糖化血红蛋白测量
1.相关申请的交叉引用本技术要求2020年6月17日提交的美国临时专利申请号63/040,159和2019年7月22日提交的美国临时专利申请号62/877,188的权益，所述临时申请各自的全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
2.本文描述了用于测量糖化血红蛋白的设备、系统和方法。
技术实现要素：
3.本文总体上描述了用于血红蛋白测量、特别是糖化血红蛋白的测量的设备、系统和方法。确定患者样本中糖化血红蛋白的水平是i型和ii型糖尿病以及妊娠糖尿病的诊断中的一个关键组成部分，因为它可估计个体在一段时间(例如，三个月)内的平均血糖水平。
4.在一些实施方案中，这种糖化血红蛋白测量可以是全血测量。全血可以是人或动物全血。然而，只要存在血红蛋白组分，就也可对血液的各种组分进行测量。
5.通常，可使用显微玻片测试元件或简单地显微玻片如干式玻片测试元件进行测量。这些显微玻片可用于自动化分析仪中。显微玻片可以是单玻片，从而使用一滴或多滴样本和单个玻片而不是多个玻片来完成整个分析。在一些实施方案中，可在单个玻片上进行多个测量。
6.本文所述的显微玻片可包括膜层的堆叠，所述堆叠从下到上包含第一膜层、第二膜层和第三膜层，所述第一膜层包含交联的凝胶，其中所述交联的凝胶包含检测剂、果糖基氧化酶和过氧化物酶，所述第二膜层包含第一凝胶，所述第三膜层包含裂解剂、变性剂和蛋白酶。在一些实施方案中，第一膜层为凝胶层，第二膜层为掩蔽层，第三膜层为铺展层。在一些实施方案中，显微玻片可在掩蔽层和铺展层之间包括粘附层或子层。
7.本文所述的显微玻片可包括膜层的堆叠，所述堆叠从下到上包含第一膜层、第二膜层和第三膜层，所述第一膜层包含交联的凝胶，其中所述交联的凝胶包含检测剂、果糖基氧化酶、防干扰剂和过氧化物酶，所述第二膜层包含第一凝胶，所述第三膜层包含裂解剂、变性剂和蛋白酶。在一些实施方案中，第一膜层为凝胶层，第二膜层为掩蔽层，第三膜层为铺展层。在一些实施方案中，显微玻片可在掩蔽层和铺展层之间包括粘附层或子层。
8.本文所述的显微玻片可包括膜层的堆叠，所述堆叠从下到上包含凝胶层、掩蔽层和铺展层。在其他实施方案中，本文所述的显微玻片可包括膜层的堆叠，所述堆叠从下到上包含凝胶层、掩蔽层、粘附层或子层、和铺展层。在一些实施方案中，第一层或凝胶层包含凝胶。在一些实施方案中，第二膜层即掩蔽层包含第二凝胶。在一些实施方案中，第三膜层即铺展层包含裂解剂、变性剂和蛋白酶。在一些实施方案中，包括粘附层或子层作为第三层，且铺展层为第四层。
9.在一些实施方案中，凝胶可为交联的凝胶。显微玻片中可包括其他的层。在一些实施方案中，交联的凝胶包含检测剂、果糖基氧化酶和过氧化物酶。
10.第一膜层还可包含氧化酶辅因子和表面活性剂。在一些实施方案中，氧化酶辅因子为黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。果糖基氧化酶可对fru-α-valhis肽或糖化氨基酸如fru-α-val具有特异性。在一些实施方案中，防干扰剂为抗坏血酸氧化酶(aao)。
11.在一些实施方案中，检测剂为隐色染料，如蓝色隐色染料。检测剂可选自n-羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲基氨基)-二苯胺钠(da-64)、n,n,n'n',n'',n''-六(3-磺基丙基)-4,4',4''-三氨基-三苯基甲烷六钠盐(tpm-ps)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)-吩噻嗪钠(da-67)和2-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯酚)-4,5-双-(4-二甲基氨基苯基)咪唑。
12.在一些实施方案中，过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
13.在一些实施方案中，第二膜层还包含反射材料部分。反射材料部分可包含金属盐。在一个实施方案中，所述金属为钛，如但不限于二氧化钛(tio2)。
14.在一些实施方案中，第三膜层还包含钙。
15.在一些实施方案中，第三膜层包含含有胶乳颗粒的多孔层。在一些实施方案中，胶乳颗粒可由乙烯基甲苯-共-甲基丙烯酸共聚物(vte)形成。所述颗粒，或有时被称为珠粒，可具有约25
µ
m的中值粒度。在一个实施方案中，所述颗粒可具有小于25
µ
m的中值粒度。在其他实施方案中，所述颗粒可具有约10
µ
m至约40
µ
m、约15
µ
m至约35
µ
m、约20
µ
m至约30
µ
m、小于约15
µ
m、小于约10
µ
m、或小于约5
µ
m的中值粒度。
16.在一些实施方案中，裂解剂为洗涤剂。所述洗涤剂可选自辛基酚乙氧基化物(triton
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x-100，union carbide corporation(纽约))、tween
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(ici americas inc.(特拉华州)) (tween 20)、十二烷基硫酸钠(sds)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、十四烷基三甲基溴化铵(ttab)、聚氧乙烯月桂基醚(poe)和nonidet
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(air products and chemicals, inc.(特拉华州)) p-40 (np-40)。在一个实施方案中，洗涤剂为triton x-100。
17.在一些实施方案中，变性剂为氧化剂或表面活性剂。变性剂可为亚硝酸钠或n-月桂酰肌氨酸(nls)中的一种或多种。
18.在一些实施方案中，蛋白酶为金属蛋白酶和/或中性蛋白酶。蛋白酶可为内切蛋白酶或外切蛋白酶。在其他实施方案中，蛋白酶选自蛋白酶k、链霉蛋白酶e、蛋白酶xvii、蛋白酶xxi、氨基肽酶、羧基肽酶、嗜热菌蛋白酶、bacillolysin (一种微生物金属蛋白酶)、肽酶k、蛋白内切酶k、糜蛋白酶、糜蛋白酶c、谷氨酰内肽酶、肽基-lys-金属内肽酶、来自芽孢杆菌属的蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶和枯草杆菌蛋白酶。
19.在一些实施方案中，第三膜层与第二膜层的上表面直接接触。在其他实施方案中，第二膜层与第一膜层的上表面直接接触。
20.在一些实施方案中，铺展层与掩蔽层的上表面直接接触。在其他实施方案中，铺展层与粘附层的上表面直接接触。
21.本文还描述了用于检测血红蛋白和糖化血红蛋白的单玻片方法。这些方法包括a)提供如本文所述的显微玻片；b)使显微玻片的第三膜层与包含红细胞的未经处理的血液样本接触，其中裂解剂从红细胞释放糖化血红蛋白，其中变性剂与糖化血红蛋白接触以使糖化血红蛋白变性，并且其中蛋白酶从变性的糖化血红蛋白释放果糖基肽，其中果糖基肽到达第一膜层并与果糖基氧化酶和fad辅因子反应生成过氧化物，并且其中过氧化物酶和过
氧化物与检测剂反应以释放可检测信号；c)从血液样本测量血红蛋白的量，其中测量血红蛋白的量包括在第一波长的光下测量来自所述玻片的样本反射密度；和d)从血液样本测量糖化血红蛋白的量，其中测量糖化血红蛋白的量包括在第二波长的光下测量来自检测剂的反射密度，其中第二波长的光不同于第一波长的光。在一些实施方案中，检测剂为氧化染料。
22.在一些实施方案中，未经处理的血液样本可为未裂解的血液样本。在一些实施方案中，未经处理的血液样本可为已经受防凝剂处理但未经受裂解剂处理的血液。在一些实施方案中，防凝剂为抗凝血剂。在一些实施方案中，未经处理的血液可为全血。
23.在一些实施方案中，第一波长的光为540nm而第二波长的光为670nm。
24.在一些实施方案中，方法还包括使果糖基肽与氧化酶辅因子如黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)接触。
25.本文还描述了用于直接检测糖化血红蛋白的单玻片方法。这些方法包括a)提供其中第二膜层包含反射材料部分的显微玻片；b)使玻片的第三膜层与包含未经处理的红细胞的血液样本接触，其中裂解剂从红细胞释放糖化血红蛋白，其中变性剂与糖化血红蛋白接触以使糖化血红蛋白变性，并且其中蛋白酶从变性的糖化血红蛋白释放果糖基肽，其中果糖基肽穿过第二膜层，其中果糖基肽到达第一膜层并与果糖基氧化酶和fad辅因子反应生成过氧化物，并且其中过氧化物酶和过氧化物与检测剂反应以释放可检测信号；和c)从血液样本测量糖化血红蛋白的量，其中测量糖化血红蛋白的量包括测量血液样本中氧化染料的反射密度。
26.在一些实施方案中，反射材料部分包含金属盐。
27.由于第三膜层中胶乳颗粒产生的多孔性，全血样本可穿过该层。
附图说明
28.图1示意了结合到如本文所述的显微玻片中的层。
29.图2示意了在其掩蔽层中包含tio2的玻片和在其掩蔽层中没有tio2的玻片的比较。
30.图3a和3b示意了不含tio2的掩蔽层(“对照”)和含tio2的掩蔽层的540nm信号。
31.图4a和4b示意了不含tio2的掩蔽层(“对照”)和含tio2的掩蔽层的670nm信号。
32.图5示意了对于其掩蔽层中不含tio2的玻片，在存在增加的血红蛋白(hb)浓度的情况下fru-vh底物的剂量响应。
33.图6示意了对于其掩蔽层中含有tio2的玻片，在存在增加的血红蛋白(hb)浓度的情况下fru-vh底物的剂量响应。
34.图7a-7d示意了在37℃下在分析仪上，在5分钟时间段内在670nm处%a1c模型流体和%a1c患者样本的动力学数据。蛋白酶和亚硝酸钠在成品显微玻片上通过喷墨沉积并干燥。
35.图8a和8b示意了在37℃下在分析仪上，在5分钟时间段内在670nm处%a1c模型流体和%a1c患者样本的动力学数据。所有组分均通过x-料斗涂覆工艺并入。
36.图9示意了在37℃下在分析仪上，在5分钟时间段内在670nm处%a1c模型流体和%a1c患者样本的反射密度剂量响应数据。所有组分均通过x-料斗涂覆工艺并入。
37.图10示意了显微玻片%a1c与biorad variant hplc %a1c的相关图。
38.图11示意了显微玻片血红蛋白组分患者样本剂量响应。
39.图12示意了显微玻片血红蛋白组分测定与microtip参考血红蛋白组分测定的相关图。
40.图13示意了显微玻片hba1c组分患者样本剂量响应。
41.图14示意了显微玻片hba1c组分测定与microtip参考hba1c组分测定的相关图。
42.图15示意了显微玻片的推导的%a1c测定与hplc参考%a1c测定的相关图。
43.图16示意了双重测定显微玻片测试元件的hba1c酶促670nm剂量响应图。
44.图17示意了双重测定显微玻片测试元件的血红蛋白光谱540nm剂量响应图。
具体实施方式
45.描述了使用患者样本，通过直接手段(仅%a1c测量)或通过推导计算(hba1c和血红蛋白测量以得出%a1c结果)，用薄膜测试元件——显微玻片来进行酶促级联以测量糖化血红蛋白浓度。在一些实施方案中，患者样本为全血样本如未经处理的全血样本。在一些实施方案中，未经处理的血液样本可为未裂解的血液样本。在一些实施方案中，未经处理的血液样本可为已经受防凝剂处理但未经受裂解剂处理的血液。在一些实施方案中，防凝剂为抗凝血剂。在一些实施方案中，未经处理的血液可为全血。
46.血液样本可为人或动物血液。在一些实施方案中，血液可为哺乳动物血液。哺乳动物可包括但不限于人、马、骆驼、狗、猫、牛、熊、啮齿动物、绵羊、山羊、猪等。也可使用其他动物血液如爬行动物、鱼和鸟的血液。
47.在一些实施方案中，只要存在血红蛋白组分，就也可对患者血液样本的各种组分或部分进行测量。
48.所述测量使用如本文所述的设备、系统和方法完成。通常，可使用显微玻片如干式显微玻片进行测量。显微玻片可以是单玻片，从而使用一滴样本和单个玻片而不是多个玻片来完成整个分析。
49.本文所述的显微玻片可在自动化分析仪系统或其他类型的主机分析仪中采用。在一些实施方案中，这些类型的仪器可在每个工作日处理数百或甚至数千个样本分析。在一个实施方案中，显微玻片可用于当前的vitros主机分析仪(5,1 fs、4600化学系统、5600集成系统)以及未来的vitros分析仪上。另外，本文所述的显微玻片可用于abbott laboratories、beckman coulter、baxter、genprobe、roche diagnostics和siemens制造的系统中。
50.然而，在其他实施方案中，显微玻片可在非自动化或半自动化系统中采用。在一些实施方案中，显微玻片可以逐个样本的场景使用和/或手工装载。
51.在一些实施方案中，本文所述的显微玻片测试元件可结合酶促级联的组分。这种酶促级联可导致生成与患者样本中的糖化血红蛋白浓度(作为%a1c)直接相关的比色信号。
52.行业中通常通过测量血红蛋白(hb)浓度和糖化血红蛋白(hba1c)浓度两者并将其表示为比率(推导的%a1c)，来确定血红蛋白糖化水平。这需要两组校准物来产生用于确定hb和hba1c的单独的校准曲线。或者，也可使用已知%a1c的流体作为校准物来校准该测定，以便直接提供未知患者样本的%a1c。
53.本文所述的设备、系统和方法可使用可以任一测定形式利用的显微玻片。在一个
实施方案中，可将测定hb浓度和hba1c浓度所需的所有组分并入单个测试元件中，以得到推导的%a1c结果。在这样的实施方案中，hb和hba1c可各自在不同的检测波长下从单个玻片测定，该测试可从单个全血计量事件进行，并可使用当前的显微玻片方案进行。
54.在另一个实施方案中，第二种选择是使用单独的显微玻片来分别单独地测量hb浓度和hba1c浓度以得到推导的%a1c结果。在这样的实施方案中，hb和hba1c浓度可各自在不同的检测波长下从单个测试元件中的单独的测试玻片测定，该测试可从两个全血计量事件进行，并可使用当前的显微玻片方案进行。
55.还此外，在另一个实施方案中，可使用单个显微玻片来直接测量%a1c。在这样的实施方案中，%a1c可在单个检测波长下从单个显微玻片测定。该测量可从单个全血计量事件进行，并可使用当前的显微玻片方案进行。
56.在一些实施方案中，所述设备、系统和方法可使用酶促级联，以%a1c的形式测定hba1c。在本文所述的显微玻片中采用的酶促级联为：在一些实施方案中，可使用该级联来直接测定糖化血红蛋白(作为%a1c)。然而，也可在测量推导的%a1c时使用该级联。
57.通常，或直接或推导地测定%a1c的方法包括向如本文所述的显微玻片施加未经处理的全血样本的步骤。在一些实施方案中，显微玻片可包括两个或更多个样本位置并可能需要超过一个血液样本。
58.裂解表面活性剂可裂解血液样本中的红细胞，从而释放糖化血红蛋白。第二表面活性剂可使糖化血红蛋白变性，从而提供达到蛋白水解切割位点的途径。然后，蛋白酶切割血红蛋白β链的n-端部分，从而释放糖化二肽(果糖基-α-缬氨酰-组氨酸-fru-α-valhis)。然后，糖化二肽在利用果糖基肽氧化酶(fpox)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的氧化酶反应中去糖化，从而产生过氧化氢(h2o2)。h2o2和辣根过氧化物酶(hrp)氧化隐色染料，从而在670nm处产生比色信号。糖化血红蛋白的浓度与所形成的染料的反射密度成正比。在一些实施方案中，可在540nm处读取血红蛋白的信号，并可利用540nm处的血红蛋白组分测定值和670nm处的糖化血红蛋白测定值来确定推导的%a1c值。
59.在一些实施方案中，显微玻片可包括至少第一膜层、第二膜层和第三膜层。显微玻片可包含更多的层。在一些实施方案中，第一膜层可包含交联的明胶或凝胶，其中所述交联的凝胶包含检测剂、果糖基氧化酶、过氧化物酶和任选地防干扰剂。在一些实施方案中，第二膜层可包含明胶、凝胶或交联的凝胶或明胶。在一些实施方案中，第三膜层可包含裂解剂、变性剂和/或蛋白酶。
60.显微玻片100可包括膜层的堆叠或简单地层的堆叠。如图1中所示意，膜层的堆叠可包括凝胶层102、掩蔽层104、粘附层106和铺展层108。在一些实施方案中，显微玻片100可包括上部玻片安装件110、下部玻片安装件112或两者。在一些实施方案中，当形成时，这些
层可构建在支撑层114上。在一些实施方案中，粘附层106、掩蔽层104和凝胶层102可组合为试剂层。
61.在一些实施方案中，支撑层114可由聚对苯二甲酸乙二醇酯或其他适宜的透明聚合物材料形成。此透明聚合物材料允许在其上施加或涂覆层。
62.在一些实施方案中，上部玻片安装件110和下部玻片安装件112由聚苯乙烯或其他适宜的聚合物材料形成。
63.每个层和安装件可组合形成上表面116和下表面118为正方形或大体矩形的显微玻片。在一些实施方案中，上表面116和下表面118可具有其他形状，如但不限于三角形、五边形、六边形、七边形、八边形、圆形、卵形、椭圆形或其他由直线组成的或圆形的形状。
64.在一些实施方案中，显微玻片可包含至少一个凹槽或粘固表面(keying surface)。凹槽或粘固表面可用于帮助堆叠多个显微玻片和/或将一个或多个显微玻片装载到分析仪器中。在一个实施方案中，显微玻片100可包含凹槽120。凹槽120示出为具有由直线组成的形状，但在其他实施方案中，凹槽120实际上可以是允许堆叠和/或装载的任何形状。
65.此外，显微玻片100可包含在上表面116和/或下表面118上的窗口部分122。窗口部分122可被框架部分124包围。然而，在一些实施方案中，不包括框架部分，并且窗口部分122可延伸到显微玻片的边缘。
66.显微玻片100还可在上表面116上的窗口部分122内包括样本区126。样本区126可充当施加样本的位置。在下表面118上，窗口部分122内可存在检测区128。检测区128可充当使用分析仪进行检测的位置。
67.这里，将随着样本行进通过显微玻片层来描述这些层。铺展层108可为样本与之交互的第一层。铺展层108可包含聚合物珠粒、粘结剂、缓冲剂、至少一种表面活性剂、二价阳离子盐、亚硝酸钠、蛋白酶、醇和水。
68.在一些实施方案中，二价阳离子盐可为氯化钙或任何可与edta结合的化合物。
69.在一些实施方案中，在形成或施加铺展层时，可存在叔丁醇。然而，在干燥后叔丁醇并不存在。
70.在一些实施方案中，聚合物珠粒可包括丙烯酸珠粒，如但不限于乙烯基甲苯-共-甲基丙烯酸共聚物珠粒(vte珠粒)。珠粒的功能可以是在铺展层中产生允许红细胞进入涂层的孔隙。珠粒还可起到提供白色反射表面、促进样本均匀铺展和捕获干扰物如血红素副产物、过氧化氢酶、甘油三酯等的作用。
71.珠粒可具有足够大的平均直径以便红细胞穿透到涂层中。在一些实施方案中，所述直径大于约5
µ
m、大于约10
µ
m、大于约50
µ
m、大于约80
µ
m、在约20
µ
m至约100
µ
m之间、在约20
µ
m至约30
µ
m之间、在约10
µ
m至约40
µ
m之间、在约10
µ
m至约100
µ
m之间、在约20
µ
m至约25
µ
m之间、在约50
µ
m至约100
µ
m之间、在约25
µ
m至约30
µ
m之间、小于约100
µ
m、小于约80
µ
m、小于约50
µ
m、小于约40
µ
m、或小于约30
µ
m。
72.由珠粒产生的孔隙可具有大于约5
µ
m、大于约10
µ
m、大于约20
µ
m、在约20
µ
m至约30
µ
m之间、在约10
µ
m至约40
µ
m之间、在约20
µ
m至约25
µ
m之间、在约25
µ
m至约30
µ
m之间、小于约50
µ
m、小于约40
µ
m、或小于约30
µ
m的孔隙尺寸。在一个实施方案中，孔隙尺寸为约25
µ
m。
73.可用于促进层内聚的粘结剂可为胶乳。在一个实施方案中，胶乳在最终产品中的
单体分子量(mwm)胶乳的固体百分数可为约30%。在一些实施方案中，胶乳包含杀生物剂如但不限于nipacide。在其他实施方案中，可采用替代的粘结剂如但不限于聚丙烯酰胺(i100)。
74.缓冲剂用于将该层保持在所需的ph下。所需的ph可为约6.0至约7.0、约6.2至约7.2、约6.5至约7.5、约6.0至约8.0、约7.0至约8.0、约6.8至约7.2、约7.4、约7.2、约7.0或约6.8。根据需要，缓冲剂可以是酸或碱。在一个实施方案中，缓冲剂为3-(n-吗啉基)丙磺酸(mops)。其他缓冲剂可包括但不限于碳酸氢钠、碳酸钙、磷酸钾、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、bicine、bis-tris、tes、hepps (epps)等或其组合。
75.一些实施方案可包括第一表面活性剂和第二表面活性剂。第一表面活性剂可以是裂解剂。裂解剂可裂解红细胞并释放血红蛋白和糖化血红蛋白。裂解剂可以是洗涤剂。
76.在一些实施方案中，洗涤剂可选自辛基酚乙氧基化物(triton x-100)、tween (tween 20)、十二烷基硫酸钠(sds)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、十四烷基三甲基溴化铵(ttab)、聚氧乙烯月桂基醚(poe)、nonidet p-40 (np-40)或其组合。在一个实施方案中，洗涤剂为辛基酚乙氧基化物如triton x-100。
77.在一些实施方案中，第二表面活性剂可以是使血红蛋白变性的变性剂。该变性剂可使血红蛋白上的位点暴露出来以进行蛋白质水解。变性剂可使血红素以单一氧化态氧化并有助于血红蛋白形式(氧合、脱氧、羧基)转化为单一光谱形式。
78.在一个实施方案中，变性剂可包括n-月桂酰肌氨酸(nls)。在一些实施方案中，第二表面活性剂还可包括变性助剂或氧化剂如亚硝酸钠。变性助剂可通过与血红素中的铁配位来帮助促进通过nls的变性。
79.在一个实施方案中，存在于涂层中的变性剂(一种或多种)可使糖化血红蛋白变性，从而提供对目标蛋白酶切割位点的可及性。
80.在一些实施方案中，铺展层108可根据需要包含其他表面活性剂以引发酶促级联。
81.亚硝酸钠可以摩尔过量存在。在一些实施方案中，亚硝酸钠(nano2)可以总血红蛋白浓度的约5-10倍存在。在一些实施方案中，亚硝酸钠可起到将血红素氧化成三价铁状态(+3)的作用。
82.此外，变性表面活性剂、亚硝酸钠和血红蛋白的组合可产生血红蛋白的单一光谱形式，其可在540nm处读取。
83.蛋白酶可为中性蛋白酶。蛋白酶可为金属蛋白酶。蛋白酶可为内切蛋白酶或外切蛋白酶。蛋白酶可通过从血红蛋白β亚基或链的n-端切割而生成fru-α-valhis。fru-α-valhis可以是本文所述凝胶层中包含的果糖基氧化酶的底物。
84.在一些实施方案中，蛋白酶可为蛋白酶k、链霉蛋白酶e、蛋白酶xvii、蛋白酶xxi、氨基肽酶、羧基肽酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或其组合。
85.fru-α-valhis二肽可具有足够小的分子量以便其可容易地穿过粘附层和掩蔽层并进入本文所述的凝胶层中。
86.钙组分对于蛋白酶活性可能是必需的。在一些实施方案中，显微玻片中的钙可保护蛋白酶免受采血管中edta抗凝血剂的影响。在一些实施方案中，钙源为氯化钙(cacl2)。在其他实施方案中，氯化钙为二水合氯化钙。
87.存在于铺展层中的氯化钙可起到保护蛋白酶活性的作用。在一些情况下，hba1c测
量的临床环境中的采血管为edta血浆管。在没有氯化钙的情况下，edta可能会与来自蛋白酶的钙和锌结合，从而大大降低其蛋白质水解活性。
88.铺展层溶剂可为甲醇、乙醇、叔丁醇等或其组合。在一个实施方案中，醇为约97%重量/重量的叔丁醇。
89.粘附层106在铺展层108紧下方，可包含粘附物质、表面活性剂和/或溶剂。在铺展层中产生的fru-α-valhis二肽可容易地穿过粘附层106。
90.在一些实施方案中，粘附物质可起到促进铺展层108与掩蔽层104之间的粘附的作用。在一个实施方案中，粘附物质为聚异丙基丙烯酰胺(l100)。在其他实施方案中，粘附物质可为聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)。在一些实施方案中，pvp可具有k90链长、k30链长、k15链长或其组合。
91.粘附层表面活性剂可充当涂覆助剂。在一些实施方案中，粘附层表面活性剂为辛基酚乙氧基化物如triton x-100。在一些实施方案中，粘附物质可为聚异丙基丙烯酰胺与辛基酚乙氧基化物的组合。
92.粘附层106中的溶剂可为乙醇、异丙醇、甲醇、叔丁醇、丙酮或其组合。在一个实施方案中，粘附层溶剂可为丙酮。在一些实施方案中，当使用乙醇时，可能不需要表面活性剂。
93.掩蔽层104可包含凝胶、至少一种缓冲剂、颜料物质、分散剂、表面活性剂、硬化剂和/或溶剂/稀释剂。在一些实施方案中，凝胶为明胶和/或硬化的凝胶。
94.凝胶可促进层内聚，促进再润湿时的毛细作用力，和/或提供尺寸排阻机制。在一些实施方案中，尺寸排阻机制可排除高分子量干扰物(在交联/硬化时)。
95.在一些实施方案中，凝胶为硬化的凝胶。在一个实施方案中，凝胶为gel-rc rousselot dub pig dia type 56或275 bloom type a nf猪皮明胶。
96.在一些实施方案中，颜料物质可在掩蔽层内产生反射部分。颜料物质可提供白色反射表面并起到捕获或掩蔽干扰物如血红素副产物、过氧化氢酶和甘油三酯的作用。在一些实施方案中，颜料物质可包括金属物质或金属。在一些实施方案中，金属为钛，如但不限于二氧化钛(tio2)。二氧化钛可以是具有高白度和蓝色调的锐钛矿二氧化钛颜料。在一些实施方案中，颜料物质为hombitan lc-s、huntsman tio2或kemiera 300。在其他实施方案中，二氧化钛可呈其他结晶形式如但不限于金红石、板钛矿、akaogiite及其组合或者与锐钛矿的组合。
97.在一些实施方案中，二氧化钛和硬化的凝胶可一起作用而产生筛，在这里，小分子量物种(如fru-α-valhis)可容易地穿过该层，而较大分子量的蛋白质(血红蛋白、过氧化氢酶、蛋白酶)被排除在外。在一个实施方案中，产生了允许fru-α-valhis穿过的筛。
98.在一些实施方案中，对较大分子量蛋白质的这种排除可以是掩蔽层的基本特征，因为血红蛋白可在670nm处的hba1c测量中产生光学干扰，过氧化氢酶可消耗染料氧化所需的过氧化物，和/或蛋白酶可消化凝胶层中存在的配准酶(果糖基肽氧化酶、辣根过氧化物酶)。
99.在一些实施方案中，二氧化钛可提供均匀的反射表面，该反射表面用于将来自分析仪光源的光反射到检测器以进行信号定量。分析仪光源可为发光二极管(led)或其他可提供本文所述波长下的光的光源。在光接触或以其他方式与样本相互作用后，可使用传感器(一个或多个)来读取一个或多个波长的光的量。传感器可为光电倍增管、接触图像传感
器、图像捕捉传感器矩阵或其组合。
100.缓冲掩蔽层可用于将掩蔽层保持在所需的ph下。所需的ph可为约6.0至约7.0、约6.2至约7.2、约6.5至约7.5、约6.0至约8.0、约7.0至约8.0、约6.8至约7.2、约7.4、约7.2、约7.0或约6.8。
101.在一个实施方案中，至少一种掩蔽层缓冲剂可包含第一缓冲剂和第二缓冲剂，其中每种缓冲剂可根据需要为酸盐或碱盐。在一个实施方案中，第一缓冲剂为3-(n-吗啉基)丙磺酸(mops)。在一个实施方案中，第二缓冲剂为β,β-二羟基-1,4-哌嗪二丙烷磺酸二钠盐(popso)。
102.分散剂可为聚甲基丙烯酸钠。该试剂可有效于快速分散颜料。在一个实施方案中，分散剂为daxad 30s。
103.掩蔽层表面活性剂可充当涂覆助剂。掩蔽层表面活性剂可为阴离子表面活性剂如聚醚磺酸盐。在一个实施方案中，掩蔽层表面活性剂为triton x200e。
104.硬化剂可用于交联凝胶层中的凝胶和/或促进层内聚。在一些实施方案中，硬化剂为双(乙烯基磺酰甲基) (bvsm)。
105.在一些实施方案中，掩蔽层溶剂/稀释剂为水。
106.掩蔽层104可分开玻片的功能区。例如，掩蔽层104可将铺展层108与凝胶层102分开。这可将铺展层中发生的红细胞裂解、血红蛋白变性/消化和fru-α-valhis二肽释放与凝胶层102中发生的fru-α-valhis二肽去糖化和hrp/染料反应以产生比色信号分开。
107.在一些实施方案中，不存在掩蔽层。例如，当形成需要在540nm处测量hb的玻片时，不存在二氧化钛，因为它会阻碍读取血红蛋白的能力。
108.然而，在需要在540nm处测量hb的其他实施方案中，掩蔽层104仍然可包含二氧化钛。在一些实施方案中，可在凝胶层中对fru-α-valhis在670nm处产生反射信号，并且可在掩蔽层上方对未穿过掩蔽层的hb在540nm处产生反射信号。在这样的实施方案中，测量两个单独的反射信号，一个从上方于540nm处测量hb，一个从下方于670nm处测量fru-α-valhis。可使用这些值来确定推导的%hba1c。
109.凝胶层102可包含凝胶、缓冲剂、至少一种表面活性剂、成色剂溶剂、还原剂、检测剂、辅因子、增幅物质或催化剂、氧化酶、硬化剂和溶剂/稀释剂。
110.在一些实施方案中，凝胶层凝胶为凝胶或明胶。凝胶可促进层内聚，促进再润湿时的毛细作用力，和/或提供尺寸排阻机制。在一些实施方案中，尺寸排阻机制可排除高分子量干扰物(在交联/硬化时)。在一些实施方案中，凝胶为交联的凝胶。交联可改善层的完整性，并减小孔隙尺寸以过滤掉额外的干扰物质。
111.在一个实施方案中，凝胶为gel-32 tcgiii di明胶。凝胶可以是多孔的。
112.在一些实施方案中，凝胶可充当尺寸排阻机制。
113.凝胶层缓冲剂可用于将该层保持在所需的ph下。所需的ph可为约6.0至约7.0、约6.2至约7.2、约6.5至约7.5、约6.0至约8.0、约7.0至约8.0、约6.8至约7.2、约7.4、约7.2、约7.0或约6.8。根据需要，缓冲剂可以是酸或碱。在一个实施方案中，缓冲剂为3-(n-吗啉基)丙磺酸(mops)。
114.凝胶层102可包含一种或多种表面活性剂。第一表面活性剂可充当涂覆助剂。在一些实施方案中，凝胶层的第一表面活性剂为辛基酚乙氧基化物如triton x-100。
115.第二表面活性剂可用于染料的分散。在一个实施方案中，第二表面活性剂为烷基化萘磺酸钠如alkanol xc。
116.染料层成色剂溶剂可为2,4-二正戊基苯酚(ks-52)和/或2,4-二叔戊基苯酚(ks-41)。
117.可添加还原剂以防止虚假染料氧化。在一个实施方案中，还原剂可为5,5-二甲基-1,3-环己二酮(dimedone)。
118.检测剂可为染料。检测剂可用于生成比色信号。几乎可使用任何提供可检测信号的染料。染料可为n-羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲基氨基)-二苯胺钠(da-64)、n,n,n'n',n'',n''-六(3-磺基丙基)-4,4',4''-三氨基-三苯基甲烷六钠盐(tpm-ps)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)-吩噻嗪钠(da-67)、2-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯酚)-4,5-双-(4-二甲基氨基苯基)咪唑或其组合。在一个实施方案中，染料为2-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯酚)-4,5-双(4-二甲基氨基苯基)咪唑。
119.氧化酶可为从fru-α-valhis产生过氧化物的氧化酶。氧化酶可使fru-α-valhis去糖化以产生过氧化物。在一个实施方案中，氧化酶可为果糖基肽氧化酶。
120.在一些实施方案中，凝胶层102可包含氧化酶反应辅因子。辅因子可为有助于氧化酶活性的非蛋白质化合物。在其他实施方案中，辅因子可为黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和/或辅酶a (coa)。在一个实施方案中，辅因子可为黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。
121.增幅物质或催化剂可为任何放大比色染料反应的分子。由fru-α-valhis氧化酶反应产生的过氧化物可与染料相互作用，其信号被增幅物质放大。在一些实施方案中，增幅物质为过氧化物酶，如但不限于辣根过氧化物酶(pod)。
122.硬化剂可用于交联凝胶层中的凝胶和/或促进层内聚。在一些实施方案中，硬化剂为双(乙烯基磺酰甲基)(bvsm)。
123.在一些实施方案中，凝胶层溶剂/稀释剂为水。
124.在一些实施方案中，在凝胶层102中，fru-α-valhis被果糖基肽氧化酶去糖化。果糖基氧化酶对fru-α-valhis和fru-α-val都具有特异性。然而，fru-α-val不是由血红蛋白β链的蛋白质水解产生的。果糖基氧化酶的特异性还可防止来自其他糖化蛋白如白蛋白的测定干扰。
125.去糖化反应导致通过fad辅因子的循环产生过氧化物。辣根过氧化物酶和过氧化物将染料氧化成有色产物，该产物吸收670nm处的光。
126.在一些实施方案中，凝胶层102中的硬化凝胶为用于排除较大分子量蛋白质(血红蛋白、过氧化氢酶、蛋白酶)的额外保护层。凝胶的交联减小该层的孔隙尺寸，并还有助于防止来自凝胶层的染料颗粒在涂覆过程中与掩蔽层(例如，熔体)组分混合。
127.在一些实施方案中，凝胶层102的硬化可增加显微玻片的信号。硬化可使信号增加约5%至约10%、约1%至约10%、约1%至约5%、约5%至约20%、或约1%至约20%。
128.在一些实施方案中，防干扰剂可为抗坏血酸氧化酶。该氧化酶可与样本中的抗坏血酸(维生素c)反应以防止抗坏血酸干扰测量。在一些实施方案中，样本中的抗坏血酸可与凝胶层中的染料反应以还原它们并减弱它们的颜色。这种减色可能导致负的%a1c预测偏差，或简单地导致假性地低的%a1c结果。通过包含抗坏血酸氧化酶，样本中的抗坏血酸可被
消除，从而防止负的预测偏差。
129.在一些实施方案中，样本可能包含来自患者的超大剂量抗坏血酸，这些患者使用大剂量的维生素来缓解或减轻某些疾病的症状。没有防干扰剂如抗坏血酸氧化酶的情况下，结果可能不准确。因此，在一些实施方案中，如本文所述的玻片在凝胶层或玻片的任何其他适宜的层中包含防干扰剂。
130.在一些实施方案中，使用检测范式分析显微玻片的染料。检测范式可通过一种或多种反射测量进行。在一个实施方案中，使用反射光测量来检测本文所述染料的吸光度。
131.在一个实施方案中，将特定波长的光引导至检测区128，并在特定的波长处测量反射光或反射密度。反射密度(dr)由反射率确定。反射密度等于反射率的倒数的对数。
132.在一些实施方案中，光从显微玻片中的二氧化钛层反射。在一些实施方案中，所述特定波长的光可为540nm、670nm或两者。在一些实施方案中，可使用这些值附近的波长或可使用包括这些值的范围，这取决于信号强度和/或可能吸收同一光谱中的光的干扰物。
133.在一些实施方案中，可使用soret带和q带区域中的波长。波长可包括在约540nm的那些，如但不限于可使用约535nm、约536nm、约537nm、约538nm、约539nm、约541nm、约542nm、约543nm、约544nm、或约545nm。在其他实施方案中，可使用如但不限于以下的波长范围：530nm至540nm的范围、539nm至541nm的范围、538nm至542nm的范围、537nm至543nm的范围、536nm至544nm的范围、535nm至545nm的范围、540nm至545nm的范围、535nm至540nm的范围、535nm至575nm的范围、530nm至575nm的范围、540nm至575nm的范围、550nm至575nm的范围、或560nm至575nm的范围。
134.同样，在一些实施方案中，可使用在约670nm的波长，如但不限于约665nm、约666nm、约667nm、约668nm、约669nm、约671nm、约672nm、约673nm、约674nm、或约675nm。在其他实施方案中，可使用如但不限于以下的波长范围：660nm至680nm的范围、669nm至671nm的范围、668nm至672nm的范围、667nm至673nm的范围、666nm至674nm的范围、665nm至675nm的范围、670nm至675nm的范围、665nm至670nm的范围。
135.在一个实施方案中，反射密度由自动化分析仪如但不限于vitros分析仪读取。终点反射密度或反射率可通过该氧化反应产生的染料定量。
136.测定时间可随所采用的分析方案或仪器而异。然而，通常，从施加样本通过酶促级联到反射密度定量的时间为约5分钟至约10分钟、约4分钟至约6分钟、约3分钟至约7分钟、约2分钟至约8分钟，小于约10分钟、小于约9分钟、小于约8分钟、小于约7分钟、小于约6分钟、或小于约5分钟。在一个实施方案中，在vitros分析仪上在37℃下典型的测定时间为约5分钟。
137.虽然测定可在vitros分析仪上于37℃下运行，但也可使用其他温度。例如，在一些实施方案中，测定可在室温下或在高于或低于37℃的温度下运行。
138.在一些实施方案中，可从凝胶层去除酶促级联的组分如蛋白酶、果糖基氧化酶、过氧化物酶、染料和/或fad，因为它们对于在540nm处读取血红蛋白信号是不需要的。
139.在一些实施方案中，可使用单个显微玻片来仅测量%a1c。在其他实施方案中，可使用单独的显微玻片来分别单独地测量hb和hba1c，从而得到推导的%a1c结果。另外，可将测定hb浓度和hba1c浓度所需的所有组分结合在单个显微玻片中以得到推导的%a1c结果。
140.本文所述的设备、系统和方法可采用全血患者样本而无需稀释或预处理。在一些
实施方案中，全血是未裂解的。与需要处理过的血液的测试系统相比，使用全血节省时间和资源。
141.在一些实施方案中，本文所述的设备、系统和方法可使用小量血液来测量hba1c值。在临床和诊断环境中，血液样本量可能至关重要，尤其是在进行大组测试时。
142.小量血液可在约1
µ
l至约10
µ
l之间、约2
µ
l至约8
µ
l之间、约4
µ
l至约6
µ
l之间、约4
µ
l至约5
µ
l之间、约4
µ
l至约10
µ
l之间、约2
µ
l至约5
µ
l之间、小于约10
µ
l、小于约8
µ
l、小于约6
µ
l、或小于约5
µ
l。
143.在一些实施方案中，与常规方法相比，本文所述的设备、系统和方法可在短时间量内测量hba1c值。这可被称为快速测定时间。在临床和诊断环境中，在考虑时间成本和仪器通量时，测量时间可能至关重要。
144.快速测定时间可为约1分钟至约10分钟、约2分钟至约8分钟、约3分钟至约7分钟、约4分钟至约7分钟、约4分钟至约8分钟、约5分钟至约7分钟、约6分钟至约8分钟、约5分钟至约8分钟、小于约10分钟、小于约8分钟、小于约7分钟、或小于约6分钟。
145.具有快速测定时间，采用本文所述测定的高通量系统可在每个时间段运行更多的测定，从而在每个时间段产生比常规测定多的收益。在一些实施方案中，高通量系统可运行约300次测试/小时至约400次测试/小时、约350次测试/小时至约400次测试/小时、约350次测试/小时至约450次测试/小时、约300次测试/小时至约500次测试/小时、约300次测试/小时至约600次测试/小时、至少约300次测试/小时、至少约350次测试/小时、至少约375次测试/小时、或至少约400次测试/小时。
146.本文所述的设备、系统和方法可具有测定特异性，该测定特异性通过由血红蛋白的n-端β链的蛋白质水解产生底物(fru-α-valhis)和由特异性果糖基肽氧化酶的去糖化来确保。
147.在一些实施方案中，所述设备、系统和方法不受血红蛋白结构变体(hbs、hbc)的干扰。一些市售的测定法会受到hbs、hbc的干扰，因为它们是基于抗体的方法。
148.还描述了使用本文所述的显微玻片的方法。
149.在一个实施方案中，描述了用于检测血红蛋白和糖化血红蛋白的单玻片方法。该方法可包括使如本文所述的显微玻片的铺展层与包含红细胞的血液样本接触。裂解剂从红细胞释放糖化血红蛋白，变性剂与糖化血红蛋白接触以使糖化血红蛋白变性，并且蛋白酶从变性的糖化血红蛋白释放果糖基肽。然后，果糖基肽到达所述凝胶层并与果糖基氧化酶接触以释放过氧化物。过氧化物酶和过氧化物与检测剂接触以释放和/或生成可检测信号。
150.在一些实施方案中，防干扰剂与血液样本中的任何抗坏血酸反应以防止样本偏差。在一些实施方案中，防干扰剂为抗坏血酸氧化酶。
151.从血液样本测量血红蛋白的量。该测量包括使用第一波长的光读取样本的反射密度。并且，从血液样本测量糖化血红蛋白的量。糖化血红蛋白测量包括在第二波长的光下检测来自样本的可检测信号的反射密度。在一些实施方案中，第二波长的光不同于第一波长的光。在一个实施方案中，第一波长的光为540nm而第二波长的光为670nm。
152.在一些实施方案中，可在分析中相对较早地测量第一波长的光，且可在分析中稍后于延迟时间之后测量第二波长的光。延迟时间可为约30秒、约40秒、约50秒、约60秒、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约30秒至约1分钟、约40秒至约1分钟、约30秒至约2分钟、约30秒至
约3分钟、或约30秒至约4分钟。此延迟时间允许有足够的时间发生反应级联。
153.在另一个实施方案中，描述了一种直接检测糖化血红蛋白的单玻片方法。该方法可包括使如本文所述的显微玻片的第一膜层与包含红细胞的血液样本接触。裂解剂从红细胞释放糖化血红蛋白，变性剂与糖化血红蛋白接触以使糖化血红蛋白变性，并且蛋白酶从变性的糖化血红蛋白释放果糖基肽。然后，果糖基肽穿过第二膜层，其中果糖基肽到达第三膜层并与果糖基氧化酶接触以释放过氧化物。过氧化物酶和过氧化物与检测剂反应而产生可检测信号。
154.在一些实施方案中，防干扰剂与血液样本中的任何抗坏血酸反应以防止样本偏差。在一些实施方案中，防干扰剂为抗坏血酸氧化酶。
155.然后，从所述血液样本测量糖化血红蛋白的量。在这样的实施方案中，不测量非糖化血红蛋白的测量值。糖化血红蛋白测量包括检测样本中可检测信号的反射密度。糖化血红蛋白测量包括在一定波长的光下检测来自样本的可检测信号的反射密度。在一些实施方案中，该波长的光为670nm。
156.在一些实施方案中，与常规的hba1c测量测定法相比，本文所述的显微玻片可具有低的单位制造成本。所述显微玻片可将制造成本降低约5%至约10%、约5%至约20%、或约10%至约20%。
157.本文描述的显微玻片可通过在透明支撑物上涂覆连续的薄膜层来生产。因此，可通过在支撑物(114)上施加凝胶层涂层、然后在凝胶层上施加掩蔽层、在掩蔽层上施加粘附层和在粘附层上施加铺展层，来生产显微玻片。
158.在其他实施方案中，一旦通过连续的膜层沉积形成涂层，就将涂层切条至适宜的宽度。然后，通过将切条切割成单独的玻片尺寸的小块，所述小块可与间隔幅材一起安装到上部和下部玻片安装件中，来将切条涂层组装成成品显微玻片。此过程可在玻片组装机(sam)上进行。
159.可将单独的玻片包装到推车中以在主机分析仪上使用。推车可包含适合于分析仪的任意数量的玻片。在一些实施方案中，推车可具有50个显微玻片、100个显微玻片、200个显微玻片、至少10个显微玻片、至少15个显微玻片、至少20个显微玻片、至少50个显微玻片、或至少100个显微玻片。在其他实施方案中，推车可具有18个显微玻片、50个显微玻片、或60个显微玻片。
160.在一些实施方案中，可使用喷墨沉积工艺添加铺展层组分。通过喷墨沉积工艺添加的铺展层组分可包括蛋白酶、亚硝酸钠和/或氯化钙。
161.在一些实施方案中，显微玻片可在支撑层114与下部玻片安装件112之间包括间隔幅材130。间隔物可防止组装过程中、特别是上部和下部玻片安装件的焊接过程中显微玻片的损坏。
162.在一些实施方案中，显微玻片具有厚度。包括铺展层、粘附层、掩蔽层、凝胶层、任选的间隔幅材和支撑层的显微玻片的厚度为约100
µ
m、约200
µ
m、约300
µ
m、约400
µ
m、约500
µ
m、或约600
µ
m。
163.实施例1使用tio2掩蔽层减少血红蛋白光学干扰提供六个显微玻片。其中四个显微玻片在掩蔽层中包含tio2，两个不包含。将血液
样本滴到每个玻片上的铺展层上。
164.图2以图片方式示意了tio2掩蔽层的影响。玻片1和玻片3示出了tio2掩蔽层玻片的光斑侧。血红蛋白在玻片的光斑侧上很明显。玻片2和玻片4示出了tio2掩蔽玻片的读取侧。血红蛋白被排除在玻片的凝胶层(读取侧)外。
165.相比之下，玻片5和玻片6分别示出了掩蔽层中不包含tio2的显微玻片的光斑侧(玻片5)和读取侧(玻片6)。血红蛋白在玻片6 (读取侧)上很容易看到。
166.因此，在掩蔽层中包含tio2将防止任何明显量的血红蛋白穿透到凝胶层中。
167.图3a和3b及 4a和4b示出了对于“对照涂层”(非tio2掩蔽层)和tio2掩蔽层，在约6g/dl至约20g/dl血红蛋白的浓度范围内10级溶血产物系列的动力学图。
168.在540nm和670nm处记录5分钟时间段内的动力学。注意图上的比例尺不同。对照涂层在540nm处的血红蛋白信号显示出典型的动力学特性。tio2掩蔽层玻片的540nm响应表明540nm信号已因血红蛋白被排除在涂层的凝胶层外而被掩蔽。
169.类似地，对照涂层在670nm处的血红蛋白信号显示出典型的动力学特性。该数据表明，在670nm处存在不同的血红蛋白信号，这取决于被评价的血红蛋白的浓度。该信号可能导致hba1c测定在670nm染料读数中的光学干扰，从而需要校正算法。掩蔽层中的tio2大大减少了670nm血红蛋白信号，从而防止了hba1c比色测定(在670nm处读取)中的光学干扰。
170.图5和图6示意了在具有增加的血红蛋白浓度的流体中纯fru-α-valhis二肽的剂量响应图，比较了含tio2的掩蔽层玻片和不含tio2的掩蔽层。在图5中，流体在不含tio2的玻片上运行。数据显示，随着血红蛋白浓度增加，670nm处的背景信号(0.0mm fru-α-valhis)增加，导致在受试的fru-α-valhis水平上δ信号范围的损失。在图6中，流体在含tio2掩蔽层的玻片上运行。数据显示，随着血红蛋白浓度增加，670nm处的背景信号(0.0mm fru-α-valhis)保持不变。在670nm处来自血红蛋白的光学干扰已减少和/或消除。
171.实施例2hba1c显微玻片测试评价模型%a1c流体和全血患者样本的hba1c显微玻片数据。图 7a-d示意了670nm处的反射密度(dr)动力学数据，以比较模型%a1c流体信号生成与%a1c患者样本信号生成。
172.%a1c模型流体和%a1c患者样本具有相当的%a1c。除了亚硝酸钠和蛋白酶是通过喷墨沉积工艺施加的外，所有的hba1c显微玻片组分均是x-料斗涂覆的。
173.另外，通过涂覆较高浓度(覆盖率)的变性表面活性剂(n-月桂酰肌氨酸，nls)，%a1c模型流体和%a1c患者样本的动力学响应也增加。如图 7a-d中可见，%a1c患者样本与%a1c模型流体具有类似的动力学特性。另外，图 7a-d显示，在所评价的%a1c水平之间存在良好的区分度。
174.图8a和8b示意了670nm处的dr动力学数据，以比较模型%a1c流体信号生成与%a1c患者样本信号生成。该数据是用结合了进行本文所述的酶促级联的所有组分的x-料斗涂覆生成的。
175.%a1c模型流体和%a1c患者样本具有相当的%a1c。如图8a和8b中可见，%a1c患者样本与%a1c模型流体具有类似的动力学特性。另外，图8a和8b显示，在所评价的%a1c水平之间存在良好的区分度。
176.图9示意了%a1c模型流体和全血%a1c患者样本在670nm处的dr剂量响应数据。该数
据是使用与图8a和8b中所示数据相同的涂层生成的。该数据清楚地显示，全血患者样本给出的响应曲线与由纯化的糖化血红蛋白制成的%a1c模型流体相同。这表明本文所述的显微玻片能够裂解红细胞，使糖化血红蛋白变性和消化而产生底物，从而产生比色信号。
177.图10示意了hba1c显微玻片的患者样本预测%a1c结果与指定的hplc %a1c值的相关图。使用基于670nm处的hba1c显微玻片反射密度和microtip % a1c参考值的线性校准模型，来针对每个患者样本预测6个显微玻片平行测定中的每一个。将显微玻片%a1c预测值的平均值与biorad variant高效液相色谱(hplc) %a1c结果进行比较。如图10中所证实，显微玻片%a1c测定与hplc %a1c测定具有非常强的相关性。
178.基于本实施例中获得和研究的数据，用本文所述的显微玻片进行直接%a1c测量是可行的。
179.实施例3使用hba1c组分和血红蛋白组分测定推导的%a1c这里，将如本文所述的hba1c显微玻片与血红蛋白显微玻片组合使用，以生成患者样本的推导的%a1c结果。
180.这里，hba1c显微玻片测量组分糖化血红蛋白，而单独的血红蛋白显微玻片测量总的血红蛋白组分。使用这两个结果来计算推导的%a1c测试结果。
181.图11示意了上一节中使用的%a1c患者样本的血红蛋白组分剂量响应图。将540nm处的反射密度对vitros microtip血红蛋白浓度结果(单位：g/dl)作图。
182.图12示意了患者样本预测的显微玻片血红蛋白组分浓度与指定的microtip参考血红蛋白值的相关图。使用基于540nm处的血红蛋白显微玻片反射率和microtip血红蛋白参考值的线性校准模型，来针对每个患者样本预测6个血红蛋白显微玻片平行测定中的每一个(图11)。将显微玻片血红蛋白组分预测值的平均值与microtip血红蛋白参考值进行比较。显微玻片血红蛋白组分测定与microtip血红蛋白测定具有良好的相关性。
183.图13示意了实施例2中使用的%a1c患者样本的hba1c组分剂量响应图。将670nm处的反射密度对microtip hba1c组分浓度结果(单位：g/dl)作图。
184.图14示意了患者样本预测的显微玻片hba1c组分浓度与指定的microtip参考hba1c组分值的相关图。使用基于670nm处的hba1c显微玻片反射率和microtip hba1c组分参考值的线性校准模型来针对每个患者样本预测6个hba1c组分显微玻片平行测定中的每一个(图13)。将显微玻片hba1c组分预测值的平均值与microtip hba1c组分参考值进行比较。显微玻片hba1c组分测定与microtip hba1c组分测定具有良好的相关性。
185.图15示意了患者样本预测的显微玻片推导%a1c与biorad variant hplc 参考%a1c值的相关图。显微玻片%a1c值通过使用血红蛋白组分结果(g/dl)和hba1c组分结果(g/dl)使用美国国家糖化血红蛋白标准化计划“主方程”(参见取自vitros hba1c microtip assay instructions for use, 出版号j55871_en (2.0版)的以下方程)生成推导的%a1c值来获得。
186.将显微玻片%a1c值的平均值与hplc %a1c参考值进行比较。显微玻片推导的%a1c测定与hplc %a1c测定具有良好的相关性。
187.实施例3的数据证实，使用如本文所述的血红蛋白显微玻片测定法与hba1c显微玻片测定法相组合生成推导的%a1c结果的推导%a1c测量是可行的。
188.实施例4使用hba1c组分和血红蛋白组分测定推导的%a1c这里，使用单个显微玻片测试元件来生成血红蛋白光谱结果和hba1c酶促结果以生成患者样本的推导%a1c结果。这被称为“双重测定”显微玻片测试元件。使用的显微玻片在掩蔽层中不包含二氧化钛，因为它将阻碍在540nm处读取血红蛋白信号的能力。蛋白酶和亚硝酸钠可通过喷墨沉积或x-料斗涂覆工艺结合到显微玻片中。
189.图16和图17示意了双重测定显微玻片测试元件的hba1c组分剂量响应数据(670nm)和血红蛋白组分剂量响应(540nm)。反射密度(dr)剂量响应数据显示，双重测定显微玻片测试元件能够在670nm处以剂量依赖性方式记录bbi hba1c流体系列，表明酶促级联是功能性的。显微玻片测试元件还以剂量依赖性方式测量540nm处的血红蛋白光谱读数。如实施例3中所述，推导的a1c%测量使用“双重测定”显微玻片测试元件是可行的。
190.实施例5直接的%a1c测量将全血样本施加到如本文所述的显微玻片上。本文所述的酶促级联产生氧化染料，该氧化染料吸收670nm处的光，而显微玻片使用掩蔽层过滤掉非糖化血红蛋白。在670nm处，光在掩蔽层中的二氧化钛上反射并读取反射密度。使用%a1c校准曲线，将反射密度直接计算为%a1c。
191.实施例6使用单个样本的推导%a1c将全血样本施加到如本文所述的显微玻片上，该显微玻片在掩蔽层中不包含二氧化钛。本文所述的酶促级联产生氧化染料，该氧化染料吸收670nm处的光，并允许在540nm处测量非糖化血红蛋白。从540nm和670nm处的测量获得的值允许计算推导的%a1c。
192.实施例7在单个显微玻片上使用两个样本的推导%a1c
将两个全血样本施加到显微玻片的两个分开的区域中。一个区域在其掩蔽层中包含二氧化钛并且本文所述的酶促级联产生氧化染料，该氧化染料吸收670nm处的光。另一个样本区域不包含二氧化钛，允许在540nm处直接测量非糖化血红蛋白。从540nm和670nm处的测量获得的值允许计算推导的%a1c。
193.实施例8在单个玻片上使用两个测量的推导%a1c将全血样本施加到如本文所述的显微玻片上。本文所述的酶促级联产生氧化染料，该氧化染料吸收670nm的光，而显微玻片使用其掩蔽层消除非糖化血红蛋白信号。在670nm处，光从使用二氧化钛的掩蔽层下方反射并读取反射密度。另外，在540nm处，光从掩蔽层上方在二氧化钛和铺展层中的vte珠粒上反射并读取血红蛋白的反射密度。从540nm和670nm处的测量获得的值允许计算推导的%a1c。
194.实施例9减少抗坏血酸干扰运行来自一名患者的两个样本。该患者已大量服用抗坏血酸以达到抗癌效果。第一个样本在凝胶层中包含抗坏血酸氧化酶的玻片上运行，而第二个样本在无抗坏血酸氧化酶的玻片上运行。
195.来自第一个样本的结果显示出比第二个样本高的%a1c值。
196.除非另有指出，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分的量、性质如分子量、反应条件等的数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。相应地，除非指出相反，否则说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可随本发明寻求获得的期望性质而异。至少、而非试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的四舍五入技术来解释。尽管阐述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体的实施例中阐述的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值均固有地含有一定的误差，这些误差是由在它们各自的测试测量中存在的标准偏差必然地造成的。
197.除非本文中另有指出或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在随附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”和“该”及类似指代应解释为涵盖单数和复数两者。本文对值的范围的记载仅旨在用作单独地提及落入该范围内的每一个单独的值的简写方法。除非本文中另有指出，否则每一个单独的值都被并入到说明书中，就好像其在本文中被单独地记载一样。除非本文中另有指出或明显与上下文相矛盾，否则本文描述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另有主张，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地示意本发明，而不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言均不应解释为指示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
198.本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可单独地或以与组中的其他成员或本文中存在的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，预期组中的一个或多个成员可被包含在一个组中或从一个组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书应视为包含修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
199.本文描述了本发明的某些实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。当然，在阅读上述描述后，这些描述的实施方案的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人预期本领域技术人员会酌情采用这样的变化，并且发明人意图是本发明可以本文具体描述的之外的方式实施。相应地，本发明包括如适用法律所允许的对所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文中另有指出或明显与上下文相矛盾，否则上述要素以其所有可能的变体的任何组合均涵盖在本发明内。
200.最后，应理解，本文公开的本发明的实施方案是对本发明的原理的示意。可采用的其他修改都在本发明的范围内。因此，举例而言而非限制地，可根据本文的教导采用本发明的替代配置。因此，本发明不限于严谨地如所示和所描述的那样。