用于治疗癌症的阿片类生长因子受体(OGFR)拮抗剂，特别是纳洛酮和/或纳曲酮的制作方法

用于治疗癌症的阿片类生长因子受体(ogfr)拮抗剂，特别是纳洛酮和/或纳曲酮
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月15日提交的美国临时申请62/874037的优先权，其公开内容以其全文通过引用并入。
技术领域
3.本发明涉及用于治疗癌症的方法和组合物。


背景技术：

4.癌症是一组涉及异常细胞生长而有可能侵入或扩散到身体的其它部位的疾病。2015年，约有9050万人患有癌症。每年约有1410万新病例发生(不包括黑色素瘤以外的皮肤癌)，并且癌症每年导致约880万人死亡或占所有死亡人数的约15.7％。癌症总体来说是当今美国第二大死亡原因。癌症的风险随着年龄的增长而显著增加，并且许多癌症在发达国家更常见。
5.癌症被认为表现出六种特征，这些特征是癌细胞形成肿瘤并发展为恶性状态的能力的基础，允许细胞繁殖并侵入原始组织以外的其它组织。这六个特征是：没有适当信号的细胞生长和分裂、即使有相反的信号也持续生长和分裂、避免程序性细胞死亡、细胞分裂数量无限、促进血管构建、侵入组织和形成转移灶。
6.虽然我们对癌症特征的理解已大大提高，但没有任何基本特性或特征与当今已知的广泛癌症相关联而使得癌症的有效统一和成功的治疗策略成为可能。癌症可以通过手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法和靶向疗法(包括免疫疗法如单克隆抗体疗法)来治疗。疗法的选择取决于肿瘤的位置和等级及疾病的阶段以及患者的总体状态。
7.尽管我们对癌症发展的机制的理解迅速提高，但许多(如果不是大多数的话)癌症仍然无法治愈，并且对于癌症的新治疗策略仍然存在巨大的医学需求。
8.发明概述
9.一个实施方案是一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括将阿片类生长因子受体(ogfr)拮抗剂局部施用到受试者含有癌细胞的部位。在一些实施方案中，ogfr拮抗剂包括纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、其功能性衍生物或类似物、或其组合。另一个实施方案是用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法的组合物，包括将阿片类生长因子受体(ogfr)拮抗剂局部施用至受试者含有癌细胞的部位。
10.在一些实施方案中，癌症包括软组织非成骨肉瘤、骨肉瘤(bone sarcomas)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、良性骨肿瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、甲状腺腺癌、胶质母细胞瘤、垂体瘤、少突胶质细胞瘤、膀胱癌、三阴性乳腺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤或星形细胞瘤。在一些实施方案中，ogfr拮抗剂以约1mm至约10mm的局部剂量施用。
11.一方面，ogfr拮抗剂通过瘤内注射局部施用。
12.另一方面，ogfr拮抗剂与药学上可接受的载体一起施用。在一些实施方案中，药学
上可接受的载体包括胶原蛋白海绵、粉状胶原蛋白或基于胶原蛋白的明胶水凝胶。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括基于水凝胶的载体。在一个具体实施方案中，药学上可接受的载体是胶原蛋白海绵。在一些实施方案中，基于水凝胶的载体包括聚-(乳酸)/聚-(乙二醇)/聚-(乳酸)水凝胶、聚-(乙二醇)/聚-(乳酸)/聚-(乙二醇)水凝胶或其组合。在一个具体实施方案中，基于水凝胶的载体是聚-(乙二醇)/聚-(乳酸)/聚-(乙二醇)。
13.在一些实施方案中，ogfr拮抗剂与稀释剂一起施用，其中稀释剂提高ogfr拮抗剂的溶解度。在一些实施方案中，稀释剂包括极性有机溶剂。优选地，极性有机溶剂是二甲亚砜(dmso)，包括基于dmso的盐水溶液。在另一个实施方案中，增强溶解度的稀释剂是酸化的基于盐水的溶液、醇、多元醇、烷烃、脂肪酸、酯、胺、酰胺、萜烯、环糊精或表面活性剂。在一个实施方案中，稀释剂包括基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约5％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约50％v/v的dmso。在一些实施方案中，酸化的基于盐水的溶液表现出约4.5至约7.4的ph。
14.附图简述
15.图1描绘了显示在作为阿片类生长因子受体(ogfr)拮抗剂的纳洛酮治疗三阴性乳腺癌细胞(bt474)、骨肉瘤细胞(saos2)和乳腺癌细胞(bt20)时与非肿瘤细胞相比乳酸脱氢酶(ldh)的表达的图。显示了在纳洛酮治疗非肿瘤细胞时ldh的表达与ldh的释放有关。
16.图2描绘了显示与正常非肿瘤细胞乳腺上皮(humec)和正常血管内皮(huvec)细胞相比，三阴性乳腺癌细胞(bt474)的细胞数随纳洛酮剂量增加而变化的图。
17.图3描绘了显示纳洛酮(ogfr拮抗剂)处理减少体外肿瘤尺寸的球体测定。图3a显示了在剂量为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm和5mm的纳洛酮处理和无处理对照的情况下，由saos2(骨肉瘤)和bt474(三阴性乳腺癌)细胞形成的肿瘤球体。图3b描绘了以处理后时间0和120小时之间球体面积分数的百分比变化显示在图3a中描述的球体测定中形成的球体尺寸量化的图。图3c描绘了以处理后120小时每个球体中细胞面积分数的百分比变化显示在图3a中描述的球体测定中形成的球体尺寸量化的图。
18.图4显示了纳洛酮制剂对植入mda-mb-231三阴性乳腺癌细胞的小鼠中肿瘤生长的影响。将所述制剂植入8周龄雌性cr裸鼠的胫骨中。图4a显示了在60天内测量的肿瘤卡尺体积。制剂植入组的肿瘤体积是1/2倍。回归分析发现两个治疗组的斜率显著不同(p《0.001)。图4b显示了使用kaplan-meier统计对存活率的评估。制剂治疗组的存活率是2倍(p《0.0328)。
19.发明详述
20.本文的公开内容基于与非肿瘤细胞相比纳洛酮选择性地诱导肿瘤细胞中的细胞毒性的惊人发现。因此，本公开提供了可用于抑制肿瘤细胞生长同时保留周围正常细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，本公开提供了用于在患者体内邻近肿瘤或癌细胞局部施用ogfr的方法和组合物。
21.本文的示例性实施例表明，纳洛酮对骨肉瘤和乳腺癌细胞(包括三阴性乳腺癌细胞)的生长具有选择性抑制作用。在一些实施方案中，与通过增加的乳酸脱氢酶(ldh)表达确定的相应的非肿瘤细胞相比，纳洛酮治疗在肿瘤细胞中选择性地诱导细胞毒性。在一些实施方案中，相对于骨肉瘤细胞和乳腺癌细胞中的非肿瘤细胞，纳洛酮诱导ldh表达增加到
6倍。在一些实施方案中，纳洛酮诱导三阴性乳腺癌细胞中ldh表达增加到3倍。在一些实施方案中，与非癌细胞相比，纳洛酮治疗选择性地抑制癌细胞增殖，这通过在纳洛酮治疗72小时后计数细胞数来确定。参见图1和2。在一些实施方案中，纳洛酮治疗减少了三阴性乳腺癌细胞的肿瘤生长，如球体测定法所确定。参见图3。在一些实施方案中，当植入小鼠中由三阴性乳腺癌细胞形成的肿瘤附近时，纳洛酮制剂nalovent
tm
在体内减少了肿瘤生长。参见图4。
22.尽管示例性实施例证明了本文公开的方法和组合物用于治疗骨肉瘤和乳腺癌的用途，但预期本公开可用于治疗所有类型的癌症。通常，癌症是指异常细胞不受控制地分裂并可以侵入附近组织的情况。有几种主要类型的癌症。癌是一种始于皮肤或排列或覆盖内脏器官的组织的癌症。肉瘤是一种始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔或支持组织的癌症。白血病是一种始于造血组织(如骨髓)而且导致大量异常血细胞产生并进入血液的癌症。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是始于免疫系统细胞的癌症。中枢神经系统癌症是始于大脑和脊髓组织的癌症。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、胃肠道癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌和黑色素瘤的一种或多种。在一些实施方案中，癌症是软组织非成骨肉瘤、骨肉瘤(bone sarcomas)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、良性骨肿瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、甲状腺腺癌、胶质母细胞瘤、垂体瘤、少突胶质细胞瘤、膀胱癌、三阴性乳腺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤或星形细胞瘤。
23.定义
24.提供以下定义以便于理解贯穿本说明书使用的某些术语。
25.除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法可用于实施本文所述的方法。
26.如在本发明的说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”可互换使用并且拟也包括复数形式并且落入每个含义中，除非上下文另有明确说明。此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个所列项目的任何和所有可能的组合，以及在备选方案(“或”)中解释时不包括组合。
27.所有数字名称，例如ph、温度、时间、浓度、量和分子量，包括范围，都是近似值，其酌情变化(+)或(-)10％、1％或0.1％。应当理解，尽管并不总是明确说明，但所有数字名称前都可以加上术语“约”。还应理解，尽管并不总是明确说明，但本文所描述的试剂仅是示例性的并且其等价物在本领域中是已知的。
28.术语“包括”或“包含”拟表示组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其它元素。“基本上由
……
组成”在用于定义组合物和方法时，应表示排除对组合具有任何重要意义的其它元素。例如，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质影响所要求保护的发明的基本和新颖性特征的其它元素。“由
……
组成”应表示排除超过痕量的权利要求所述的其它成分和主要方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
29.如本文所用，术语“拮抗剂”与“抑制剂”可互换使用，并且是指阻断或抑制靶标的活性、功能、效果或表达的底物。在一些实施方案中，靶标是化合物、蛋白质、基因、细胞或试剂。如本文所用，术语“表达”是指活细胞产生的靶标的量。在一些实施方案中，抑制剂抑制靶基因或蛋白质的表达。在一些实施方案中，抑制剂包括防止另一分子与酶或分子泵结合
的化合物。在一些实施方案中，抑制剂是引起酶下调的化合物。在一些实施方案中，抑制剂可以是竞争性或非竞争性抑制剂。
30.如本文所用，术语“施用”包括开具施用的处方以及实际施用，并且包括由被治疗的受试者或由另一人物理施用。
31.如本文所用，“受试者”、“患者”或“个体”是指任何受试者、患者或个体，并且这些术语在本文中可互换使用。在这方面，术语“受试者”、“患者”和“个体”包括哺乳动物，并且尤其是人类。当与“有需要的”结合使用时，术语“受试者”、“患者”或“个体”拟指具有特定症状或病症或处于特定症状或病症风险中的任何受试者、患者或个体。
32.如本文所用，在“剂量”或“量”的上下文中的短语“治疗有效的”或“有效的”是指提供一种化合物或多种化合物被施用的特定药理作用的剂量或量。需要强调的是，治疗有效量并不总是有效地在给定受试者中实现预期效果，即使本领域技术人员认为这样的剂量是治疗有效量。仅为方便起见，本文提供了示例性剂量。本领域技术人员可以根据本文公开的方法调整此类量以治疗患有特定症状或病症的特定受试者。治疗有效量可以根据施用途径和剂型而变化。
33.术语“治疗”或“处理”涵盖本文所述癌症在受试者例如人中的治疗，并且包括(i)抑制癌症，即阻止其发展；(ii)缓解癌症或病症，即导致癌症消退；(iii)减缓癌症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减慢癌症的一种或多种症状的进展。例如，癌症的治疗包括但不限于消除癌症或由癌症引起的病症、缓解肿瘤、抑制癌症或者减轻或消除肿瘤的至少一种症状。
34.术语“类似物”是指其中一个或多个单独的原子或官能团已被不同原子或不同官能团取代的化合物，通常产生具有相似性质的化合物。在某些方面，类似物是指与另一个相似但在一个或两个组分方面不同的结构。
35.术语“衍生物”是指由相似的起始化合物通过将另一个分子或原子连接到所述起始化合物而形成的化合物。此外，根据本发明，衍生物包括由前体化合物通过添加一个或多个原子或分子或通过结合两种或更多种前体化合物形成的一种或多种化合物。
36.阿片类生长因子受体(ogfr)拮抗剂
[0037]“阿片类生长因子受体(ogfr)拮抗剂”是指阻止至少一种ogfr介导的生物活性、抑制至少一种ogfr介导的生物活性或导致至少一种ogfr介导的生物活性停止的任何分子，例如纳洛酮或其功能性衍生物。
[0038]
在一些实施方案中，ogfr拮抗剂是ogfr结合拮抗剂，即干扰、阻断或以其它方式阻止met5-配体(ogf)与ogfr的相互作用或结合的分子。met-5来源于激素原脑啡肽原(penk)。
[0039]
ogfr结合拮抗剂可以与met5-配体竞争结合核膜表面上的ogfr，从而干扰、阻断或以其它方式阻止met5-配体与ogfr的结合，而不触发将否则由met5-配体与ogfr的结合诱导的下游信号传导。或者，ogfr结合拮抗剂可以以足够的亲和力和特异性结合或隔离脑啡肽原(penk)或met5-配体，以显著干扰、阻断或以其它方式阻止met5-配体与ogfr的结合，从而阻止至少一种ogfr介导的生物活性、抑制至少一种ogfr介导的生物活性或导致至少一种ogfr介导的生物活性停止。一般而言，ogfr结合拮抗剂可以是大分子(例如抗体)或小分子(例如分子量小于15-kd、12-kd、10-kd或甚至8-kd的化合物)，并且可以是多肽、核酸或合成的小分子化合物。ogfr结合拮抗剂可以通过本领域技术人员容易选择的任何体外测定法来
鉴定。例如，ogfr拮抗剂可以使用美国专利5,882,944、美国专利6,007,986或美国专利6,270,979中描述的方法进行鉴定。
[0040]
在一个实施方案中，ogfr结合拮抗剂是纳洛酮或其功能性衍生物、纳曲酮或其功能性衍生物、或它们的组合。
[0041]
如本文所用，“功能性衍生物”是指在结构和功能上与起始分子相似的衍生物或类似物(例如保持纳曲酮或纳洛酮作为ogfr拮抗剂的功能)。可以使用标准合成程序合成纳洛酮和纳曲酮类似物，例如march j.,advanced organic chemistry,第3版(1985)中描述的那些。纳曲酮和纳洛酮功能性衍生物的实例包括盐形式，例如盐酸纳洛酮二水合物或盐酸纳曲酮。适用于本方法的纳曲酮和纳洛酮功能性衍生物的其它实例包括例如美国专利申请公开2007/0197573a1、美国专利6,713,488中公开的纳曲酮和纳洛酮类似物。
[0042]
在另一个实施方案中，ogfr结合拮抗剂衍生自羟吗啡酮(oxymorphone)并与ogfr结合，其包括纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、纳洛啡(nalorphine)、纳洛嗪(naloxonazine)、左洛芬(levallorphan)、纳美芬(nalmefene)、环丙啶(cyprodime)、环吗啡(cyclorphan)、环唑辛(cyclazocine)、奥昔洛芬(oxilorphan)、ly113878、mr2266、二丙诺啡(diprenorphine)、win 44,441-3、纳丁多尔(naltindole)或去比萘尔妥嘧啶(norbinaltorphimine)。
[0043]
在又一个实施方案中，ogfr结合拮抗剂衍生自反式-3,4-二甲基-4-苯基哌啶并结合ogfr，其包括ly99335、ly25506、ly117413或ly255582。
[0044]
在另一个实施方案中，ogfr结合拮抗剂衍生自met5-脑啡肽或leu-脑啡肽肽类，与ogfr结合，并且最低限度包括以下氨基酸序列作为靶向ogfr的手段：针对于衍生自met5-脑啡肽的那些的tyr-gly-gly-phe-met(seq id no:1)或针对于于衍生自leu-脑啡肽的那些的tyr-gly-gly-phe-leu(seq id no:2)。
[0045]
在又一个实施方案中，ogfr结合拮抗剂衍生自肽拮抗剂101174864(n,n-二烯丙基-tyr-aib-aib-phe-leu-oh,seq id no:3；aib＝氨基异丁酸)或生长抑素类似物ctp(d-phe-cys-tyr-d-trp-lys-thr-pen-thr-nh.sub.2,seq id no:4)。
[0046]
在其它实施方案中，ogfr拮抗剂不是ogfr结合拮抗剂，而是一分子，其破坏在ogfr中发现的核定位序列：251qsaldyfmfavrcrhqrrqlvhfawehfrprckfvwgpqdklrrfkpssl(seq id no:5)。
[0047]
在其它实施方案中，本方法中使用的ogfr拮抗剂是针对ogfr基因并有效破坏ogfr基因表达的小发夹rna(shrna)或小干扰rna(sirna)。
[0048]
本文所述的ogfr拮抗剂可以单独或组合施用。合适的组合包括例如纳洛酮和纳曲酮；纳洛酮和/或纳曲酮，与另一种ogfr结合拮抗剂或另一种ogfr拮抗剂联合使用。
[0049]
局部施用的递送系统和载体
[0050]
在本公开的一方面，ogfr拮抗剂在肿瘤部位附近局部施用。在一些实施方案中，ogfr拮抗剂以约1μm至约1mm的局部剂量施用。在一些实施方案中，ogfr拮抗剂以约1mm至约10mm的局部剂量施用。在一些实施方案中，局部剂量是1mm、1.5mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm、6.0mm、7.0mm、8.0mm、9.0mm和/或10.0mm。
[0051]
在一些实施方案中，ogfr拮抗剂与载体一起施用，并且载体体积可为约0.1立方厘米(cc)至约20cc、约0.25cc至约15cc、约0.5cc至约10cc、约1cc至约10cc、约2cc至约10cc。
载体中ogfr拮抗剂的相应量可以是约0.2mg/cc、0.5mg/cc、1.0mg/cc、2.0mg/cc、3.0mg/cc、4.0mg/cc、5.0mg/cc、6.0mg/cc、7.0mg/cc、8.0mg/cc、9.0mg/cc和/或10.0mg/cc。
[0052]
在一些实施方案中，ogfr拮抗剂通过瘤内注射局部施用。
[0053]
在一些实施方案中，ogfr拮抗剂与载体组合或封装在载体中施用。
[0054]
合适的载体可以是珠子、微球或纳米颗粒形式，并且可以由天然和/或合成的生物相容性聚合物制成。合适的生物相容性聚合物的实例包括透明质酸、胶原蛋白、磷酸三钙、硫酸软骨素、聚丁酸酯、聚丙交酯、聚乙交酯和丙交酯/乙交酯共聚物、以及它们的混合物或共聚物。合适的载体还包括非聚合物体系(on-polymer systems)如羧酸、脂肪酸、磷脂、氨基酸、脂质如甾醇、水凝胶释放体系；硅橡胶(silastic)体系；基于肽的体系；植入物等。
[0055]
在一个实施方案中，载体是吸湿性基于胶原蛋白的载体，例如胶原蛋白海绵、胶原蛋白支架、粉状胶原蛋白或基于胶原蛋白的明胶水凝胶。
[0056]
在另一个实施方案中，载体是亲水性基于水凝胶的载体(例如聚乳酸、聚乙醇酸)，其允许注入其中的ogfr拮抗剂(例如纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物)在一段时间内被释放。
[0057]
在另一个实施方案中，载体是由三嵌段共聚物组成的载体，该三嵌段共聚物包含pla(聚-(乳酸))的中央嵌段，两侧是peg-(聚-(乙二醇))的两个嵌段。
[0058]
在又一个实施方案中，载体是白蛋白、白蛋白的衍生物或片段，其维持位于ia和iia结构域之间的界面处的纳洛酮/吗啡结合位点，和/或维持色氨酸(trp)-214周围的纳洛酮结合位点，其结合ogfr拮抗剂，例如纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物，并允许ogfr拮抗剂的缓慢释放。
[0059]
在又一个实施方案中，例如甲基纤维素和惰性凝胶结合ogfr拮抗剂如纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物并允许拮抗剂的缓慢释放。
[0060]
在另外的实施方案中，载体是牛胶原蛋白植入物。ogfr拮抗剂，例如纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物，可以以与infuse(bmp2)或op1(成骨蛋白1或bmp7)-油泥或op1-植入物类似的方式与牛胶原蛋白植入物组合，与牛胶原蛋白海绵、粉状牛胶原蛋白或基于胶原蛋白的明胶结构一起提供。纳洛酮、纳曲酮或其功能性衍生物的施用可以通过例如用无菌盐水重构粉状纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物，然后将ogfr拮抗剂-盐水溶液添加至胶原蛋白植入物来实现；其后可以将植入物局部递送到手术干预部位。
[0061]
在另外的实施方案中，载体由水泥(聚甲基丙烯酸甲酯或“pmma”)或可注射制剂组成。
[0062]
在另一个实施方案中，载体是由pga(聚-(乙醇酸))-plga(聚-(乳酸乙醇酸))球体组成的载体，其可以封装ogfr拮抗剂以提供立即、延迟或持续释放。
[0063]
药物组合物及施用
[0064]
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含一种或多种“药学上可接受的载体”，例如水性载体、缓冲剂、抗氧化剂和/或稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含超过约100mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约10mm至约150mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约20mm至约140mm的ogfr拮
抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约30mm至约130mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约40mm至约120mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约50mm至约110mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约50mm至约110mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，药物组合物在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含超过100mm的ogfr拮抗剂。在一些实施方案中，ogfr拮抗剂在基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液中包含约100mm的纳洛酮、纳曲酮、其功能性衍生物或类似物。
[0065]
在一些实施方案中，酸化的基于盐水的溶液表现出约4.5至约7.4的ph。在一些实施方案中，酸化的基于盐水的溶液表现出约5.5至约7.4的ph。在一些实施方案中，酸化的基于盐水的溶液表现出约6.5至约7.4的ph。
[0066]
在一些实施方案中，稀释剂是基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约1％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约5％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约10％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约15％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约25％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约30％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约35％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约40％体积/体积(v/v)的dmso至约80％v/v的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约40％体积/体积(v/v)的dmso至约70％v/v的dmso。
[0067]
在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约1％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约2％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约3％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约4％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施例中，基于dmso的盐水溶液包含约5％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约6％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约7％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约8％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约9％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约10％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约20％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约30％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约40％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约50％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施例中，基于dmso的盐水溶液包含约60％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施例中，基于dmso的盐水溶液包含约70％体积/体积(v/v)的dmso。在一些实施方案中，基于dmso的盐水溶液包含约80％体积/体积(v/v)的dmso。
[0068]
在一些实施方案中，基于二甲亚砜(dmso)的盐水溶液包括磷酸盐缓冲盐水溶液、硼酸盐缓冲盐水溶液、tris缓冲盐水溶液或碳酸盐缓冲盐水溶液。
[0069]
在一些实施方案中，盐水溶液包含盐和水。在一些实施方案中，盐水溶液的盐包括氯化钠或氯化钾。在一些实施方案中，盐水溶液包含约0.7％w/w的盐至约1.5％w/w的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约0.7％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约0.8％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约0.9％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约1.0％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约1.1％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约1.2％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约1.3％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约1.4％的盐。在一些实施方案中，盐水溶液包含约1.5％的盐。
[0070]
根据施用途径，ogfr拮抗剂可以与合适的载体或媒介物(vehicle)组合或协同施用。术语“药学上可接受的载体”是指通常用于本领域以促进药物组合物的活性剂的储存、施用和/或治愈效果的载体。
[0071]
含水液体载体可包含药学上可接受的添加剂，例如酸化剂、碱化剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、保湿剂、溶剂、悬浮剂和/或增粘剂、等渗剂、润湿剂或其它生物相容性材料。可在美国药典国家处方集(u.s.pharmacopeia national formulary),1857-1859和(1990)中找到按上述类别列出的成分列表。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；环糊精，包括α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂(excipient)，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液、乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及用于药物制剂的其它无毒相容性物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
[0072]
在一些实施方案中，药物组合物包含防腐剂和抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0073]
根据本发明的药物组合物还可包含一种或多种粘结剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。这样的赋形剂是本领域已知的。填充剂的实例包括乳糖一水合物、无水乳糖和各种淀粉；粘结剂的实例包括各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素例如avicel
tm
、ph101微晶纤维素和/或avicel
tm
、ph102微晶纤维素和硅化微晶纤维素例如prosolv smcc
tm
。合适的润滑剂，包括作用于待压缩粉末的流动性的试剂，可包括胶体二氧化硅，例如200(胶体二氧化硅)、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙和硅胶。甜味剂的实例可包括任何天然或人造甜味剂，例如蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜和安赛蜜。调味剂的实例是甘草酸单铵例如magnasweet
tm
(一种含有甘草酸单铵和商标mafco的调味组合物)、泡泡糖调味剂和水果调味剂等。防腐剂的实例包括山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、对羟基苯甲酸的其它酯例如对羟基苯甲酸丁酯、醇例如乙醇或苯甲醇、酚类化合物例如苯酚、或季化合物例如苯扎氯铵。
[0074]
用于治疗性施用的任何药物都可以是无菌的。通过例如通过无菌过滤膜(例如0.2微米膜)过滤容易实现无菌。任何药学上可接受的无菌方法都可以用于本发明的组合物中。
[0075]
考虑到个体患者的临床状况、施用方法、施用日程安排和从业者已知的其它因素，包含ogfr拮抗剂衍生物或其盐的药物组合物将以符合良好医疗实践的方式配制和给药。
[0076]
有多种施用途径可供选择。本发明的药物组合物可以使用医学上可接受的任何施用方式来实施，这意味着产生有效水平的活性成分而不引起临床上不可接受的副作用的任何方式。因此，药物组合物可以通过肠胃外、口服、腹腔内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌肉内、直肠、经颊、鼻内、经脂质体、通过微细胞(minicells)、通过抗体缀合、通过细胞靶向肽、通过吸入、经阴道、眼内、通过由导管或支架局部递送、皮下、脂肪内、关节内或鞘内施用于受试者。
[0077]
施用方式包括口服、直肠、局部、鼻、皮内或肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内或输注。静脉内或肌肉内途径不是特别适合长期治疗和预防。由于对患者的方便性以及给药日程安排，口服施用用于预防性治疗。
[0078]
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格溶液或25固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。较低剂量将由其它形式的施用产生，例如静脉内施用。如果在应用的初始剂量下受试者的反应不充分，则可以在患者耐受允许的范围内使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的递送途径的效力更高的剂量)。考虑每天多次给药以达到化合物的适当全身水平。
[0079]
适用于口服施用的组合物可以以离散单元存在，例如胶囊、片剂或锭剂，每个单元都含有预定量的活性剂。其它组合物包括在水性液体或非水性液体中的悬浮液如糖浆、酏剂或乳液。
[0080]
其它递送系统可以包括时间释放、延迟释放或持续释放递送系统。这样的系统可以避免重复施用本发明的药物组合物，增加受试者和医生的便利性。许多类型的释放递送系统对于本领域普通技术人员来说是可用的并且是已知的。它们包括基于聚合物的系统，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，即：脂质，包括甾醇，例如胆固醇、胆固醇酯，和脂肪酸或中性脂肪，例如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；硅橡胶(sylastic)系统；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压片；部分融合的植入物等。
[0081]
本文的方法和组合物可以以试剂盒的形式提供。“试剂盒”在本文中被定义为一个包装，并且包含几个单独的部分，当它们一起使用时，这些部分显示出互补的效果。在这方面，试剂盒和药物组合物所达到的效果是相似的。试剂盒可以任选地包括使用药物组合物的说明书。
[0082]
本发明通过但决不限于以下实施例进一步举例说明。
[0083]
实施例1—与非肿瘤细胞相比，纳洛酮对肿瘤细胞表现出选择性细胞毒性作用。
[0084]
本实验的目的是确定溶解在含有50％(v/v)dmso的酸化盐水溶液中的纳洛酮相对于可能位于肿瘤附近的其它非肿瘤细胞表型的抗肿瘤生长活性。该实施例的纳洛酮制剂在本文中称为“纳洛酮”。
[0085]
剂量为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm和5mm乳酸脱氢酶(ldh)时纳洛酮治疗对三阴性乳腺癌细胞(bt474)、骨肉瘤细胞(saos2)和乳腺癌细胞(bt20)的影响与非肿瘤细胞乳腺上皮(humec)和正常血管内皮(huvec)细胞进行比较，如图1所示。加入纳洛酮3小时，并在治疗后24小时评估ldh释放。在24小时，相对于正常细胞，在三阴性乳腺癌细胞(bt474)、骨肉瘤细胞(saos2)和乳腺癌细胞(bt20)中观察到ldh显著增加，校正了治疗引起的细胞数变化。如图1所示，在saos2和bt20细胞中观察到ldh值增加到6倍，并且在bt474中观察到细胞中ldh值增加到3倍(*p《0.001)。最高剂量下，在72小时后，saos2细胞中细胞数减少60％，而bt20和90细胞数减少90％。参见图2。
[0086]
如图1所示，与对照非肿瘤细胞、乳腺上皮(humec)或血管内皮(huvec)相比，将三阴性乳腺癌(tnbc)细胞bt474暴露72小时导致代谢活跃细胞的数量以剂量依赖性方式显著减少。这些数据表明，纳洛酮表现出显著的抗肿瘤活性，并且可以提供高达2.5mm剂量的非肿瘤细胞保留效应(sparing effect)。
[0087]
还证明了纳洛酮处理在体外减小了肿瘤尺寸。恶性肿瘤的特点是侵入周围正常组织，并且球体测定法是一种简单的微板方法(基于均匀、自组装的3d肿瘤球体)，通常用于评估肿瘤生长。使用球体测定法评估纳洛酮的抗肿瘤功效，如图3所示。抗肿瘤功效的影响是通过量化形成的球体的尺寸并计算在处理后时间0和120小时之间球体面积分数的百分比变化来确定的，如图3b所示。抗肿瘤功效也通过量化处理后120小时每个球体中细胞面积分数的百分比变化来确定，如通过用结晶紫染色细胞来确定，如图3c所示。图3中描绘的结果表明，纳洛酮以剂量依赖性方式降低了saos2骨肉瘤细胞和bt474 tnbc细胞中肿瘤块的尺寸和肿瘤块的细胞性。
[0088]
因此，本文的结果表明，纳洛酮对肿瘤细胞具有选择性的细胞毒性作用，而保留非肿瘤细胞不受影响。此外，结果表明纳洛酮在体外可以抑制肿瘤细胞的生长。
[0089]
实施例2—本实施例表明，在与生长的肿瘤相邻的胶原蛋白海绵中局部施用约50％dmso在0.9％盐水(50％)中的制剂，有效抑制体内肿瘤生长并增加接种乳腺癌的小鼠的存活率。
[0090]
为了研究这种制剂对体内肿瘤生长的影响，将mda-mb-231三阴性乳腺癌细胞植入雌性ncr裸鼠内。在小鼠中接种mda-mb-231三阴性乳腺癌细胞三周后确认有活跃生长的肿瘤时，将该制剂植入小鼠内。该制剂通过将纳洛酮溶解在含有50％(v/v)dmso/基于胶原蛋白凝胶的载体的酸化盐水溶液中来配制。将该制剂植入8周龄的雌性ncr裸鼠的胫骨中，所述裸鼠具有由植入的mda-mb-231三阴性乳腺癌形成的活跃生长的肿瘤。图4显示了该制剂对植入有mda-mb-231三阴性乳腺癌细胞的小鼠中肿瘤生长的影响。图4a显示了在60天内测量的肿瘤卡尺体积。制剂植入组的肿瘤体积是1/2倍。回归分析发现两个治疗组的斜率显著不同(p《0.001)。图4b显示了使用kaplan-meier统计对存活率的评估。制剂治疗组的存活率是2倍(p《0.0328)。
[0091]
本文引用的所有参考文献均以与单独并入的相同程度通过引用的方式以其整体专门并入。尽管已经举例说明和描述了优选的实施方案，但是应当理解，可以根据本领域的
普通技术对其进行改变和修改，而不偏离本文限定的本发明的更广泛的方面。
[0092]
实施例3—直接将ogfr拮抗剂局部注射到肿瘤中或肿瘤附近抑制人类患者的肿瘤生长。
[0093]
该实施例表明，将ogfr拮抗剂直接递送到肿瘤中或肿瘤附近可抑制患有癌症的人类患者中的肿瘤生长。
[0094]
将ogfr拮抗剂施用于患有癌症例如乳腺癌、肝癌、肺癌、皮肤癌、脑癌或前列腺癌的人类患者。ogfr拮抗剂作为如本文所述的纳洛酮、二甲硫醚、盐水、药学上可接受的赋形剂和基于水凝胶的载体的药物制剂施用。药物制剂的体积在0.25立方厘米(cc)和10cc之间；或肿瘤体积的10％到150％之间。ogfr拮抗剂纳洛酮的剂量为2毫克(mg)/cc载体至约8mg/cc载体。特别地，ogfr拮抗剂纳洛酮的剂量为2mg/cc载体、4mg/cc载体，或其为8mg/cc载体。载体的体积和ogfr拮抗剂的量将根据癌症类型和递送方式而变化，如以下所举例说明。
[0095]
对于一些患者，含有ogfr拮抗剂的药物制剂适用于注射。可注射的ogfr拮抗剂组合物直接注射到实体原发性或转移性肿瘤中。对于一些患有肺癌的患者，含有ogfr拮抗剂的药物制剂适用于吸入，并且含有ogfr拮抗剂的药物制剂通过吸入递送。
[0096]
在肝脏患者中，通过使用透视引导注射将含有ogfr拮抗剂的药物制剂注射到患有肝癌的患者的肝脏的脏腑和深层组织中。或者，为了治疗患有肝癌的患者，含有ogfr拮抗剂的药物制剂经由导管通过局部灌注递送至肿瘤。此外，切除肝脏肿瘤并将含有ogfr拮抗剂的药物制剂递送到肿瘤部位的相邻组织床中以控制肿瘤复发。
[0097]
含有ogfr拮抗剂的药物制剂也用于治疗肺癌。将含有ogfr拮抗剂的药物制剂注射到患有肺癌的患者的肺的脏腑和深层组织中。因此，在患有肺癌的患者中，在肿瘤切除或肺叶切除术期间，将含有ogfr拮抗剂的药物制剂直接注射到肿瘤内或肿瘤附近。含有ogfr拮抗剂的药物制剂在某些情况下适于吸入并通过吸入递送给患有肺癌的患者。
[0098]
在患有脑肿瘤的患者中，在肿瘤切除期间注射含有ogfr拮抗剂的药物制剂，或者在肿瘤切除之前或之后通过端口或导管施用含有ogfr拮抗剂的药物制剂。
[0099]
含有ogfr拮抗剂的药物制剂也用于治疗皮肤癌。将含有ogfr拮抗剂的药物制剂注射到皮肤肿瘤内或皮肤肿瘤附近，以治疗患有皮肤癌的患者。在肿瘤是位于皮肤上的皮肤肿瘤的患者中，通过刮除肿瘤或切除肿瘤来治疗皮肤肿瘤，然后通过不包括注射的常规方式(即手动放置和或手动填充到切除术中)局部递送含有ogfr拮抗剂的药物制剂。在诸如黑色素瘤或鳞状细胞癌或基底细胞癌的皮肤肿瘤的切口活检或部分切除期间，将含有ogfr拮抗剂的药物制剂注射到切除空间和/或肿瘤附近。对于治疗皮肤癌，含有ogfr拮抗剂的药物组合物的体积为0.25cc-2.5cc或肿瘤体积的10％-150％。ogfr拮抗剂纳洛酮的剂量为2毫克(mg)/cc载体至约8mg/cc载体。对于一名患有皮肤癌的患者，ogfr拮抗剂纳洛酮的相应剂量为2mg/cc载体。在另一名皮肤癌患者中，ogfr拮抗剂纳洛酮的相应剂量为4mg/cc载体。在另一名皮肤癌患者中，ogfr拮抗剂纳洛酮的相应剂量为8mg/cc载体。
[0100]
为了治疗乳腺肿瘤，将含有ogfr拮抗剂的药物制剂在导丝定位或针定位过程(即立体定向导丝定位)期间直接递送到乳腺肿瘤中，其中使用乳房x光照片或超声波引导细空心针到达肿瘤。在该过程中，取出一些乳房组织进行活检，然后将含有优选制剂的第二根针注射到肿瘤块中并靠近肿瘤块。对于治疗乳腺癌，含有ogfr拮抗剂的药物组合物的体积为
1cc-10cc或肿瘤体积的10％-150％。ogfr拮抗剂纳洛酮的剂量为2毫克(mg)/cc载体至约8mg/cc载体。对于一名患有乳腺癌的患者，ogfr拮抗剂纳洛酮的相应剂量为2mg/cc载体。在另一名乳腺癌患者中，ogfr拮抗剂纳洛酮的相应剂量为4mg/cc载体。在另一名皮肤癌患者中，ogfr拮抗剂纳洛酮的相应剂量为8mg/cc载体。