用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物的制作方法

1.本发明涉及用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物，该组合物包含作为活性成分能够与存在于调节性t细胞(treg细胞)表面上的富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1，leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1)的蛋白特异性结合的结合分子。


背景技术：

2.不同于攻击癌症本身的常规抗癌药物，免疫疗法是通过向体内注射人工免疫蛋白来刺激免疫系统，从而诱导免疫细胞选择性地仅攻击癌细胞的治疗剂。这种免疫疗法包括免疫检查点抑制剂、免疫细胞疗法和免疫病毒疗法。
3.与常规药物相比，基于抗体的癌症疗法诸如免疫疗法具有潜在的高特异性和高副作用。这是因为抗体可以精确区分正常细胞和肿瘤细胞，它们的作用方式依赖于低毒免疫抗肿瘤机制，诸如进入细胞毒性免疫细胞和互补激活。
4.基于抗体的疗法的靶标必须具有特定特征，这些特征成为正确区分正常细胞和肿瘤细胞的基础。在开发有效和安全的抗体疗法时，不用说，仅局限于肿瘤细胞或在正常组织中未检测到的靶标将是理想的。另一方面，高度过表达可以作为治疗窗的基础，而人类表皮生长因子受体2型(her-2)由于基因扩增所显示出来的低副作用是抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)的极好靶标。
5.已经被批准用于肿瘤治疗或正在临床开发的抗体的其他靶标具有独特特征，即不基于肿瘤细胞上靶分子的数值过表达。就抗蛋白多糖muc-1的抗体而言，存在于靶标的骨架中的肽重复表位在肿瘤细胞中被异常糖基化，并被改变为其正常对应物。就抗cd20的抗体(利妥昔单抗)、抗cd52的抗体(kampat-1h)和抗cd22的抗体(依帕珠单抗)而言，抗体靶标在肿瘤细胞和正常淋巴细胞上显示出相当的表达水平。就这一点而言，由于靶标阴性干细胞恢复了正常淋巴细胞库，因此可耐受抗体对正常细胞的去除。抗体靶标不同可及性的另一个示例是癌胚抗原(cea)和碳酸酐酶ix(ca9)。这两种抗原分别在结肠和肾脏的正常上皮中表达。然而，由于放射性标记的抗体能够很好地区分肿瘤组织和正常组织，因此细胞毒性抗体是良好耐受的。这可能是因为ca9和cea的表达仅局限于正常上皮组织的内腔侧，而igg抗体无法接触到该内腔侧。抗原上皮细胞粘附分子(ep-cam)也属于这一类。作为上皮细胞的同源细胞粘附分子，它位于细胞间隙中。有趣的是，具有高亲和力的抗ep cam抗体是高毒性的，而具有中等亲和力的抗体是良好耐受的。这表明，不仅ep-cam靶标对正常细胞的可及性，而且抗体结合的动力学均可能打开新的治疗窗。
6.尽管已有八种抗体被批准用于治疗肿瘤组织相关疾病，但是它们中的大多数是针对淋巴瘤和白血病。只有三种单克隆抗体(赫赛汀(herceptin)、安维汀(avastin)和爱必妥(erbitux))对占癌症死亡率90％或更高的实体瘤有效。已经提供了具有大量现有医疗需求和显著临床优势的mab，并且其显著的商业成功也推动了一种新颖的创新方法的开发，该方法在针对多组患者的基于抗体的疗法及其疗效增强之间具有良好的平衡。
7.然而，就肺癌而言，pd-1/pd-l1抑制剂的总缓解率(orr)低于15％至20％。这些现象充分解释了使用这些pd-1/pd-l1抑制剂的治疗效果的局限性，被认为是在肿瘤微环境中产生的免疫抑制机制。因此，为改善肿瘤微环境并提高免疫检查点抑制剂的反应速率，增加识别肿瘤抗原的t细胞数量，或采取了使用tnfrs刺激剂的策略或向肿瘤中额外注射特异性抗原疫苗的策略，但是其效果仍然不显著。


技术实现要素：

8.技术问题
9.本发明旨在提供用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物，该组合物包含作为活性成分与富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)的蛋白特异性结合的结合分子。
10.本发明还旨在提供用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物，该组合物包含作为活性成分的抗体-药物偶联物(adc)。
11.本发明还旨在提供预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，该方法包括以药物有效量向受试者施用与lrig-1蛋白特异性结合的结合分子。
12.本发明还旨在提供预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，该方法包括以药物有效量向受试者施用adc。
13.然而，本发明中要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域的普通技术人员将从以下描述中充分理解本文未描述的其他问题。
14.技术方案
15.1.用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物，包含作为活性成分与lrig-1蛋白特异性结合的结合分子
16.根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物，该组合物包含作为活性成分与富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)的蛋白特异性结合的结合分子。
17.本发明的组合物可作为药物组合物或食品组合物使用。
18.在本发明中，该结合分子可抑制treg细胞(即，属于肿瘤浸润淋巴细胞(til)的treg细胞或活化的treg细胞)的功能，从而非常有效地阻断treg细胞抑制效应t细胞功能的现象，因此可有效地预防、改善或治疗免疫逃避癌症，即对免疫检查点抑制剂具有耐药性的癌症。
19.在本发明中，其上存在lrig-1蛋白的treg细胞可以是til或活化的treg细胞。
20.本文所用的“活化的调节性t细胞(treg细胞)”是指抑制效应t细胞诱导和扩散的或其下调功能被激活的treg细胞。不同于其上无lrgi-1蛋白存在的treg细胞，当lrig-1蛋白存在于表面上时，抑制效应t细胞诱导和扩散的功能可被激活。
21.本文所用的“肿瘤浸润淋巴细胞(til)”是指淋巴细胞浸润癌症组织或从血流移动到肿瘤组织部位后的肿瘤微环境(tme)。尽管细胞毒性免疫应答可由til诱导，但是就其上具有lrig-1蛋白的treg细胞而言，抑制效应t细胞作用的功能被激活(活化的treg细胞)，因此细胞毒性免疫应答可被相当程度地抑制。
22.本文所用的“免疫检查点抑制剂耐药性”是指无应答组，该无应答组由于免疫检查
点抑制剂(例如，pd-1抑制剂(帕博利珠单抗或纳武利尤单抗)或pd-l1抑制剂(阿特珠单抗))而从一开始就对药物没有应答，或者由于药物的长期治疗，通过将免疫检查点抑制剂识别为外来物质并诱导去除该物质的免疫应答的机制而具有对药物的应答降低或消失的现象。
23.本文所用的“癌症”是指哺乳动物中以典型地不受控制的细胞生长为特征的生理状况。本发明中要预防、改善或治疗的癌症可以是由实体器官中异常细胞生长产生的肿块构成的实体瘤，根据实体器官的区域，该实体瘤可以是胃癌、肝癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移性癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤或肺癌，优选地是黑色素瘤，但本发明不限于此。
24.本文所用的“lrig-1蛋白”是跨膜蛋白，其在treg细胞表面上由1091个氨基酸组成，并且在细胞外侧或内腔侧具有富含亮氨酸的重复序列(lrr)和三个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜序列和一个胞质尾。lrig基因家族包括lrig1、lrig2和lrig3基因，并且它们之间的氨基酸是高度保守的。lrig1基因在正常皮肤中高度表达，并且可以在基底细胞和滤泡细胞中表达以调节上皮干细胞的增殖。因此，该基因在维持表皮的内环境稳态中起着重要作用，当该基因不存在时，可能会发展成牛皮癣或皮肤癌。据报道，如果lrig1基因所在的染色体3p14.3被切割，则有可能发展成癌细胞，事实上已经证实，就肾细胞癌和皮肤鳞状细胞癌而言，lrig1基因的表达高度降低。然而，最近发现表达lrig-1蛋白的癌症仅占所有癌症的20％至30％。同时，就本发明的目的而言，lrig-1蛋白可以是存在于人或小鼠中的蛋白，但本发明不限于此。
25.在本发明中，lrig-1蛋白可以是由seq id no:1表示的人源性多肽，或由seq id no:3表示的小鼠源性多肽，但本发明不限于此。
26.在本发明中，由seq id no:1表示的lrig-1蛋白可由seq id no:2表示的多核苷酸编码，但本发明不限于此。
27.在本发明中，由seq id no:3表示的lrig-1蛋白可由seq id no:4表示的多核苷酸编码，但本发明不限于此。
28.本文所用的“结合分子”是指可变结构域，例如包括单克隆抗体(诸如嵌合抗体、人源化抗体或人源性单克隆抗体)的完整免疫球蛋白，或结合抗原的免疫球蛋白(诸如与完整的免疫球蛋白竞争结合甲型流感病毒的单体ha或三聚体ha的免疫球蛋白片段)。无论结构如何，抗原结合片段都结合由完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可以是包含结合分子的氨基酸序列的两个或更多个连续组、20个或更多个连续氨基酸残基、25个或更多个连续氨基酸残基、30个或更多个连续氨基酸残基、35个或更多个连续氨基酸残基、40个或更多个连续氨基酸残基、50个或更多个连续氨基酸残基、60个或更多个连续氨基酸残基、70个或更多个连续氨基酸残基、80个或更多个连续氨基酸残基、90个或更多个连续氨基酸残基、100个或更多个连续氨基酸残基、125个或更多个连续氨基酸残基、150个或更多个连续氨基酸残基、175个或更多个连续氨基酸残基、200个或更多个连续氨基酸残基、或250个或更多个连续氨基酸残基的肽或多肽。
29.本文所用的“抗原结合片段”具体包括fab、f(ab')2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、单抗体、双抗体、三抗体、四抗体，以及包含足以结合特定抗原的免疫球蛋白的一个或多个片段的多肽作为多肽。该片段可通
过对合成的或完整的免疫球蛋白进行酶解或化学分解来制备，或通过基因工程技术(诸如重组dna技术)来制备。制备方法在本领域中是已知的。
30.在本发明中，结合分子可以是抗体或其片段。
31.在本发明中，该抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、二价抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、单抗体、双抗体、三抗体、四抗体或其片段，但本发明不限于此。
32.在本发明中，“抗体”是指作为特异性识别抗体的受体的蛋白分子，其包括对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。就本发明的目的而言，抗原可以是存在于treg细胞表面上的lrig-1蛋白。优选地，抗体可以是特异性识别lrig-1蛋白的富含亮氨酸区域或免疫球蛋白样结构域的抗体，但本发明不限于此。
33.在本发明中，抗体不仅包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，而且还包括抗体分子的功能性片段。抗体分子的功能性片段可以是至少保留抗原结合功能的片段，包括fab、f(ab')2和fv。
34.在本发明中，抗体可以是拮抗剂抗体。
35.在本发明中，“拮抗剂抗体”是指通过与细胞表面上或细胞内的特定分子结合而抑制拮抗剂抗体与配体之间的结合所引起的细胞内生物学作用或活性的抗体。例如，在本发明中，拮抗剂抗体可与存在于treg细胞表面上的lrig-1蛋白结合，从而降低或抑制lrig-1蛋白在细胞内或细胞间的一种或多种生物学作用。
36.在本发明中，“免疫球蛋白”具有重链和轻链，并且重链和轻链中的每一者具有恒定区和可变区。轻链和重链的可变区包括三个称为互补决定区(下文称为“cdr”)的高变区和四个框架区。cdr主要用于结合抗体的表位。每条链中的cdr通常从n-末端开始依次称为cdr1、cdr2和cdr3，并由特定cdr所在的链来识别。
37.此外，在本发明中，“单克隆抗体”是指具有从基本上相同的抗体群获得的单分子组成的抗体分子，并且对特定表位呈现出单一结合特异性和亲和力。
38.在本发明中，“全长抗体”具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，每条轻链通过二硫键与重链连接，并且包括iga、igd、ige、igm和igg。igg包括igg1、igg2、igg3和igg4作为亚型。
39.此外，在本发明中，“抗体的功能性片段”是指保持抗原结合功能的片段，包括fab、fab'、f(ab')2和fv。fab是包括轻链和重链中的每一者的一个可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(ch1结构域)的结构，并且具有一个抗原结合位点。此外，fab'与fab的不同之处在于fab'在重链ch1结构域的c-末端具有包含一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。f(ab')2抗体是通过形成fab'铰链区半胱氨酸残基的二硫键产生的。可变片段(fv)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链fv(dsfv)具有由二硫键连接的重链和轻链，单链fv(scfv)具有重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区通常通过共价键与肽接头连接。当使用蛋白酶(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)时，抗体片段可获得fab或f(ab')2片段，并且可通过基因重组技术制备。
40.在本发明中，“嵌合抗体”是由小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区重组而成的抗体，并且是与小鼠抗体相比极大地改善了免疫应答的抗体。
41.在本发明中，“人源化抗体”是指其中源自非人类物种的抗体的蛋白质序列被修饰
为与人体自然产生的抗体变体相似的抗体。例如，人源化抗体可通过将小鼠来源的cdr与人抗体来源的fr重组来制备人源化可变区，然后可通过将所得的人源化可变区与优选的人抗体的恒定区重组来制备人源化抗体。
42.在本发明中，“单抗体”通过制备稳定的小抗体形式的技术来制备，以在比普通抗体更长的时间内表现出治疗效果，并且该单抗体可通过去除igg4抗体的铰链区被制备为仅具有一个能够结合到靶标的区域。与全长igg4抗体相比，该单抗体具有非常优异的稳定性。该单抗体可以参考先前的专利和文献来制备。
43.在本发明中，该结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子包括：
44.重链可变区，该重链可变区包括由选自seq id no:5、13、21和29的氨基酸序列组成的重链cdr1；由选自seq id no:6、14、22和30的氨基酸序列组成的重链cdr2；和由选自seq id no:7、15、23和31的氨基酸序列组成的重链cdr3；以及
45.轻链可变区，该轻链可变区包括由选自seq id no:8、16、24和32的氨基酸序列组成的轻链cdr1；由选自seq id no:9、17、25和33的氨基酸序列组成的轻链cdr2；和由选自seq id no:10、18、26和34的氨基酸序列组成的轻链cdr3。
46.在本发明中，结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子包括：重链可变区，该重链可变区选自：
47.(a)重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:5表示的重链cdr1、由seq id no:6表示的重链cdr2和由seq id no:7表示的重链cdr3；
48.(b)重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:13表示的重链cdr1、由seq id no:14表示的重链cdr2和由seq id no:15表示的重链cdr3；
49.(c)重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:21表示的重链cdr1、由seq id no:22表示的重链cdr2和由seq id no:23表示的重链cdr3；和
50.(d)重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:29表示的重链cdr1、由seq id no:30表示的重链cdr2和由seq id no:31表示的重链cdr3；以及
51.轻链可变区，该轻链可变区选自：(e)轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:8表示的轻链cdr1、由seq id no:9表示的轻链cdr2和由seq id no:10表示的轻链cdr3；
52.(f)轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:16表示的轻链cdr1、由seq id no:17表示的轻链cdr2和由seq id no:18表示的轻链cdr3；
53.(g)轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:24表示的轻链cdr1、由seq id no:25表示的轻链cdr2和由seq id no:26表示的轻链cdr3；和
54.(h)轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:32表示的轻链cdr1、由seq id no:33表示的轻链cdr2和由seq id no:34表示的轻链cdr3。
55.在本发明中，结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子选自：
56.(1)结合分子，该结合分子包括：重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:5表示的重链cdr1、由seq id no:6表示的重链cdr2和由seq id no:7表示的重链cdr3；和轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:8表示的轻链cdr1、由seq id no:9表示的轻链cdr2和由seq id no:10表示的轻链cdr3；
57.(2)结合分子，该结合分子包括：重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:13表示的重链cdr1、由seq id no:14表示的重链cdr2和由seq id no:15表示的重链cdr3；和
轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:16表示的轻链cdr1、由seq id no:17表示的轻链cdr2和由seq id no:18表示的轻链cdr3；
58.(3)结合分子，该结合分子包括：重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:21表示的重链cdr1、由seq id no:22表示的重链cdr2和由seq id no:23表示的重链cdr3；轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:24表示的轻链cdr1、由seq id no:25表示的轻链cdr2和由seq id no:26表示的轻链cdr3；以及
59.(4)结合分子，该结合分子包括：重链可变区，该重链可变区包括由seq id no:29表示的重链cdr1、由seq id no:30表示的重链cdr2和由seq id no:31表示的重链cdr3；轻链可变区，该轻链可变区包括由seq id no:32表示的轻链cdr1、由seq id no:33表示的轻链cdr2和由seq id no:34表示的轻链cdr3。
60.在本发明中，该结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子包括：
61.重链可变区，该重链可变区由选自seq id no:11、19、27和35的任一个氨基酸序列组成；以及
62.轻链可变区，该轻链可变区由选自seq id no:12、20、28和36的任一个氨基酸序列组成。
63.在本发明中，结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子选自：
64.(1)结合分子，该结合分子包括由seq id no:11表示的重链可变区和由seq id no:12表示的轻链可变区；
65.(2)结合分子，该结合分子包括由seq id no:19表示的重链可变区和由seq id no:20表示的轻链可变区；
66.(3)结合分子，该结合分子包括由seq id no:27表示的重链可变区和由seq id no:28表示的轻链可变区；以及
67.(4)结合分子，该结合分子包括由seq id no:35表示的重链可变区和由seq id no:36表示的轻链可变区。
68.在本发明中，结合分子还可包括片段结晶(fc)区或恒定区。此处，fc区可以是iga、igd、ige、igm、igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，或可从其衍生而来，或是杂合fc区。
69.在本发明中，fc区可以是哺乳动物源性iga、igd、ige、igm、igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，以及优选地，人源性iga、igd、ige、igm、igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，但本发明不限于此。
70.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:37表示的小鼠源性igg2a恒定区，但本发明不限于此。
71.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:38表示的小鼠源性免疫球蛋白κ恒定区，但本发明不限于此。
72.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:39或40表示的人源性igg1恒定区，但本发明不限于此。
73.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:41表示的人源性免疫球蛋白κ恒定区，但本发明不限于此。
74.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:42表示的人源性igg2恒定区，但本发明不限于此。
75.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:43表示的人源性igg3恒定区，但本发明不限于此。
76.作为本发明的示例，恒定区可以是由seq id no:44表示的人源性igg4恒定区，但本发明不限于此。
77.作为本发明的示例，恒定区可以是人源性免疫球蛋白λ恒定区，但本发明不限于此。
78.在本发明中，“杂合fc”可以由人igg亚类的组合或人igd和igg的组合诱导。杂合fc不仅可以在结合生物活性分子或多肽时，提高生物活性分子的血清半衰期，而且还可以在表达编码fc多肽融合蛋白的核苷酸时，提高多肽表达水平。
79.作为本发明的示例，杂合fc区可以是由seq id no:45表示的杂合fc，但本发明不限于此。
80.在本发明的结合分子中，fc或恒定区可以通过接头与可变区连接。此处，接头与fc区的c-末端连接，并且本发明的结合分子的n-末端可以与接头连接，但本发明不限于此。
81.在本发明中，“接头”可包括能够被在目标疾病的组织或细胞中过表达的酶切割的序列。在被过表达的酶切割的情况下，可有效防止fc部分对多肽活性的降低。在本发明中，接头优选地是由位于血液中最大量存在的人白蛋白的位置282至314处的33个氨基酸组成的肽接头，更优选地是由位于血液中最大量存在的人白蛋白的位置292至304处的13个氨基酸组成的肽接头，并且该部分在人体内诱导免疫应答的可能性最小，且由于三维结构，该部分大部分暴露在外。然而，本发明不限于此。
82.本发明的结合分子还可包括由选自seq id no:37、39、40、42、43、44和45的氨基酸序列组成的重链恒定区。
83.本发明的结合分子还可包括由seq id no:38或41表示的氨基酸序列组成的轻链恒定区。
84.本发明的结合分子还可包括：
85.由seq id no:37表示的氨基酸序列组成的重链恒定区；以及
86.由seq id no:38表示的氨基酸序列组成的轻链恒定区。
87.本发明的结合分子还可包括：
88.由seq id no:39、40、42、43或44表示的氨基酸序列组成的重链恒定区；以及
89.由seq id no:41表示的氨基酸序列组成的轻链恒定区。
90.本发明的结合分子还可包括：
91.由seq id no:45表示的氨基酸序列组成的重链恒定区。
92.本发明的结合分子可以是：
93.结合分子，该结合分子包括由seq id no:46表示的重链和由seq id no:47表示的轻链；
94.结合分子，该结合分子包括由seq id no:48表示的重链和由seq id no:49表示的轻链；
95.结合分子，该结合分子包括由seq id no:50表示的重链和由seq id no:51表示的轻链；以及
96.结合分子，该结合分子包括由seq id no:52表示的重链和由seq id no:53表示的
轻链。
97.本发明的结合分子可以是：
98.结合分子，该结合分子包括由seq id no:90表示的重链和由seq id no:91表示的轻链。
99.本发明的结合分子是抗体，但本发明不限于此。该抗体是单克隆抗体、全长抗体或任何具有结合lrig-1蛋白和结合lrig-1抗原决定簇的能力的抗体片段，其中该抗原决定簇作为抗体的一部分与本发明的结合分子竞争。
100.在本发明中，结合分子可结合lrig-1蛋白，并且可作为双特异性抗体或双特异性抗原结合片段提供，该双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可结合除lrig-1蛋白之外的不同蛋白。
101.在本发明中，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可包括根据本发明的结合分子。作为本发明的示例，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可包括能够结合lrig-1蛋白的抗原结合结构域。此处，能够结合lrig-1蛋白的抗原结合结构域可包括根据本发明的结合分子或由该结合分子组成。
102.根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包括能够结合根据本发明的lrig-1蛋白的结合分子的抗原结合结构域，以及能够结合不同靶蛋白的抗原结合结构域。此处，能够结合不同靶蛋白的抗原结合结构域可以是不同于lrig-1蛋白的蛋白，例如pd-1或细胞表面受体，但本发明不限于此。
103.根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以以描述为任何合适形式的形式提供。例如，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体偶联物(例如，igg2、f(ab')2或covx体)、双特异性igg或igg型分子(例如，igg、scfv4-ig、igg-scfv、scfv-igg、dvd-ig、igg-svd、svd-igg或2in 1-igg、mab2或tandemab通用lc)、非对称双特异性igg或igg型分子(例如kih igg、kih igg通用lc、crossmab、kih igg-scfab、mab-fv、电荷对或seed-body)、小的双特异性抗体分子(例如双抗体(db)、dsdb、dart、scdb、tandabs、串联scfv(tafv)、串联dab/vhh、三体、三头、fab-scfv或f(ab')2-scfv2)、双特异性fc和ch3融合蛋白(例如，tafv-fc、二双抗体、scdb-ch3、scfv-fc-scfv、hcab-vhh、scfv-kih-fc或scfv-kih-ch3)或双特异性融合蛋白(例如，scfv2-白蛋白、scdb-白蛋白、tafv-毒素、dnl-fab3、dnl-fab4-igg、dnl-fab4-igg-细胞因子2)。本领域的普通技术人员可通过已知方法来设计和制备根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段。
104.在本发明中，制备双特异性抗体的方法可包括还原性二硫键或非还原性硫醚键，以及抗体或抗体片段的化学交联。例如，为制备二硫键双特异性f(ab)2异二聚体，n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(spdp)可用于通过例如铰链区的sh-基团化学交联fab片段。
105.此外，在本发明中，用于制备双特异性抗体的另一种方法包括将产生抗体的杂交瘤与例如聚乙二醇融合以制备能够分泌双特异性抗体的四瘤细胞的过程。
106.在本发明中，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可通过重组(例如，通过表达编码抗原结合分子的多肽的核酸构建体)来制备。例如，编码了两个抗原结合区的轻链和重链可变结构域(即，能够结合pd-1的抗原结合结构域的轻链和重链可变区，以及能够结合不同靶蛋白的抗原结合结构域的轻链和重链可变结构域)，并且可通过分子克隆技术制造包
括编码抗原结合结构域之间的适当接头或二聚化结构域的序列的dna构建体。然后，可通过在适当的宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中表达构建体来制备重组双特异性抗体，随后表达的重组双特异性抗体可任选地被纯化。
107.在本发明中，抗体可通过亲和力成熟方法制备，在该方法中，与未经修饰的亲本抗体相比，制备了对抗原具有更高亲和力的修饰抗体。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知的过程制备。
108.根据本发明的结合分子可包括氨基酸序列的变体，只要该变体特异性结合lrig-1蛋白。例如，为了改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，可改变抗体的氨基酸序列。这种改变包括，例如，在抗体的氨基酸序列上的某个位置上的缺失、插入或取代。
109.在本发明中，可基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(例如，疏水性、亲水性、电荷或大小)来进行氨基酸改变。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型，可以看出：所有精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于上述考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可能是生物功能等效物。
110.在本发明中，为引入改变，可考虑氨基酸的亲水性指数。根据疏水性和电荷，将亲水性指数分配给每个氨基酸：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。为赋予蛋白质相互作用的生物学功能，亲水性氨基酸指数非常重要。已知的事实是，相似的生物活性只能通过用相似的亲水性指数进行取代来保留。当参考亲水性指数引入改变时，在显示亲水性指数差值优选
±
2，更优选
±
1，甚至更优选
±
0的氨基酸之间进行取代。
111.众所周知，在本发明中具有相似亲水性值的氨基酸之间的取代产生具有等效生物活性的蛋白质。将以下亲水性值分配给每个氨基酸：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0
±
1)；谷氨酸(+3.0
±
1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5
±
1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。当参考亲水性值引入改变时，在显示亲水性值差值优选
±
2，更优选
±
1，甚至更优选
±
0.5的氨基酸之间进行取代。
112.在本发明中，在蛋白中不完全改变分子活性的氨基酸置换在本领域是已知的，最常发生的置换是氨基酸之间的置换，诸如ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val和gln/glu。
113.在本发明中，特异性结合lrig-1蛋白的结合分子可结合表位，该表位包括由下式1表示的氨基酸序列组成的多肽：
114.[式1]
[0115]
lx1lx2x3n
[0116]
在式1中，
[0117]
x1至x3可各自独立地为中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸或芳香族氨基酸。此
处，中性氨基酸可以是甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)，酸性氨基酸可以是天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)，碱性氨基酸可以是赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)，芳香族氨基酸可以是苯丙氨酸(f)或酪氨酸(y)。
[0118]
作为本发明的示例，x1至x3可各自独立地为选自天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)、酪氨酸(y)、精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、苏氨酸(t)、丙氨酸(a)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)和甘氨酸(g)的氨基酸。
[0119]
作为本发明的另一个示例，x1可为选自天冬酰胺(n)、苯丙氨酸(f)、天冬氨酸(d)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)、缬氨酸(v)、精氨酸(r)和苏氨酸(t)的氨基酸，x2可为选自丝氨酸(s)、谷氨酰胺(q)、丙氨酸(a)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、苯丙氨酸(f)和甘氨酸(g)的氨基酸，并且x3可为选自酪氨酸(y)、组氨酸(h)、甘氨酸(g)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)和苯丙氨酸(f)的氨基酸。
[0120]
作为本发明的又一个示例，x1至x3可各自独立地为选自天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)、酪氨酸(y)和精氨酸(r)的氨基酸。
[0121]
作为本发明的又一个示例，x1为天冬酰胺(n)或天冬氨酸(d)，x2为丝氨酸(s)或天冬酰胺(n)，并且x3为酪氨酸(y)或精氨酸(r)。
[0122]
在本发明中，表位可包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽，其可以是10至20聚体，优选10至15聚体，并且更优选11至14聚体。
[0123]
此外，在本发明中，在表位中，由式1表示的氨基酸序列组成的多肽可位于从表位的n-末端起的第3至第6位，优选第4至第6位，更优选第5位。
[0124]
作为本发明的示例，由式1表示的氨基酸序列组成的多肽可由下表1所示的seq id no:54至67中的任一个氨基酸序列表示，但本发明不限于此：
[0125]
[表1]
[0126]
序列表序列数据seq id no:54lnlsynseq id no:55ldlnrnseq id no:56lflqhnseq id no:57lnlagnseq id no:58ldlslnseq id no:59lrlsknseq id no:60lklqrnseq id no:61lhleynseq id no:62lhlsnnseq id no:63lvlsfnseq id no:64lrlshnseq id no:65ldldhnseq id no:66ltlfgnseq id no:67lnlggn
[0127]
在本发明中，lrig-1蛋白的表位可包括由下表2所示的seq id no:68至79中的任
一个氨基酸序列表示的多肽：
[0128]
[表2]
[0129]
序列表序列数据seq id no:68wtrslnlsynklseq id no:69tevrntcfphgppiseq id no:70rltqldlnrnrirseq id no:71dlnrnrirliegltfseq id no:72nsiarihrkgwseq id no:73wlppwligrmlqafseq id no:74rqvtfghegryseq id no:75fghegryqcvitnhfseq id no:76rltvnvlpsftktphseq id no:77rrmhvmpdddvffseq id no:78ffitdvkiddagvysseq id no:79kgdrplslterhh
[0130]
在本发明的另一个示例中，表位可由seq id no:66或68的氨基酸序列表示，但本发明不限于此。
[0131]
当考虑到上述生物等效活性的改变时，可解释为本发明的结合分子包含与序列表中所列序列表现出实质同一性的序列。
[0132]
术语“实质同一性”是指当本发明的序列与任何不同的序列尽可能平行地比对，并且使用本领域常规使用的算法分析比对的序列时，具有至少61％同源性，更优选70％同源性，甚至更优选80％同源性，并且最优选90％同源性的序列。用于序列比较的比对方法是本领域已知的。各种比对方法和算法，例如ncbi基本局部比对搜索工具(blast)可在国家生物信息中心(nbci)访问，并与测序程序诸如位于互联网blsat(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)上的blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx结合使用。使用该程序的序列同源性比较方法可在线查看(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html)。
[0133]
在本发明中，结合分子，优选抗体，可通过用于产生抗体的常规方法产生，但是也可通过亲和力成熟产生。
[0134]
在本发明中，“亲和力成熟”是指活化b细胞在免疫应答中产生对抗原亲和力增加的抗体的过程。就本发明的目的而言，亲和力成熟可产生抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是基于突变和选择(如自然界中发生的过程)的原理通过亲和力成熟产生的。
[0135]
在本发明中，抗癌剂可与另一种已知的抗癌剂组合使用。
[0136]
在本发明中，“抗癌剂”可选自例如氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼(nirotinib)、semasanib、博舒替尼、阿昔替尼、西地尼布、来他替尼(restaurtinib)、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生(viscumalbum)、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗(ibritumomab tusetan)、庚铂(heptaplastin)、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲基苄肼、前列地
尔、硝酸钬壳聚糖(holmium nitrate chitosan)、吉西他滨、去氧氟尿苷(doxyfluridine)、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、gimeracin、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依诺他滨、氟他胺、卡培他滨、地西他滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、carmofer、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春碱、伊达比星、丝裂霉素、博来霉素(bleromycin)、放线菌素d、吡柔比星(pyrarubicin)、派洛霉素(pepromycin)、阿柔比星、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑(melparan)、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、tretonin、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、奥拉帕尼、nabelbine、法倔唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorozol)、比卡鲁胺、环己亚硝脲、5fu、伏立诺他、恩替诺特、卡莫司汀、vegf抗体(贝伐单抗)、egfr抗体(西妥昔单抗)、her-2抗体(曲妥珠单抗)、pd-1抑制剂(帕博利珠单抗、纳武利尤单抗(nivolumab))、pd-l1抑制剂(阿替利珠单抗、abelumab、德瓦鲁单抗、sti-1014、cx-072)、ctla-4抗体(伊匹单抗)、lag-3抗体(bms-986016、imp-731、imp-321)、cd137抗体(乌瑞芦单抗、pf-05082566)、gitr抗体(bms-986153、bms-986156、trx-518、mk-4166)、ido拮抗剂(incb-024360、1-甲基-d-色氨酸、nlg-919)、oxo抗体(medi-6383或medi-6469)、oxo40l拮抗剂(rg-7888)、cd40拮抗剂(卢卡木单抗(lukatumumab)、达西珠单抗)和cd27抗体(barlirumab)、cd20抗体(利妥昔单抗)、cd52抗体(kampat-1h)、cd22抗体(依帕珠单抗)、cd25抗体、tigit抗体(替瑞利尤单抗)、ccr4抗体、fr4抗体、cd15抗体、pi-16抗体和lair-1抗体，但本发明不限于此。
[0137]
在本发明中，“预防”或“改善”是指使用本发明的药物组合物预防、抑制或延迟疾病症状的所有作用，而没有限制。
[0138]
此外，在本发明中，“治疗”可包括涉及使用本发明的药物组合物减轻或有益地改变疾病症状的所有作用，而没有限制。
[0139]
在本发明中，药物组合物可被配制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、粉末或饮料的形式，并且药物组合物可以针对人。
[0140]
本发明的药物组合物可以但不限于根据常规方法配制成口服制剂(诸如粉末、颗粒剂、胶囊剂、片剂或水性混悬剂)外用制剂、栓剂和无菌注射液的形式。本发明的药物组合物可包括药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，粘结剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂和香料可用于口服给药，缓冲剂、防腐剂、疼痛缓解剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂的混合物可用于注射剂，基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂可用于局部给药。本发明的药物组合物可通过与上述药学上可接受的载体混合而被制备成各种形式。例如，对于口服给药，本发明的药物组合物可被制备成各种剂型，诸如片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂和硅片，并且对于注射剂，本发明的药物组合物可制备成单位剂量安瓿或多剂量形式。此外，本发明的药物组合物可配制成溶液剂、混悬剂、片剂、胶囊剂或缓释制剂。
[0141]
同时，适于制备的载体、赋形剂和稀释剂的示例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。载体、赋形剂和稀释剂的示例还可包括填充剂、防聚剂、助流剂、润湿剂、芳香剂、乳化剂和防腐剂。
[0142]
根据本发明的药物组合物的给药途径可包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药。口服或肠胃外给药是优选的。
[0143]
本文所用的术语“肠胃外”是指皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注。本发明的药物组合物可以用于直肠给药的栓剂形式给药。
[0144]
本发明的药物组合物可根据各种因素而变化，这些因素包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物制剂以及要预防或治疗的特定疾病的严重程度，并且药物组合物的剂量可由本领域普通技术人员根据患者的状况、体重、疾病的严重程度、药物类型、给药途径和给药持续时间来适当地选择，并且可以是每天0.0001mg/kg至50mg/kg或0.001mg/kg至50mg/kg。本发明的药物组合物可以一天给药一次或分几次给药。该剂量不以任何方式限制本发明的范围。本发明的药物组合物可被配制成丸剂、糖衣片、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂或混悬剂。
[0145]
本发明的食品组合物可被制备成各种类型的食品形式，例如饮料、口香糖、茶、复合维生素、粉末、颗粒剂、片剂、胶囊剂、零食、年糕、面包等。
[0146]
在本发明中，当活性成分包含在食品组合物中时，其可以相对于食品组合物的总重量的0.1％至50％的比例添加，但是本发明不限于此。
[0147]
当本发明的食品组合物被制备成饮料形式时，除了包括所示比例的食品组合物之外没有特别限制，并且与典型的饮料一样，可包含各种甜味剂或天然碳水化合物作为添加剂成分。具体地，上述天然碳水化合物的示例包括常规糖，例如，单糖，诸如葡萄糖、果糖等；二糖，诸如麦芽糖、蔗糖等；多糖诸如糊精、环糊精等；以及糖醇，诸如木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等。作为甜味剂，可有利地使用天然甜味剂[奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如，莱苞迪甙a、甘草甜素等)]和合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
[0148]
本发明的食品组合物还可包括各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(包括合成和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇或用于碳酸饮料的碳酸化剂。
[0149]
在本发明中，上述成分可单独使用或组合使用。添加剂的比例不是本发明的关键因素，但可在相对于100重量份本发明的食品组合物为0.1重量份至约50重量份的范围内选择。然而，本发明不限于此。
[0150]
2.包含抗体-药物偶联物作为活性成分的用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物
[0151]
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种组合物，该组合物包含抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含：与lrig-1蛋白特异性结合的抗体或抗原结合片段；以及作为活性成分的药物。
[0152]
根据本发明，在包含抗体-药物偶联物作为活性成分的用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物中，关于抗体、免疫检查点抑制剂耐药性、癌症、预防、改善等的描述与上文所述的相同，因此省略其描述。
[0153]
在本发明中，“抗体-药物偶联物(adc)”是指药物与抗体化学连接而不降低抗体和药物的生物活性的形式。在本发明中，抗体-药物偶联物是药物与抗体重链和/或轻链n末端的氨基酸残基连接的形式，并且具体地，是药物与抗体重链和/或轻链n末端的α-氨基连接
的形式。
[0154]
在本发明中，“药物”可指在细胞中具有特定生物活性的任何物质，并且是包括dna、rna或肽的概念。药物可以是包含能够通过与α-氨基反应而交联的反应性基团的形式，或者是连接有接头的形式，该接头包含能够通过与α-氨基反应而交联的反应性基团。
[0155]
在本发明中，能够通过与α-氨基反应而交联的反应性基团的类型不受特别限制，只要它能够通过与抗体重链或轻链的n末端处的α-氨基反应而交联，并且包括本领域已知的与氨基反应的所有类型。作为示例，反应性基团可以是异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、nhs酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯中的任一种，但本发明不限于此。
[0156]
在本发明中，抗癌剂可以是但不限于选自氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、semasanib、博舒替尼、阿昔替尼、西地尼布、来他替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗、庚铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲基苄肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、gimeracin、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依诺他滨、氟他胺、卡培他滨、地西他滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、carmopher、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春碱、伊达比星、丝裂霉素、博来霉素、放线菌素d、派洛霉素、吡柔比星、阿柔比星、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、tretonin、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、奥拉帕尼、nabelbine、法倔唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、环己亚硝脲、5fu、伏立诺他、恩替诺特和卡莫司汀。
[0157]
3.预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，包括作为活性成分与lrig-1蛋白特异性结合的结合分子
[0158]
根据本发明的另一个实施方案，提供了预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，该方法包括以药物有效量向受试者施用与lrig-1蛋白特异性结合的结合分子。
[0159]
在本发明的预防或治疗方法中，关于lrig-1蛋白、结合分子、免疫检查点抑制剂耐药性、癌症、治疗和预防的描述与在上文“1.包含结合分子作为活性成分的用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物”中所述的相同，因此将省略。
[0160]
本文所用的“受试者”是被怀疑患有疾病的个体，包括患有或可能患上相应疾病的哺乳动物，包括人、小鼠和家畜，但是包括但不限于可用根据本发明的结合分子治疗的受试者。
[0161]
本发明的方法可包括以药物有效量施用根据本发明的结合分子。合适的总日剂量可由医师在合理的医学判断范围内确定，并给药一次或分成多个剂量给药。然而，就本发明的目的而言，优选根据各种因素对特定患者施用特定的治疗有效量，这些因素包括，待完成的反应的类型和程度，包含特定活性成分的组合物(在一些情况下可包含另一种药剂)，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、包含活性成分的组合物的分泌速率、治疗期和与药物一起使用或同时使用的药物，以及医学领域众所周知的类似
因素。
[0162]
根据本发明的预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法可以是联合疗法，该联合疗法还包括给药对一种或多种疾病具有治疗活性的化合物或物质，但本发明不限于此。
[0163]
应当理解，本文所用的“联合”是指同时、单独或顺序给药。在顺序或单独给药的情况下，第二组分的给药间隔应使得联合疗法的有益效果不会丧失。
[0164]
在本发明中，结合分子的剂量可以是约0.0001μg/kg患者体重至500mg/kg患者体重，但本发明不限于此。
[0165]
4.包含抗体-药物偶联物作为活性成分的预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法
[0166]
根据本发明的又一个实施方案，提供了预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，该方法包括向受试者施用药物有效量的抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含：与lrig-1蛋白特异性结合的抗体或抗原结合片段；以及药物。
[0167]
在本发明的预防或治疗方法中，关于lrig-1蛋白、结合分子、免疫检查点抑制剂耐药性、癌症、治疗和预防的描述与在上文“1.包含结合分子作为活性成分的用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物”中所述的相同，关于抗体-药物偶联物的描述与在上文“2.包含抗体-药物偶联物作为活性成分的用于预防、改善或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的组合物”中所述的相同，关于受试者、联合疗法和治疗的描述与在上文“3.预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，包括结合分子作为活性成分”，因此将省略。
[0168]
有益效果
[0169]
根据本发明的特异性针对lrig-1蛋白的结合分子(优选抗体)，可通过抑制其中lrig-1蛋白以高水平表达的treg细胞(即属于肿瘤浸润淋巴细胞(til)的treg细胞或活化的treg细胞)的功能，非常有效地阻断其中效应t细胞的功能被调节性t细胞(treg细胞)抑制的现象，从而有效地预防、改善或治疗免疫逃避癌症，即对免疫检查点抑制剂具有耐药性的癌症。
附图说明
[0170]
图1示出了根据本发明的一个实施方案的lrig-1蛋白的结构。
[0171]
图2示出了根据本发明的一个实施方案的lrig-1蛋白的结构。
[0172]
图3示出了根据本发明的一个实施方案的lrig-1蛋白的表达水平。
[0173]
图4示出了根据本发明的一个实施方案的lrig-1mrna的表达水平。
[0174]
图5示出了根据本发明的一个实施方案的lrig-1mrna的表达水平。
[0175]
图6示出了根据本发明的一个实施方案的lrig-1mrna、lrig-2mrna和lrig-3mrna的表达水平。
[0176]
图7示出了根据本发明的一个实施方案，lrig-1蛋白在调节性t细胞(treg细胞)和非treg细胞中表达水平的比较结果。
[0177]
图8a和图8b示出了根据本发明的一个实施方案，lrig-1蛋白在treg细胞表面上的表达。
[0178]
图9示出了根据本发明的一个实施方案，分析lrig-1蛋白特异性单克隆抗体
(gtc110-01、gtc110-02、gtc110-03和gtc110-04)与lrig-1蛋白的结合强度的结果。
[0179]
图10示出了根据一个实施方案，使用微阵列对10μg/ml抗lrig-1蛋白的单克隆抗体(gtc110-04)进行表位作图的结果。
[0180]
图11示出了根据本发明的一个实施方案，使用微阵列对100μg/ml抗lrig-1蛋白的单克隆抗体(gtc110-04)进行表位作图的结果。
[0181]
图12示出了根据本发明的一个实施方案，使用微阵列对抗lrig-1蛋白的单克隆抗体(gtc110-04)进行表位作图的结果。此处，人抗体04代表单克隆抗体gtc110-04。
[0182]
图13示出了根据本发明的一个实施方案，分析在lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(gtc110-01、gtc110-02、gtc110-03和gtc110-04)的treg细胞中lrig-1蛋白诱导的stat3磷酸化调节机制的结果。此处，01表示gtc110-01，02表示gtc110-02，03表示gtc110-03，并且04表示gtc110-04。
[0183]
图14a和图14b示出了根据本发明的一个实施方案，根据lrig-1蛋白的表达水平确认treg细胞的效应t细胞抑制作用的结果。
[0184]
图15为根据本发明的一个实施方案，示出了使用lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(gtc110-04)或pd-1抗体对免疫检查点抑制剂耐药癌症治疗效果的实验设计的示意图。
[0185]
图16示出了通过使用lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(gtc110-04)或pd-1抗体治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症来确认肿瘤大小减小的结果。
[0186]
图17示出了根据本发明的一个实施方案，通过荧光激活细胞分选(facs)使用lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(gtc110-04)或pd-1抗体治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症来确认肿瘤浸润淋巴细胞的细胞分布的结果。
具体实施方式
[0187]
本发明的一个实施方案涉及用于预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分与富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)的蛋白特异性结合的结合分子。
[0188]
本发明的另一个实施方案涉及用于预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的药物组合物，该药物组合物包含抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含：与lrig-1蛋白特异性结合的抗体或抗原结合片段；和药物，作为活性成分。
[0189]
本发明的另一个实施方案涉及预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，该方法包括以药物有效量向受试者施用与lrig-1蛋白特异性结合的结合分子。
[0190]
本发明的又一个实施方案涉及预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症的方法，该方法包括以药物有效量向受试者施用抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含：与lrig-1蛋白特异性结合的抗体或抗原结合片段；以及药物。
[0191]
在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。以下实施例仅用于举例说明本发明，本发明的内容并不限于以下实施例。
[0192]
实施例
[0193]
[制备实施例1]培养t细胞亚群
[0194]
为确认lrig-1蛋白是否仅在调节性t细胞(treg细胞，也称为“treg”)中表达，制备t细胞亚群，例如th0、th1、th2、th17和itreg细胞。此处，itreg细胞是指在具有以下组成的
培养基中人工诱导分化的细胞，不同于天然分离的ntreg细胞。
[0195]
在从小鼠的脾脏分离幼稚t细胞后，通过进一步将下表3中的组分添加到含有10％胎牛血清(fbs；hyclone，logan，ut)的rpmi1640(invitrogen gibco，grand island，ny)营养培养基中，t细胞亚群在37℃的5％co2培养箱中培养72小时后诱导分化为单个细胞。
[0196]
[表3]
[0197]
分化细胞组成th0抗cd3、抗cd28th1il-12、抗il-4抗体th2il-4、抗ifnβth17il-6、tgfβ、抗ifnβ、抗il-4itregil-2、tgfβ
[0198]
[制备实施例2]根据lrig-1蛋白的表达水平分离treg
[0199]
通过从foxp3-gfp ki小鼠的脾脏分离幼稚t细胞，并在制备实施例1的表1所示的itreg细胞组成中培养分离出的幼稚t细胞4至6天，使幼稚t细胞分化为itreg细胞。之后，用lrig-1pe抗体(r&d systems fab3688p)染色itreg细胞，然后使用facs根据foxp3
+
细胞中lrig-1的表达水平来分离培养4天的itreg lrig-1
低
和itreg lrig-1
高
和培养6天的itreg lrig-1
低
。
[0200]
[实施例1]分析lrig-1结构
[0201]
为制备特异性针对lrig-1蛋白(其为treg细胞的表面蛋白)的抗体，预测了lrig-1蛋白胞外结构域的3d结构。
[0202]
首先，为预测表位的碱基序列，使用uniprot(http://www.uniprot.org)和rcsb蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)工具预测3d结构以确认lrig-1蛋白的胞外结构域(ecd)的结构，结果如图1和图2所示。
[0203]
如图1所示，在lrig-1蛋白的ecd中，lrig-lrr结构域(氨基酸41至494的序列)中总共有15个富含亮氨酸的lrr1至lrr15的区域。每个lrr结构域由23至27个氨基酸组成，并且包括3至5个亮氨酸。
[0204]
此外，如图2所示，在lrig-1蛋白的ecd的lrig-1蛋白氨基酸序列中位置494至781处有三个免疫球蛋白样结构域。
[0205]
[制备实施例1至8]制备特异性针对lrig-1蛋白的单克隆抗体
[0206]
根据本发明制备了一种抗体，该抗体是结合lrig-1蛋白的结合分子。
[0207]
为制备抗体，制备了表达lrig-1蛋白的细胞。具体来说，用切割酶切割pcdna(hygro)和对应于seq id no:2的dna片段，并在37℃温育以进行连接，从而制备其中插入了lrig-1蛋白的dna序列的pcdna。将插入了seq id no:2序列的pcdna转染到l细胞中，使得lrig-1蛋白可在l细胞表面上表达。
[0208]
从人scfv文库中选择能够与细胞表面上表达的lrig-1结合的轻链和重链的氨基酸序列，从而获得总共8条重链和轻链。
[0209]
将所选重链和轻链的氨基酸序列与mlgg2a fc区域或人igg1融合，从而制备对应于制备实施例1至5的单克隆抗体。单克隆抗体的序列如下表4所示。
[0210]
[表4]
[0211][0212][0213]
[实施例2]确认treg细胞中lrig-1mrna的特异性表达
[0214]
验证lrig-1蛋白是否可以作为treg特异性生物标记物。
[0215]
为了验证，使用cd4珠通过磁性激活细胞分选(macs)从小鼠的脾脏分离cd4
+
t细胞。随后，使用cd25抗体通过facs分离treg(cd4
+
cd25
+
t)细胞和非调节性t(cd4
+
cd25-t)细胞。使用trizol从每种类型的细胞和制备实施例1中分离的细胞中提取mrna，并根据制造商的方案使用gdna提取试剂盒(qiagen)从基因组rna中去除gdna。bdsprint cdna合成试剂盒(clonetech)用于由去除了gdna的mrna合成cdna。
[0216]
为了定量来自cdna的lrig-1mrna的表达水平，进行实时聚合酶链式反应(实时pcr)。
[0217]
根据制造商的方案使用sybr green(分子探针)，用下表5所示的引物进行实时pcr，进行在95℃3分钟、61℃15秒和72℃30秒的40个循环，并使用δδct方法计算相对基因表达水平，然后通过hprt归一化。结果如图3至图6所示。
[0218]
[表5]
[0219][0220]
如图3所示，可以看出，与非调节性t(cd4
+
cd25-t)细胞相比，在treg(cd4
+
cd25
+
t)细胞中lrig-1的表达高达18.1倍。与常规已知的treg标记物lag3和ikzf4相比，表达高达约10倍水平。
[0221]
此外，如图4和图5所示，与不同类型的免疫细胞(例如treg细胞，特别是分化诱导的treg细胞(itreg细胞))相比，在天然分离的treg细胞(ntreg细胞)中，lrig-1的mrna表达显著更高。此外，如图6所示，在对应于lrig家族的lrig-1、lrig-2和lrig-3的mrna中，lrig-1的mrna表达水平最高。
[0222]
从上述结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白在treg细胞中(特别是在天然存在的treg细胞中)特异性表达。
[0223]
[实施例3]确认treg细胞中lrig-1蛋白的特异性表达
[0224]
确认了由lrig-1mrna表达的lrig-1蛋白是否仅在treg细胞中特异性表达。
[0225]
从foxp3-rfp敲入小鼠的脾脏中分离cd4
+
t细胞，该小鼠使用cd4珠通过macs将红色荧光蛋白(rfp)与treg特异性转录因子foxp3启动子结合来准备。随后，使用rfp蛋白通过facs分离treg(cd4
+
rfp
+
t)细胞和非调节性t(cd4
+
rfp-t)细胞。用购买的lrig-1抗体染色每种类型的细胞，用同种型染色阴性对照，然后进行facs测量lrig-1蛋白的表达水平。结果如图7所示。
[0226]
如图7所示，由虚线表示的非调节性t细胞显示与阴性对照几乎相同的lrig-1蛋白表达水平，同时存在许多具有较高lrig-1蛋白表达水平的treg细胞。
[0227]
从上述结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白在treg细胞中特异性表达。
[0228]
[实施例4]确认treg细胞表面上lrig-1蛋白的特异性表达
[0229]
为了成为细胞疗法的靶标，lrig-1蛋白必须在treg细胞表面上表达以进行更有效的靶向治疗，从而确认了lrig-1蛋白是否在treg细胞表面上表达。
[0230]
用抗cd4-apc和抗lrig-1-pe抗体染色制备实施例1中分化的每个t细胞亚群，并且通过facs测量细胞表面上lrig-1蛋白的表达水平。结果如图8a和图8b所示。
[0231]
如图8a和图8b所示，在活化的t细胞、th1细胞、th2细胞、th17细胞和幼稚t细胞中，lrig-1蛋白的表达水平为0.77至15.3，而在itreg细胞中，lrig-1蛋白的表达水平高达83.9。
[0232]
从上述结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白不仅在treg细胞中特异性表达，而且在treg细胞表面上也有更高表达。
[0233]
[实施例5]评估根据本发明的抗体与lrig-1蛋白的结合能力
[0234]
为确认根据本发明在制备实施例1至4中制备的单克隆抗体是否能够很好地识别lrig-1蛋白，将制备实施例1至4中制备的每种类型的抗体与稳定表达lrig-1蛋白的l细胞结合，然后添加能够识别小鼠抗体并与eflour 670偶联的二抗，之后通过facs分析单克隆抗体与lrig-1蛋白的结合能力。结果如图9所示。
[0235]
如图9所示，可以确认，根据本发明在制备实施例1至8中制备的特异性针对lrig-1蛋白的所有抗体都能有效地识别存在于l细胞表面的lrig-1蛋白并与之结合。
[0236]
[实施例6]根据本发明的lrig-1蛋白的表位确定
[0237]
为找到制备实施例4的gtc110-04克隆抗体的结合表位，进行了以下实验，该结合表位存在于treg细胞表面上的lrig-1蛋白的lrr和ig样结构域中。
[0238]
1.实验准备
[0239]
(1)微阵列
[0240]
为防止lrig-1蛋白中的肽切割，在lrig-1蛋白的每个c-末端和n-末端延长gsgsgsg接头。由于14个氨基酸的肽-肽重叠，延长的抗原序列被翻译成15个氨基酸。作为最终lrig1肽的微阵列结果，1091种不同的肽被鉴定为重复，并由附加的ha(ypydvpdyag，102个斑点)对照肽框定。
[0241]
(2)实验材料
[0242]
样品：制备实施例4的gtc110-04单克隆抗体
[0243]
洗涤缓冲液：含0.05％吐温20的pbs(ph 7.4)(3次，每次培养后10秒)
[0244]
封闭缓冲液：rockland封闭缓冲液mb-070(第一次测定前30分钟)
[0245]
培养缓冲液：添加了10％封闭缓冲液的洗涤缓冲液
[0246]
测定条件：将培养缓冲液中的抗体浓度调整为1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml；在4℃培养16小时，并以140rpm搅拌
[0247]
二抗：山羊抗人igg(h+l)dylight680(0.2μg/ml)；室温下在培养缓冲液中染色45分钟
[0248]
对照抗体：小鼠单克隆抗ha(12ca5)dylight800(0.5μg/ml)；室温下在培养缓冲液中染色45分钟
[0249]
扫描仪：li-cor odyssey成像系统；扫描偏移量：0.65mm，分辨率：21μm，扫描强度：
7/7(红＝700nm/绿＝800nm)
[0250]
2.实验方法
[0251]
为确认是否可以与能够在主要测定中引起干扰的抗原衍生肽进行交互作用，使用培养缓冲液中的二抗和对照抗体对lrig-1肽的微阵列复制物进行预染色。随后，与制备实施例4的gtc110-04单克隆抗体(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)一起，在培养缓冲液中进行另一lrig-1肽的微阵列复制物的附加培养，然后用二抗和对照抗体染色。使用li-cor odyssey成像系统以7/7(红/绿)的扫描强度进行读出。斑点强度和肽注释的定量以16位灰度tiff文件表示。使用分析仪分析微阵列图像。结果如图10至图12所示，分析的表位序列如下表6所示。
[0252]
[表6]
[0253]
序列表序列数据seq id no:68wtrslnlsynklseq id no:69tevrntcfphgppiseq id no:70rltqldlnrnrirseq id no:71dlnrnrirliegltfseq id no:72nsiarihrkgwseq id no:73wlppwligrmlqafseq id no:74rqvtfghegryseq id no:75fghegryqcvitnhfseq id no:76rltvnvlpsftktphseq id no:77rrmhvmpdddvffseq id no:78ffitdvkiddagvysseq id no:79kgdrplslterhh
[0254]
3.实验结果
[0255]
如图10至图12所示，可以确认，通过特异性结合存在于treg细胞上的lrig-1蛋白而有效治疗癌症的单克隆抗体(gtc110-04)通过特异性结合表位而表现出上述功能，该表位由lrig-1蛋白中的seq id no:68至79组成。此外，由seq id no:66和68表示的表位可具有共同的富含亮氨酸的重复序列，具体来说，在从n-末端起的第5个氨基酸位置处可包括可由下式1的氨基酸序列表示的共有序列。
[0256]
[式1]
[0257]
lx1lx2x3n
[0258]
在式1中，
[0259]
x1至x3可各自独立地为中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸或芳香族氨基酸。此处，中性氨基酸可以是甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)，酸性氨基酸可以是天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)，碱性氨基酸可以是赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)，芳香族氨基酸可以是苯丙氨酸(f)或酪氨酸(y)。
[0260]
[实施例7]根据本发明的抗体对treg细胞中的信号通路的调节
[0261]
为分析根据本发明在制备实施例1至4中制备的单克隆抗体如何通过lrig-1蛋白
影响treg细胞中的信号通路，采用制备实施例1至4的每种抗体处理treg细胞来刺激存在于treg细胞表面上的lrig-1蛋白，采用磷酸酪氨酸免疫印迹分析存在于经刺激的treg细胞中的stat3蛋白的酪氨酸磷酸化程度。结果如图13所示。
[0262]
如图13所示，可以确认，单克隆抗体(gtc110-01、gtc110-02、gtc110-03和gtc110-04)是与根据本发明的lrig-1蛋白特异性结合的结合分子，该单克隆抗体将stat3磷酸化连续维持并在与itreg细胞相同的水平上减少。
[0263]
[实施例8]根据lrig-1表达水平确认treg细胞功能
[0264]
将制备实施例2中分离的培养4天的itreg lrig-1
低
(在下文中，称为“4d itreg lrig-1
高”)、培养4天的itreg lrig-1
高
(在下文中，称为“4d itreg lrig-1
高”)或培养6天的itreg lrig-1
低
(在下文中，称为“6d itreg lrig-1
低”)与从c57bl/6小鼠中分离的效应t细胞以1:1或2:1混合并培养，然后通过facs分析每种类型的treg细胞抑制效应t细胞的程度。结果如图14a和图14b所示。
[0265]
如图14a和图14b所示，当效应t细胞与4d itreg lrig-1
低
和6d itreg lrig-1
低
混合时，15.3％(2:1)和24.4％(2:1)的效应t细胞的功能被抑制，但是当与4d itreg lrig-1
高
混合时，45.1％(2:1)和34.2％(1:1)的效应t细胞的功能被抑制。
[0266]
因此，在其表面上表达根据本发明的lrig-1蛋白的treg细胞是能够抑制效应t细胞的活化的treg细胞，并且被鉴定为肿瘤浸润淋巴细胞(til)。因此，与treg细胞表面上表达的lrig-1蛋白特异性结合的结合分子可通过有效抑制效应t细胞的功能而最终诱导效应t细胞引起的癌细胞死亡。
[0267]
此外，可以看出，这是独立于癌细胞和效应t细胞之间发生的肿瘤细胞的免疫检查点逃避的机制，并且通过维持效应t细胞的活性，非常有效地应用到由于免疫检查点抑制剂导致的耐药癌症，从而产生癌症的预防、改善或治疗。
[0268]
[实施例9]确认免疫检查点抑制剂耐药癌症的治疗效果(1)
[0269]
如图15所示，为比较根据本发明在制备实施例中制备的单克隆抗体(gtc110-04)和常规的免疫检查点抑制剂(其为pd-1抗体)对实体瘤的治疗效果，通过皮下注射将3
×
105个b16f10黑色素瘤细胞施用于小鼠背部，并且在第4、8、12天时，向小鼠腹膜注射200μg制备实施例8的抗体(gtc110-04)或pd-1抗体。在移植黑色素瘤细胞后，测量肿瘤体积随时间的变化。结果如图16所示。
[0270]
如图16所示，当注射pd-1抗体时，肿瘤大小仅与阴性对照的肿瘤大小相似，而当注射单克隆抗体(gtc110-04)(其是与根据本发明的lrig-1蛋白特异性结合的结合分子)时，与阴性对照相比，肿瘤大小显著减小。
[0271]
因此，可以看出，根据本发明的特异性针对lrig-1蛋白的单克隆抗体可以抑制不能通过pd-1治疗的具有免疫检查点抑制剂耐药性的实体瘤细胞的生长，从而能够有效预防、改善或治疗具有免疫检查点抑制剂耐药性的实体瘤。
[0272]
[实施例10]确认免疫检查点抑制剂耐药癌症的治疗效果(2)
[0273]
研究了实施例9中til在黑色素瘤动物模型中的细胞分布。
[0274]
具体来说，从黑色素瘤小鼠模型中取出肿瘤组织，然后放入含有2ml pbs(含有2％fbs)的6孔板中，之后使用电子管将其精细研磨。此处，当肿瘤组织的尺寸太大时，首先用剪刀剪下该组织。将精细研磨过的肿瘤组织和通过过滤器过滤后附着于电子管壁的所有组织
放入50ml管中，调整至最终体积为20ml，然后在4℃和2000rpm离心10分钟。之后，通过抽吸去除所得的上清液，添加3ml rbc裂解缓冲液，并在室温下反应30秒，然后通过添加2％rpmi使其失活。随后，通过离心去除上清液，并且通过过滤器过滤重悬的颗粒，然后离心。之后，将使用8ml红44％percoll(percoll:rpmi＝11:14)重悬的颗粒转移到15ml管中，使用巴斯德吸管将5ml纯67％percoll(percoll:pbs＝67:33)缓慢添加到15ml管的下层。将15ml管在4℃和2000rpm下以无制动条件离心20分钟，去除至多约1ml的血沉棕黄层，然后分离血沉棕黄层并转移到15ml管中。之后，在含有血沉棕黄层的15ml管中使用含有2％fbs的pbs进行重悬，然后测量til的数量。
[0275]
将上述获得的til以1
×
106个细胞/200μl接种于圆底96孔细胞培养板的每个孔中，并以2500rpm离心2分钟。之后，去除所得上清液，将稀释在pbs中的靶向主要标记物(cd4、cd8和lrig-1)的抗体以50μl分散到每个孔中，然后通过移液充分混合。随后，使用箔将板遮光，并将板在4℃冰箱中温育30分钟，然后再添加150μl pbs以进行离心。之后，将80μl固定/破膜剂分散到每个孔中，在4℃温育30分钟，并添加120μl 1
×
破膜缓冲液以进行离心。最后，将1μl包含在1
×
破膜缓冲液中的第二标记物(foxp3)以50μl分散到每个孔中，并在4℃温育30分钟，将通过离心获得的细胞重悬在200μl pbs中，然后通过facs测量。结果如图17所示。
[0276]
如图17所示，当注射pd-1抗体时，与对照相比，浸润肿瘤的cd8
+
t细胞数量没有显著增加，而当注射单克隆抗体(gtc110-04)(其是与根据本发明的lrig-1蛋白特异性结合的结合分子)时，与阴性对照相比，浸润肿瘤的cd8
+
t细胞数量增加了一倍多。此外，已确认pd-1抗体不会改变浸润肿瘤的cd8
+
t细胞数量，而单克隆抗体(gtc110-04)会显著减少浸润肿瘤的cd8
+
t细胞数量。
[0277]
从上述结果可以看出，与根据本发明的lrig-1蛋白特异性结合的结合分子显著减少了浸润肿瘤的cd4
+
foxp3
+
t细胞数量，改善了效应t细胞的功能，从而在预防或治疗免疫检查点抑制剂耐药癌症方面更有效地表现出协同效应。
[0278]
尽管已经参考本发明的示例性实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域的普通技术人员来说，显而易见的是，在不脱离权利要求中描述的本发明的技术实质的情况下，可以进行多种修改和变型。
[0279]
[工业适用性]
[0280]
根据本发明的特异性针对lrig-1蛋白的结合分子(优选抗体)，可以通过抑制其中lrig-1蛋白以高水平表达的treg细胞(即，属于til的treg细胞或活化的treg细胞)的功能，非常有效地阻断其中效应t细胞的功能被调节性t细胞(treg细胞)抑制的现象，从而有效地预防、改善或治疗免疫逃避癌症，即对免疫检查点抑制剂具有耐药性的癌症。
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
[0293]
[0294]
[0295]
[0296]
[0297]
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]