膜上移动60分钟。使用包含5％(w/v)的脱脂牛奶(skimmilk)的磷酸盐缓冲溶液-t缓冲溶液预处理上述膜2小时后，使用洗涤缓冲溶液洗涤1小时。向洗涤的膜添加作为对tsg101蛋白的一次矿体的抗-tsg101抗体(epr7130(b))(ab125011，abcam公司)，在4℃的温度下隔夜反应。反应结束后使用洗涤缓冲液洗涤膜1小时，添加作为二次抗体的山羊抗-兔免疫球蛋白g(igg)(h+l)、辣根过氧化物酶(hrp)(赛默飞世尔公司，#65-6120)并在常温下反应2小时后，再次使用洗涤缓冲液洗涤1小时。利用洗涤的膜进行增强化学发光(ecl)(amersham公司，美国)反应来确认的结果照片如图2的b部分所示。
84.如图2的b部分所示，在从牛奶中提取的外泌体中确认到作为外泌体标记蛋白的tsg101蛋白的表达。
85.实施例3.确认外泌体中包含的微小rna
86.通过如下方法确认实施例1中提取的外泌体是否存在有抑制具有抗糖尿病活性的mi-155及mi-375的微小rna。
87.首先，使用hybrid-r
tm
微小rna提取试剂盒(geneall公司，韩国)按照生产商的说明书从外泌体中提取微小rna后，使用通常的方法对提取的微小rna进行聚腺苷酸反应(polyadenylation)。在此情况下，反应在37℃的温度下进行30分钟，以通过反应获得的聚腺苷酸化(polya)-微小rna为模板，使用topscript
tm
cdna合成试剂盒(enzynomics公司，韩国)合成互补脱氧核糖核酸(cdna)。
88.具体地，将2μl的逆转录酶缓冲液、1μl的逆转录酶、2μl的脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)混合物、100ng的模板rna、1μl的各个引物以及0.5μl的核糖核酸酶(rnase)抑制剂混合后，向其添加灭菌的去离子水(distilled deionized water，ddi water)使总体积达到20μl来制备反应物。在60℃的温度下使上述反应物反应1小时来合成互补dna后，在95℃的温度下放置5分钟使其灭活。在此情况下，引物使用了具有下述表1中记载的序列1、序列2、序列4及序列5的碱基序列的引物。
89.表1
[0090][0091]
利用合成的互补dna以通常的方法进行实时聚合酶链式反应(pcr)来确认mi-155及mi-375的表达。实时聚合酶链式反应是以95℃的温度下3分钟、95℃的温度下10秒钟以及60℃的温度下60秒为一个周期共反复50个周期来进行的，之后，设定临界点(threshold)来调节ct值后，确认实际的实时扩增量。在此情况下，引物使用具有上述表1记载的序列1、序列3、序列4及序列6的引物。通过rotor geneq软件计算扩增的结果，计算的结果如图4所示。
[0092]
如图4的a部分所示，mi-155及mi-375的各个ct值分别为26.5
±
0.1及29.5
±
0.2，如图4的b部分及图4的c部分所示，从计算的结果中确认到熔融曲线(melt curve)。通过上述结果可知从牛奶中提取的外泌体中存在有丰富的mi-155及mi-375。
[0093]
实验例1.确认akt蛋白质通过胰岛素的磷酸化
[0094]
通过蛋白印迹法确认当使用胰岛素处理胰腺细胞时，是否通过阳性胰岛素信号传导使akt(蛋白激酶b(protein kinase b))蛋白质磷酸化。
[0095]
首先，将1
×
106个的胰腺癌细胞株(pancreatic cancer cell，atcc公司)分株与100mm的细胞培养皿中，在37℃、5％co2的条件下进行培养。培养36小时后，洗涤细胞后添加不包含血清的培养基使细胞饥饿24小时。之后，洗涤细胞后添加胰岛素使其浓度达到200nm并反应30分钟。在此情况下，将不使细胞饥饿的细胞(c)和未使用胰岛素处理的细胞(0)用作对照组。利用反应结束的细胞以通常的方法进行蛋白印迹法。除使用3％(w/v)的牛血清白蛋白替换5％(w/v)的脱脂牛奶进行预处理以及将抗-pakt抗体(细胞信号传导(cell signaling))用作一次抗体以外，以与实施例2-2相同的条件及方法进行蛋白印迹法。
[0096]
其结果如图5所示，可知通过使用200nm浓度的胰岛素处理30分钟诱导akt蛋白质磷酸化，增加了糖原合成(glycogenesis)。
[0097]
实验例2.确认通过外泌体的信使rna表达的变化
[0098]
通过如下方法确认通过从牛奶中提取的外泌体是否诱导阳性胰岛素信号传导反应。
[0099]
首先，以与实验例1的记载相同条件及方法准备胰腺癌细胞株。使用10
11
particles的外泌体处理饥饿了24小时的细胞并反应24小时。在此情况下，将200nm的胰岛素处理组用作阳性对照组。反应结束后，使用信使rna提取试剂盒(geneall biotechnology公司，韩国)按照生产商的说明书提取胰腺癌细胞株的信使rna。
[0100]
以提取的信使rna为模板，使用topscript
tm
cdna合成试剂盒(enzynomics公司，韩国)合成互补脱氧核糖核酸。具体地，将2μl的逆转录没缓冲液、1μl的逆转录酶、2μl的核苷三磷酸混合物、100ng的模板rna、1μl的多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸(oligo dt)以及0.5μl的核糖核酸酶抑制剂混合后，向其添加灭菌的去离子水使总体积达到20μl来制备反应物。使上述反应物在42℃的温度下反应5分钟及60℃的温度下反应1小时来合成互补dna后，在95℃的温度下放置5分钟使其灭活。
[0101]
利用合成的互补dna以通常的方法进行实施聚合酶链式反应来确认作为与胰岛素信号传导相关的因子的胰岛素受体底物-1(irs-1，insulin receptor substrate 1)、葡萄糖转运蛋白4(glut-4，glucose transporter type 4)、ccaat增强子结合蛋白β(c/ebpβ，ccaat/enhancer-binding proteinβ)及丙酮酸脱氢酶激酶4(pdk4，pyruvate dehydrogenase kinase 4)蛋白质的信使rna的表达。实时聚合酶链式反应是以95℃的温度下3分钟、95℃的温度下10秒钟、55℃的温度下60秒钟以及在72℃的温度下20秒为一个周期共反复50个周期来进行的，之后，设定临界点来调节ct值后，确认实际的实时扩增量。在此情况下，引物使用在本发明所属技术领域中普遍使用的引物。通过rotor geneq软件计算扩增的结果，计算的结果如图6及图7所示。
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如图6所示，即使与阳性对照组相比，有关作为促进胰岛素信号传导的因子的胰岛素受体底物-1及葡萄糖转运蛋白4的信使rna的表达也显著增加。另一方面，如图7所示，有关作为抑制胰岛素信号传导的因子的ccaat增强子结合蛋白β及丙酮酸脱氢酶激酶4的信使rna的表达被抑制了。
[0103]
因此，通过上述说明可知，本发明的外泌体增加胰岛素的信号传导，从而可以用于治疗糖尿病。