生物墨水调配物、生物打印的角膜微透镜和其应用的制作方法

1.本公开广泛地涉及生物工程化的调配物领域，总体而言，并且公开了一种生物墨水调配物和生物打印微透镜，及其在生物医学领域中的应用。


背景技术：

2.在生物体中，器官眼睛代表视觉系统并执行各种光感功能。角膜是眼睛的最外层，表现为透明的膜状组织。角膜的主要功能是帮助聚焦视力，并且角膜在视力方面起重要作用。尽管角膜似乎具有简化的组织结构，但这种组织由多层构成。
3.角膜的各层依次是：上皮、鲍曼氏膜(bowman's membrane)、基质、德斯密氏膜(descemet'smembrane)和内皮。这些组织层中的每个组织层包括不同类型的细胞。这种组织的维持依赖于来自房水的泪液的营养物的定期供应。
4.角膜可以受创伤、感染以及若干疾病影响，如角膜磨损、角膜营养不良、角膜溃疡、角膜新生血管、福斯氏营养不良(fuchs'dystrophy)、角膜炎以及圆锥形角膜等。这些病状可以导致暂时或完全失明，并且是世界上失明的主要原因。
5.用于治疗角膜疾病的一些常用手术包含激光手术、角膜移植外科手术、前板层角膜成形术、内皮板层角膜成形术以及使用人工角膜。这些治疗涉及角膜的一部分或全部的替换。在进行这些治疗之后，角膜的愈合通常会受到损害，并且因此正在进行研究以寻找更好且有效的替代方案。超过90％的角膜是基质，所述基质是一种由角膜细胞、神经嵴起源的静止间充质细胞维持的高度组织化的透明结缔组织。
6.角膜失明是失明的第四主要原因，角膜失明具有多种致病因素，如感染性角膜炎、炎性病症、遗传性角膜上皮-基质营养不良、退行性病状和创伤诱导的损伤。角膜移植是最常见的治疗方式，其在高成本、移植排斥和临床级尸体供体角膜的需求与供应之间的不平衡方面提出挑战。此外，供体角膜存在批次间差异的问题。因此，迫切需要解决角膜治疗领域的需求，并且本公开解决了与角膜失明和角膜缺损相关的问题。ulag等人2020；《欧洲聚合物杂志(euro pol j.)》2020；133；109744.10.1016/j.eurpolymj.2020.109744公开了人工3d打印角膜，然而，公开的研究没有提供满足令人期望的参数如透射率的人工角膜。因此，需要提供更好的解决方案来解决本领域中普遍存在的这个问题。


技术实现要素：

7.在本公开的一方面，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
8.在本公开的另一方面，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：
(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
9.在本公开的另一方面，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内。
10.在本公开的另一方面，提供了一种用于制备如本文所述的生物墨水调配物的方法，所述方法包括：(a)使分子量在30kda到300kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性透明质酸和分子量在10kda到80kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性胶原蛋白肽以及bloom值在50到325的范围内的明胶接触，以获得第一混合物；以及(b)使所述第一混合物与光激活剂接触，以获得所述生物墨水调配物。
11.在本公开的另一方面，提供了一种用于制备如本文所述的生物墨水调配物的方法，所述方法包括：(a)使分子量在30kda到300kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性透明质酸和分子量在200kda到300kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性胶原蛋白以及bloom值在50到325的范围内的明胶接触，以获得第一混合物；以及(b)使所述第一混合物与光激活剂接触以获得所述生物墨水调配物。
12.在本公开的另一方面，提供了一种包括如本文所述的生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜。
13.在本公开的另一方面，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在1％到25％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内。
14.在本公开的另一方面，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在5％到50％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内。
15.在本公开的另一方面，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜
微透镜包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐。
16.在本公开的另一方面，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐；以及(d)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体。
17.在本公开的另一方面，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐；以及(d)选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞(wharton jelly-derived mesenchymal stem cell)、牙髓源性间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和诱导性多能干细胞。
18.在本公开的另一方面，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物墨水调配物；(b)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(c)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。
19.在本公开的另一方面，提供了一种通过如本文所述的方法获得的生物打印的角膜微透镜。
20.在本公开的另一方面，提供了一种用于治疗受试者的角膜缺损的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物打印的角膜微透镜；以及(b)将所述生物打印的角膜微透镜植入在所述角膜缺损的部位处，以治疗所述受试者的所述角膜缺损。
21.在本公开的另一方面，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其用于治疗受试者的角膜缺损。
22.在本公开的另一方面，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其用于体外药物毒性研究和疾病建模。
23.在本公开的另一方面，提供了如本文所述的生物墨水调配物，其用于获得生物打印的角膜微透镜。
ma35mg/ml+rcp-sh 150mg/ml，dos均为50％)的细胞活力研究，底部图描绘了根据本公开的一实施例的在生物打印的水凝胶中的细胞内部的均匀分布，比例尺＝200μm。
39.图14描绘了根据本公开的一实施例的免疫荧光研究，其示出了封装在生物打印的微透镜(50kda ha-ma 35mg/ml+rcp-sh 150mg/ml，dos均为50％)中的clsc相对于2d培养表面对cd90(红色)和αsma(绿色)的表达，比例尺＝100μm。
40.图15描绘了根据本公开的一实施例的浓度比为50/9mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)/col-ma生物墨水及其在可见光中的单独组分的透光率研究。
41.图16描绘了根据本公开的一实施例的封装在浓度比为50/9mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)/col-ma生物墨水中的clsc的细胞活力研究，比例尺＝50μm。
42.图17描绘了根据本公开的一实施例的封装在代表性潘朵姆氏生物墨水(pandorum'sbioink)(50kda ha-ma/250kda colma，50/9mg/ml)中的clsc进行的生物标志物表达cd90(红色)和αsma(绿色)，反映了随着培养持续时间的进展的细胞表型，比例尺＝50μm。
43.图18描绘了根据本公开的一实施例的相衬显微图像，所述相衬显微图像描绘了在体外第3天和第13天具有原代人角膜上皮细胞的2d盖玻片、gel-ma(200mg/ml,dos》95％)、“33kda”ha-ma/rcp-sh(75/125和75/150mg/ml，dos均为50％)水凝胶表面的上皮形成(比例尺＝100μm)。
44.图19描绘了根据本公开的一实施例的在“33kda”ha-ma/rcp-sh(mg/ml，dos均为50％)水凝胶表面和gel-ma(200mg/ml，dos》95％)以及2d培养表面上培养的clsc的细胞活力研究，(比例尺＝500μm)。
45.图20描绘了封装在“33kda”ha-ma/rcp-sh(mg/ml，dos均为50％)水凝胶和gel-ma(200mg/ml，dos》95％)中的clsc的细胞活力研究。根据本公开的一实施例，将盖玻片上的细胞在表面上培养。
46.图21描绘了根据本公开的一实施例的免疫荧光研究，其示出了封装在代表性“33kda”ha-ma/rcp-sh(dos均为50％)水凝胶调配物中的clsc相对于2d培养表面对cd90(红色)和αsma(绿色)的表达，(比例尺＝100μm)。
具体实施方式
47.本领域的技术人员将意识到，除了具体描述的那些之外，本公开可以进行变化和修改。应当理解，本公开包含所有此类变化和修改。本公开还包含在本说明书中单独地或共同地参考或指示的所有此类步骤、特征、组合物和化合物，以及此类步骤或特征中的任何或更多个步骤或特征的任何和所有组合。
48.定义
49.为了方便起见，在进一步描述本公开之前，本文描述了说明书中采用的某些术语和实例。这些定义应该根据本公开的其余部分来阅读并且如本领域的技术人员那样来理解。本文使用的术语具有本领域的技术人员公认和已知的含义，然而，为了方便和完整起见，特定术语和其含义阐述如下。
50.使用冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”来指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。
51.术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”以包容性开放的意义使用，这意味着可以包含另外的元素。所述术语并不旨在被解释为“仅由
…
组成(consists of only)”。
52.贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包括”以及如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”等变体将被理解为暗示包含所述的元件或步骤、或者多个元件或多个步骤的组，但不排除任何其它的元件或步骤、或者多个元件或多个步骤的组。
53.术语“包含(including)”用于意指“包含但不限于”。“包含”和“包含但不限于”可互换地使用。
54.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述了优选方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。
55.比率、浓度、量和其它数值数据在本文中可以以范围形式呈现。应当理解，此类范围格式仅为了方便和简洁而使用的，并且应当灵活地解释为不仅包含明确叙述为范围的界限的数值，而且还包含涵盖所述范围内的所有单独数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确叙述一样。例如，在约2到100的2mg/ml到100mg/ml的范围内的浓度应当被解释为不仅包含明确叙述为约2到约100的界限，而且还包含子范围，如10-90、25-75等，以及指定范围内的单个量，包含分数量，如35.5和45.5。
56.术语“脱细胞细胞外基质(decm)”是指在特定类型的细胞群脱细胞之后获得的生物材料。decm可以是细胞培养物源性decm，其中通过体外细胞培养方法获得特定类型的细胞群。所关注的细胞分泌的ecm组分的一些实例是光蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、角蛋白聚糖。术语“细胞源性组分”是指源自细胞的任何组分或成分的组合。细胞源性组分通常是从包括外泌体、细胞调节剂、分泌因子以及其它组分的条件培养基获得的。术语“条件培养基”是指富含细胞分泌因子的培养基，所述细胞分泌因子如各种蛋白质/生长因子，如肝细胞生长因子(hgf)、角膜细胞生长因子(kgf)和可溶性形式如酪氨酸激酶1(sflt1)、色素上皮源性生长因子(pedf)、血小板反应蛋白和含有包含mir-10b、mir-21、mir-23a、mir-182、mir-181a、mir-145的各种分子的外泌体以及表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、sflt1和磷酸甘油酸激酶(pgk)、葡糖磷酸变位酶、烯醇酶、cd73、cd63和mmp9。条件培养基的组成旨在被开发用于治疗应用。术语“细胞调节剂”是指各种分泌因子，如ecm、生长因子、含有广泛范围的小大分子和大分子的外泌体货物、自然界中的许多蛋白质或核酸。这些细胞调节剂中的一些细胞调节剂包含可以调节细胞应答的微rna、mrna、长非编码rna、脂质介质。术语“外泌体”是指细胞分泌的囊泡，所述细胞分泌的囊泡含有自然界中的蛋白质或核酸的货物分子，通常是指20nm到200nm范围具有临床关注的分子，如抗炎性、抗纤维化和再生性质。
57.术语“生物墨水调配物”用于意指包括如本文所公开的组分的调配物/组合物。生物墨水调配物表示用作用于使用3d打印机打印生物打印的角膜微透镜的墨水的调配物。
58.术语“生物打印的角膜微透镜”或“生物打印的微透镜”是指通过使用3d打印机将如本文所公开的生物墨水调配物打印在支架上而获得的合成材料。微透镜的尺寸可以根据有需要的受试者的要求而变化。微透镜可以用于替换整个受损角膜，或可以根据需要在角膜上修复的区域来制造。
59.如本公开中所公开的生物墨水调配物是在调配物中未完全交联的聚合物的混合
物。根据少数实施方案，生物墨水包括光引发剂，所述光引发剂在存在光的情况下开始交联过程，然而，为了发生完全交联，如本公开中所公开的在需要光时暴露于高强度。完全交联的生物墨水也可以被称为“水凝胶”。如本领域的技术人员将理解的，某些参数如压缩模量和拉伸强度的测试仅可能在交联产品如水凝胶中进行。此外，生物打印的角膜微透镜是通过将生物墨水调配物打印在支架上，随后暴露于高强度白光以进行完全交联而获得的产品。此外，某些参数的测试仅可以在生物打印的产品上进行，以评估对应生物墨水调配物的有用性。
60.已经可互换地使用术语“角膜缺损”或“角膜病症”来表示角膜中需要医学干预的问题。干预可以达到用如本公开中所述的生物打印的微透镜替换受损角膜的程度。
61.如本文所使用的术语“胶原蛋白”和“胶原蛋白序列源性肽”用于包含所述多肽和蛋白质序列的天然、合成、重组和/或替代性版本。
62.术语“改性透明质酸”或“改性胶原蛋白肽”或“改性胶原蛋白”或“改性丝”或“改性纤维素”或“聚乙二醇”或“改性聚乙烯醇”或“改性海藻酸盐”表示在相应分子中可能的任何种类的改性。本公开中涵盖了已经完成的具体改性。例如，改性纤维素旨在意指改性分子，如甲基纤维素、羧甲基纤维素(cmc)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)和羟乙基甲基纤维素(hemc)。
63.术语“间充质干细胞源性条件培养基或“msc-cm”是指在msc生长后获得的培养基。由此获得的条件培养基包括分泌的细胞调节剂和对组织再生至关重要的多种因子。由此获得的条件培养基还包括分泌组和外泌体，在能够用于治疗目的之前，需要从条件培养基中对所述外泌体进行纯化。如本文所述的用于获得经扩增msc的过程还导致msc-cm的形成，因此，可以说单个过程导致获得经扩增msc的群体以及msc-cm的群体。术语“外泌体”是指包含分泌外泌体的生物细胞的成分(就蛋白质、dna和rna而言)的细胞外囊泡的类型。从本文所述的条件培养基中获得的外泌体用于治疗目的。
64.术语“角膜基质干细胞源性条件培养基”或“cssc-cm”是指角膜基质干细胞(cssc)在其中生长的培养基。本文所述的cssc-cm是通过以本领域已知的方式培养cssc或通过根据本文所公开的方法培养cssc来获得的。角膜缘干细胞(clsc)是从如在先前pct申请pct/in2020/050622和pct/in2020/050623中所述的角膜缘环中分离的。这些细胞可以分为两个亚群：角膜基质干细胞(cssc)和角膜缘上皮干细胞(lesc)。pct申请pct/in2020/050622和pct/in2020050623公开了用于cssc分离的方法并且通过其中使用的方案证明了cssc群体相对于lesc的富集。然而，在富含cssc的级分中留下少量lesc的情况下，将其称为“clsc”以涵盖这些应用中的所有细胞类型。因此，源自这种富含cssc的群体的条件培养基被称为cssc源性条件培养基(cssc-cm)。应当理解，为了简单起见，术语cssc-cm也用于表示通过培养富集的cssc获得的条件培养基，其中也存在少量lesc。
65.如本公开中所述的术语“无外源物质(xeno-free)”是指如本文所述的方法，其不含源自非人动物的任何产品。所述方法无外源物质是重要的优点，因为其具有临床应用的合理性。术语“可扩展”是指增加生产输出歧管的能力。术语“受试者”是指患有本公开中提及的病状的人受试者或哺乳动物受试者。术语“治疗有效量”是指用于治疗受试者的病状所需的组合物的量。
66.术语“支架”是指用作将生物墨水打印在其上的载体的模具或惰性物质。根据本公
开的实施方案，所述打印是使用3d打印机进行的。
67.术语“培养基”是指培养msc的培养基。培养基包括msc基础培养基，并且msc基础培养基根据正在培养的msc使用。本公开中提及的msc基础培养基是可商业获得的。出于本公开的目的，roosterbio无外源物质培养基用于bmmsc。
68.部分或完全的角膜植入物是用于治疗角膜疾病的最成功疗法之一。本公开通过提供有效且高效的生物工程化的生物打印的角膜微透镜来提供对与通过各种方式治疗角膜疾病之后角膜的低于标准的愈合相关的问题的解决方案。本公开公开了生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)聚合物，所述聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白(甲基丙烯酸酯化和硫醇化)、胶原蛋白肽衍生物、透明质酸及其改性物(甲基丙烯酸酯化和硫醇化)、纤维素衍生物(甲基纤维素、羧甲基纤维素及其甲基丙烯酸酯化和硫醇化衍生物)、聚乙二醇衍生物(线性和多臂；甲基丙烯酸酯化和硫醇化)、聚乙烯醇(甲基丙烯酸酯化和硫醇化)、明胶(甲基丙烯酸酯化和硫醇化)、壳聚糖和海藻酸盐；以及(b)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、结冷胶、黄原胶、纤维素衍生物，如甲基纤维素、羧甲基纤维素(cmc)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)和羟乙基甲基纤维素(hemc)、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐。生物墨水调配物被调配成具有最佳粘度，使得所述生物墨水调配物可以使用3d打印机容易地打印，以获得生物打印的角膜微透镜。生物打印的角膜微透镜进一步可以用于治疗受试者的角膜缺损。生物墨水调配物以及生物打印的角膜微透镜无外源物质，并且可扩展以满足角膜植入物的临床要求。获得光学厚度在5微米到500微米的范围内的生物打印的角膜微透镜。
69.pct申请pct/in2020/050622和pct/in2020050623是由本公开的申请人提交的，并且公开了培养干细胞和经扩增干细胞以及干细胞源性条件培养基的二维和三维方法。上述pct申请还公开了用于获得经扩增致敏间充质干细胞和源自经扩增致敏间充质干细胞的条件培养基的方法。pct申请第pct/in2020/050622号和第pct/in2020050623号以其整体并入本文。
70.当前治疗模式带来的挑战可以通过使用生物材料并且通过采用3d生物打印技术将成体干细胞掺入其内来解决。为此，本公开还公开了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞和诱导性多能干细胞。另外，本公开还公开了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体。生物打印的微透镜中外泌体的存在可以通过外泌体的再生潜力帮助治疗角膜病症。本公开还公开了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括干细胞以及外泌体，其可以进一步增强生物打印的角膜微透镜的治疗潜力。
71.具有或不具有干细胞或外泌体的生物墨水调配物连同光引发剂在存在光的情况下交联，以产生透明的生物打印的角膜微透镜。生物打印的角膜微透镜是仿生的，因为其具有与天然角膜组织特性相匹配的物理、机械和生物性质。此外，生物墨水调配物是生物相容的并具有角膜模拟性质并促进人角膜上皮细胞迁移以及增殖。
72.使用透明质酸(其是一种存在于眼睛中的天然组分)开发透明可缝合的3d生物打
印的角膜微透镜可以用作用部分或全层移植移植物替换患病/损伤角膜的可行治疗选择。
73.以下段落描绘了所要求保护的生物工程化的角膜基质组合物和合成角膜基质的实施例。另外，还描绘了用于制备所述生物工程化的角膜基质组合物和合成角膜基质的方法。还提供了用于制造所要求保护的生物工程化的角膜基质组合物和合成角膜基质的生物墨水组合物。然而，本领域的技术人员可以根据需要采用条件并且基于代表性实例制备组合物，并且此类方法将落入本发明的范围内。
74.实施例进一步描绘了本文所公开的生物工程化的角膜基质组合物，其包括至少一种细胞外基质(ecm)模拟聚合物和至少一种交联剂聚合物。
75.本公开的范围不受本文所述的具体实施例的限制，这仅出于例示的目的。功能等效的产物、组合物和方法显然在本公开的如本文所述的范围内。
76.尽管已经关于具体实施例描述了本主题，但此描述并不意味着以限制意义来解释。在参考对本主题的描述时，所公开实施例的各种修改以及本主题的替代实施例对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。因此可以设想，可以在不背离所定义的本主题的精神或范围的情况下进行这些修改。
77.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。在本公开的另一个实施例中，改性透明质酸的分子量在30kda到300kda或40kda到280kda或40kda到250kda或40kda到200kda或40kda到150kda或40kda到125kda或40kda到100kda或40kda到75kda或40kda到60kda的范围内，并且其中改性透明质酸的取代度在20％到70％或30％到65％或35％到60％或40％到60％的范围内，并且其中改性胶原蛋白肽的分子量在20kda到70kda或25kda到65kda或30kda到60kda或35kda到55kda或40kda到55kda或45kda到55kda的范围内，并且其中改性胶原蛋白肽的取代度在20％到70％或30％到65％或35％到60％或40％到60％的范围内，并且其中明胶的bloom值在75到300或100到275或125到250或175到225的范围内，并且其中明胶的浓度在50mg/ml到80mg/ml或55mg/ml到75mg/ml或55mg/ml到70mg/ml或55mg/ml到65mg/ml或0.5mg/ml到120mg/ml或5mg/ml到120mg/ml或15mg/ml到100mg/ml或25mg/ml到90mg/ml或40mg/ml到90mg/ml的范围内。
78.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为50kda并且取代度为50％；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度为50％；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
79.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为50kda并且取代度在30％到70％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度在30％到70％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生
物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
80.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为50kda并且取代度为50％，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为2mg/ml到100mg/ml；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度为50％，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为10mg/ml到250mg/ml；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
81.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为50kda并且取代度为50％，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为31mg/ml到50mg/ml；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度在50％的范围内，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为80mg/ml到200mg/ml；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
82.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为50kda，并且取代度在10％到75％的范围内，优选地为50％；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量为250kda，并且取代度在10％到75％的范围内，优选地为29％；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
83.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为33kda并且取代度在30％到70％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度在30％到70％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
84.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为33kda并且取代度为50％；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度为50％；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
85.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为33kda并且取代度为50％，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为2mg/ml到100mg/ml；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度为50％，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为10mg/ml到250mg/ml；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
86.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量为33kda并且取代度为50％，相对于所述生
物墨水调配物的浓度范围为31mg/ml到50mg/ml；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量为50kda并且取代度为50％，相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为80mg/ml到200mg/ml；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。
87.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml。在本公开的另一个实施例中，改性透明质酸的分子量在30kda到300kda或40kda到280kda或40kda到250kda或40kda到200kda或40kda到150kda或40kda到125kda或40kda到100kda或40kda到75kda或40kda到60kda的范围内，并且其中改性透明质酸的取代度在20％到70％或30％到65％或35％到60％或40％到60％的范围内，并且其中改性胶原蛋白的分子量在210kda到280kda或225kda到260kda或235kda到250kda的范围内，并且其中改性胶原蛋白的取代度在20％到70％或30％到65％或35％到60％或40％到60％的范围内，并且其中明胶的bloom值在75到300或100到275或125到250或175到225的范围内，并且其中明胶的浓度在50mg/ml到80mg/ml或55mg/ml到75mg/ml或55mg/ml到70mg/ml或55mg/ml到65mg/ml的范围内。
88.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内。在本公开的另一个实施例中，生物墨水调配物的粘度在1700cp到5000cp或1800cp到4900cp或1900cp到4800cp或2000cp到4500cp的范围内。
89.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml，其中所述改性透明质酸相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为2mg/ml到100mg/ml，并且其中所述改性胶原蛋白肽相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为10mg/ml到250mg/ml。在本公开的另一个实施例中，所述改性透明质酸相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为5mg/ml到90mg/ml或10mg/ml到80mg/ml或15mg/ml到80mg/ml或20mg/ml到70mg/ml或25mg/ml到70mg/ml或30mg/ml到60mg/ml或30mg/ml到55mg/ml、30mg/ml到50mg/ml或30mg/ml到47mg/ml，并且其中所述改性胶原蛋白肽的浓度范围为20mg/ml到230mg/ml或50mg/ml到200mg/ml或75mg/ml到200mg/ml或90mg/ml到200mg/ml或100mg/ml到200mg/ml或125mg/ml到175mg/ml。
90.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml，并且其中所述改性透明质酸相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为2mg/ml到100mg/ml，并且所述改性胶原蛋白相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到100mg/ml。在本公开的另一个实施例中，所述改性透明质酸相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为5mg/ml到90mg/ml或10mg/ml到80mg/ml或15mg/ml到80mg/ml或20mg/ml到70mg/ml或25mg/ml到70mg/ml或30mg/ml到60mg/ml或30mg/ml到55mg/ml、30mg/ml到50mg/ml或30mg/ml到47mg/ml，并且其中所述改性胶原蛋白的浓度范围为0.5mg/ml到90mg/ml或1mg/ml到80mg/ml或5mg/ml到70mg/ml或7mg/ml到60mg/ml或8mg/ml到50mg/ml或8mg/ml到40mg/ml或8mg/ml到30mg/ml或8mg/ml到20mg/ml。
91.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml，并且其中所述改性透明质酸选自由以下组成的组：甲基丙烯酸酯化透明质酸和硫醇化透明质酸，并且其中所述改性胶原蛋白肽选自由以下组成的组：硫醇化胶原蛋白肽和甲基丙烯酸酯化胶原蛋白肽。在本公开的另一个实施例中，所述改性透明质酸是甲基丙烯酸酯化透明质酸，并且所述改性胶原蛋白肽是硫醇化胶原蛋白肽。
92.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml，并且其中所述改性透明质酸选自由以下组成的组：甲基丙烯酸酯化透明质酸和硫醇化透明质酸，并且其中所述改性胶原蛋白选自由以下组成的组：硫醇化胶原蛋白和甲基丙烯酸酯化胶原蛋白。在本公开的另一个实施例中，所述改性透明质酸是甲基丙烯酸酯化透明质酸，并且所述改性胶原蛋白是硫醇化胶原蛋白。
93.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚
乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内，并且其中所述改性透明质酸选自由以下组成的组：甲基丙烯酸酯化透明质酸和硫醇化透明质酸，并且其中所述改性胶原蛋白肽选自由以下组成的组：硫醇化胶原蛋白肽和甲基丙烯酸酯化胶原蛋白肽，并且其中所述改性胶原蛋白选自由以下组成的组：硫醇化胶原蛋白和甲基丙烯酸酯化胶原蛋白。在本公开的另一个实施例中，改性透明质酸是甲基丙烯酸酯化透明质酸，并且改性胶原蛋白肽是硫醇化胶原蛋白肽，并且改性胶原蛋白是硫醇化胶原蛋白。在本公开的又另一个实施例中，改性透明质酸相对于生物墨水调配物的浓度范围为2mg/ml到100mg/ml，并且改性胶原蛋白肽相对于生物墨水调配物的浓度范围为10mg/ml到250mg/ml，并且改性胶原蛋白相对于生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到100mg/ml。在本公开的一个另一个实施例中，改性透明质酸相对于生物墨水调配物的浓度范围为5mg/ml到90mg/ml或10mg/ml到80mg/ml或15mg/ml到80mg/ml或20mg/ml到70mg/ml或25mg/ml到70mg/ml或30mg/ml到60mg/ml或30mg/ml到55mg/ml、30mg/ml到50mg/ml或30mg/ml到47mg/ml，并且其中改性胶原蛋白肽的浓度范围为20mg/ml到230mg/ml或50mg/ml到200mg/ml或75mg/ml到200mg/ml或90mg/ml到200mg/ml或100mg/ml到200mg/ml或125mg/ml到175mg/ml，并且其中改性胶原蛋白的浓度范围为0.5mg/ml到90mg/ml或1mg/ml到80mg/ml或5mg/ml到70mg/ml或7mg/ml到60mg/ml或8mg/ml到50mg/ml或8mg/ml到40mg/ml或8mg/ml到30mg/ml或8mg/ml到20mg/ml。
94.在本公开的一实施例中，提供了一种生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在40kda到60kda的范围内并且取代度在40％到60％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在40kda到60kda的范围内并且取代度在40％到60％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在175到225的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到70mg/ml，并且其中所述改性透明质酸的浓度范围为25mg/ml到45mg/ml，并且其中所述改性胶原蛋白肽的浓度范围为125mg/ml到175mg/ml，并且其中所述改性透明质酸是甲基丙烯酸酯化透明质酸，并且所述改性胶原蛋白肽是硫醇化胶原蛋白肽。
95.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括光激活剂，其中所述光激活剂是相对于所述生物墨水调配物浓度在0.005mm到1mm的范围内的伊红，或者所述光激活剂是相对于所述生物墨水调配物浓度在0.1mm到50mm的范围内的核黄素。
96.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括相对于所述生物墨水调配物浓度在0.005mm到1mm的范围内的光激活剂伊红。在本公开的另一个实施例中，伊红相对于生物墨水调配物的浓度在0.005mm到1mm或0.01mm到1mm或0.05mm到1mm或0.1mm到1mm或0.5mm到1mm或0.75mm到1mm的范围内。
97.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括相对于所述生物墨水调配物浓度在0.1mm到50mm的范围内的光激活剂核黄素。在本公开的另一个实施例中，核黄素相对于生物墨水调配物的浓度在1mm到45mm或5mm到40mm或10mm到35mm或15mm到30mm或17mm到25mm的范围内。
98.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干
细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和诱导性多能干细胞。在本公开的另一个实施例中，所述干细胞在10万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物的范围内。在本公开的又另一个实施例，所述干细胞在100万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物或1000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物或2000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到9000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物或3000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到8000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物或4000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到9000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物或5000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物的范围内。
99.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体，并且其中所述致敏间充质干细胞源性外泌体是源自角膜基质干细胞源性条件培养基致敏的间充质干细胞的外泌体。在本公开的另一个实施例中，所述外泌体的浓度在每毫升所述生物墨水调配物5亿个外泌体到每毫升所述生物墨水调配物250亿个外泌体的范围内。在本公开的又另一个实施例中，所述外泌体的浓度在每毫升10亿到200亿个或30亿到200亿个或50亿到200亿个或100亿到250亿个的范围内。
100.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括：(i)选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和诱导性多能干细胞；以及(ii)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体，并且其中所述致敏间充质干细胞源性外泌体是源自角膜基质干细胞源性条件培养基致敏的间充质干细胞的外泌体。在本公开的另一个实施例中，所述干细胞在10万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物、100万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物或1000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物或2000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到9000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物或3000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到8000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物或4000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到9000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物或5000万个细胞/毫升所述生物墨水调配物到1亿个细胞/毫升所述生物墨水调配物的范围内，并且其中所述外泌体的浓度在每毫升5亿到250亿个、10亿到200亿个或30亿到200亿个或50亿到200亿个或100亿到250亿个的范围内。
101.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内。在本公开的另一个实施例中，所述生物墨水调配物的粘度在1750cp到5200cp或1800cp到5100cp或1900cp到5000cp、2100cp到4800cp或2300cp到5000cp或2500cp到5300cp或2000cp到5300cp的范围内。
102.在本公开的一实施例中，提供了一种用于制备如本文所述的生物墨水调配物的方
法，其中所述方法包括：(a)使分子量在30kda到300kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性透明质酸和分子量在10kda到80kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性胶原蛋白肽以及bloom值在50到325的范围内的明胶接触，以获得第一混合物；以及(b)使所述第一混合物与光激活剂接触，以获得所述生物墨水调配物。在本公开的另一个实施例中，使所述改性透明质酸、所述改性胶原蛋白肽和明胶接触是在黑暗条件下在33℃到38℃的范围内的温度下持续30分钟到300分钟的范围内的时间段进行的，以获得所述第一混合物。在本公开的又另一个实施例中，所述接触是在34℃到38℃或35℃到38℃或36℃到38℃的范围内的温度下进行的，并且其中所述时间段在40分钟到280分钟或50分钟到250分钟或75分钟到225分钟或100分钟到200分钟的范围内。
103.在本公开的一实施例中，提供了一种用于制备如本文所述的生物墨水调配物的方法，其中所述方法包括：(a)使分子量在30kda到300kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性透明质酸和分子量在200kda到300kda的范围内且取代度在10％到80％的范围内的改性胶原蛋白以及bloom值在50到325的范围内的明胶接触，以获得第一混合物；以及(b)使所述第一混合物与光激活剂接触以获得所述生物墨水调配物。在本公开的另一个实施例中，使所述改性透明质酸、所述改性胶原蛋白和明胶接触是在黑暗条件下在33℃到38℃的范围内的温度下持续30分钟到300分钟的范围内的时间段进行的，以获得所述第一混合物。在本公开的又另一个实施例中，所述接触是在34℃到38℃或35℃到38℃或36℃到38℃的范围内的温度下进行的，并且其中所述时间段在40分钟到280分钟或50分钟到250分钟或75分钟到225分钟或100分钟到200分钟的范围内。
104.在本公开的一实施例中，提供了一种用于制备如本文所述的生物墨水调配物的方法，其中所述方法包括：(a)使第一聚合物和第二聚合物以及增稠剂接触以获得第一混合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白和改性胶原蛋白，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐；以及(b)使所述第一混合物与光激活剂接触以获得所述生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内。在本公开的另一个实施例中，使所述第一聚合物、所述第二聚合物和所述增稠剂接触是在黑暗条件下在33℃到38℃的范围内的温度下持续30分钟到300分钟的范围内的时间段进行的，以获得所述第一混合物。在本公开的又另一个实施例中，所述接触是在34℃到38℃或35℃到38℃或36℃到38℃的范围内的温度下进行的，并且其中所述时间段在40分钟到280分钟或50分钟到250分钟或75分钟到225分钟或100分钟到200分钟的范围内。
105.在本公开的一实施例中，提供了一种包括如本文所述的生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜。
106.在本公开的一实施例中，提供了一种包括生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜，所述调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在3.1％到5％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微
透镜的重量百分比在8％到20％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物打印的角膜微透镜的浓度范围为0.01％到15％，优选地相对于所述生物打印的角膜微透镜的浓度范围为5％到10％。
107.在本公开的一实施例中，提供了一种包括生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜，所述调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在3.1到5％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在8％到20％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物打印的角膜微透镜的浓度范围为0.01％到15％，优选地相对于所述生物打印的角膜微透镜的浓度范围为5％到10％。
108.在本公开的一实施例中，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物墨水调配物；(b)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(c)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
109.在本公开的一实施例中，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法包括：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
110.在本公开的一实施例中，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法包括：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范
围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
111.在本公开的一实施例中，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法包括：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
112.在本公开的一实施例中，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物墨水调配物；(b)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(c)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜，其中所述打印是使用3d打印机进行的。
113.在本公开的一实施例中，提供了一种用于获得生物打印的角膜微透镜的方法，所述方法如本文所述，其中将第一混合物打印在支架之上是在22℃到30℃的范围内的温度下、在5kpa到80kpa的范围内的挤出压力下以及以1毫米/秒到20毫米/秒的范围内的速度完成的。在本公开的另一个实施例中，将第一混合物打印在支架之上是在22℃到29℃或22℃到28℃或22℃到27℃或22℃到26℃或22℃到25℃或22.2℃到27℃的范围内的温度下完成的，并且其中速度在2毫米/秒到18毫米/秒或5毫米/秒到16毫米/秒或7毫米/秒到12毫米/秒的范围内。
114.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(a)获得如本文所述的生物墨水调配物；(b)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(c)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
115.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性
胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
116.在本公开的一实施例中，提供了一种通过如本文所述的方法获得的生物打印的角膜微透镜，其中重量百分比为60％到65％的明胶在体外条件下经20小时到25小时的时间段从所述生物打印的角膜微透镜中浸出。在另一个实施例中，60％到64％的明胶经20小时到24小时的范围内的时间段被浸出。在又另一个实施例中，体外条件是指生物打印的角膜微透镜储存在其中的合适培养基。体外条件也可以是合适的培养基。
117.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
118.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；(c)增稠剂，所述增稠剂选自由以下组成的组：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐，其中所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。在本公开的另一个实施例中，光的强度在75mw/cm2到150mw/cm2或80mw/cm2到140mw/cm2或90mw/cm2到140mw/cm2或95mw/cm2到130mw/cm2的范围内，并且其中时间段在2分钟到12分钟或4分钟到10分钟或5分钟到15分钟的范围内。
119.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；以及(d)选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和诱导性多能干细胞；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。
120.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；以及(d)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。
121.在本公开的一实施例中，提供了一种通过包括以下的方法获得的生物打印的角膜微透镜：(i)获得生物墨水调配物，所述生物墨水调配物包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml，优选地相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为50mg/ml到100mg/ml；(d)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体；以及(e)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体；(ii)将所述生物墨水调配物打印在支架之上，以获得打印的角膜结构；以及(iii)将所述打印的角膜结构暴露于波长在420nm到570nm的范围内且强度在50mw/cm2到150mw/cm2的范围内的光，持续1分钟到15分钟的范围内的时间段，以获得所述生物打印的角膜微透镜。
122.在本公开的一实施例中，提供了一种用于治疗受试者的角膜缺损的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物打印的角膜微透镜；以及(b)将所述生物打印的角膜微
透镜植入在所述角膜缺损的部位处，以治疗所述受试者的所述角膜缺损。
123.在本公开的一实施例中，提供了一种用于治疗受试者的角膜缺损的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物打印的角膜微透镜；以及(b)将所述生物打印的角膜微透镜植入在所述角膜缺损的部位处，以治疗所述受试者的所述角膜缺损，其中向所述受试者施用药学上可接受量的包括以下的调配物：(i)选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体；以及(ii)临床批准的滴眼剂调配物，并且其中所述施用是在植入所述生物打印的角膜微透镜之前或之后进行的。
124.在本公开的一实施例中，提供了一种用于治疗受试者的角膜缺损的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的生物打印的角膜微透镜；以及(b)将所述生物打印的角膜微透镜植入在所述角膜缺损的部位处，以治疗所述受试者的所述角膜缺损，其中向所述受试者施用药学上可接受量的包括以下的调配物：(i)选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体；以及(ii)临床批准的滴眼剂调配物，并且其中所述施用是在植入所述生物打印的角膜微透镜之前或之后进行的，并且其中所述外泌体选自由以下组成的组：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体，并且其中所述外泌体的浓度在每毫升所述调配物5亿个外泌体到每毫升所述调配物250亿个外泌体的范围内，并且其中所述临床批准的调配物包括至少一种选自由以下组成的组的聚合物：透明质酸、羧甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、丙二醇和海藻酸盐。
125.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其中所述生物打印的角膜微透镜的厚度在10微米到500微米的范围内。在本公开的另一个实施例中，厚度在20微米到490微米或50微米到500微米或50微米到450微米或75微米到400微米或100微米到500微米或100微米到400微米或200微米到400微米或250微米到500微米的范围内。
126.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其中明胶从所述微透镜中逐渐浸出。在另一个实施例中，60％到65％的明胶经22小时到24小时的时间段被浸出。
127.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其中所述生物打印的角膜微透镜对350nm到750nm的可见光的透射率在80％到99％的范围内。在本公开的另一个实施例中，透射率在82％到99％或84％到99％或86％到99％或88％到99％或90％到99％或92％到99％或94％到99％的范围内。
128.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其中所述生物打印的角膜微透镜在合适的条件下在30天内的降解百分比在2％到40％的范围内。
129.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其中所述生物打印的角膜微透镜的压缩模量在100kpa到650kpa的范围内。在本公开的另一个实施例中，压缩模量在150kpa到650kpa或200kpa到650kpa或250kpa到650kpa或300kpa到650kpa或350kpa到650kpa或400kpa到650kpa的范围内。
130.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其中
所述生物打印的角膜微透镜的拉伸强度在2kpa到50kpa的范围内。
131.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其用于治疗受试者的角膜缺损。
132.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物打印的角膜微透镜，其用于用于测试药物毒性的体外研究以及疾病建模。
133.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其用于制备生物打印的角膜微透镜。
134.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括至少一种来自脱细胞细胞外基质的组分。
135.在本公开的一实施例中，提供了一种如本文所述的生物墨水调配物，其中所述生物墨水调配物进一步包括至少一种细胞源性组分。
136.在本公开的一实施例中，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在1％到25％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内。在本公开的另一个实施例中，改性透明质酸的分子量在35kda到250kda或35kda到200kda或40kda到175kda或40kda到150kda或40kda到125kda或40kda到100kda或40kda到75kda的范围内并且取代度在20％到80％或25％到75％或30％到70％或35％到65％或40％到60％的范围内，并且相对于生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.5％到10％或1％到8％或2％到6％或2.5％到5％的范围内。在本公开的又另一个实施例中，改性胶原蛋白肽的分子量在20kda到75kda或25kda到70kda或30kda到65kda或35kda到60kda或40kda到60kda的范围内并且取代度在20％到70％或30％到60％或35％到60％或40％到60％的范围内，并且相对于生物打印的角膜微透镜的重量百分比在5％到25％或10％到25％或10％到20％的范围内。在本公开的替代实施例中，明胶的重量百分比在0.05％到15％或2％到15％或5％到15％或5％到10％的范围内。
137.在本公开的一实施例中，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到75％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在5％到50％的范围内；以及(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内。
138.在本公开的一实施例中，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到
80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在1％到25％的范围内；(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内；以及(d)选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和诱导性多能干细胞。
139.在本公开的一实施例中，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在1％到25％的范围内；(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内；(d)选自由以下组成的组的干细胞：人角膜基质干细胞、人角膜缘干细胞、人骨髓源性间充质干细胞、脂肪组织源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、华顿氏胶源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和诱导性多能干细胞；以及(e)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体。
140.在本公开的一实施例中，提供了一种生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜包括：(a)改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.2％到10％的范围内；(b)改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在1％到25％的范围内；(c)明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物打印的角膜微透镜的重量百分比在0.01％到15％的范围内；以及(d)选自由以下组成的组的外泌体：初始间充质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和角膜基质干细胞源性外泌体。
141.实例
142.现在将利用工作实例来说明本公开，所述工作实例旨在说明本公开的工作并且不旨在限制性地暗示对本公开的范围的任何限制。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于所公开的方法和组合物的实践，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。应当理解，本公开不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。
143.实例1
144.本公开中所使用的材料
145.本公开中所使用的聚合物和其它材料是可商业获得的。表1描绘了材料的商业来源。
146.表1：
[0147][0148]
甲基丙烯酸酯化透明质酸(ha-ma)是从creativepeg works公司获得的，并且硫醇化重组胶原蛋白肽(rcp-sh)是从富士胶片株式会社获得的。尽管本文已经提及成分的非限制性列表，然而，出于本公开的目的，本领域的技术人员可以使用来自任何商业来源的任何类似成分。
[0149]
组分的分子量是基于由商业供应商提供的分析证书。根据供应商的信息，33kda的ha-ma的取代度为大约50％并且纯度为95％。根据供应商的信息，50kda的ha-ma的取代度为大约47％并且纯度为95％。
[0150]
下文涵盖了可以用作生物打印的微透镜的一部分或可以用于培养以获得条件培养基的细胞以及外泌体。
[0151]
原代成体干细胞的来源：
[0152]
人角膜基质干细胞(内部)；来自rooster bio公司的骨髓间充质干细胞(bm-msc)；来自evercyte gmbh公司的人角膜上皮细胞、脂肪源性、脐带源性、牙髓源性和华顿氏胶源性msc。
[0153]
永生化成体干细胞的来源：
[0154]
1.通过携带htert基因的质粒的非病毒基因转移，从分离自松质骨(胸骨)的间充质干细胞开发了端粒化人骨髓源性间充质干细胞系(bm-msc/tert277)。通过使用新霉素磷酸转移酶作为可选择标志物和添加硫酸遗传霉素来选择阳性转染的细胞。将细胞系连续培养超过25次群体倍增而不显示生长迟缓或复制衰老的迹象。
[0155]
2.在无外源物质的条件下根据原代组织解聚到htert的非病毒转移建立了端粒化人华顿氏胶源性间充质干细胞系(wj-msc/tert273)。
[0156]
细胞系的特征在于无限生长，同时维持细胞类型特异性标志物的表达和功能，如：
[0157]-典型的间充质形态
[0158]-典型的间充质干细胞标志物，如cd73、cd90和cd105的表达
[0159]-对脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞的分化潜力
[0160]-产生具有血管生成和抗炎活性的细胞外囊泡。
[0161]
上面提及的生物细胞仅是本公开的一些可能的实施例，然而，这是非限制性列表，并且符合要求的任何其它细胞可以用作本公开的一部分。
[0162]
在本部分中在本公开中提及的分子量和取代度是在如由供应商提供的相应成分的分析证书中提及的细节。例如，ha-ma的“33kda”是指如由供应商提供的33kda分子量的ha-ma聚合物，类似的情况是取代度为例如50％dos是指如由供应商提供的50％取代度。
[0163]
实例2
[0164]
生物墨水调配物和其制剂
[0165]
本实例描述了用于获得生物墨水调配物的策略，所述生物墨水调配物适于用作3d打印机中的墨水并且还给出了生物墨水和生物打印的角膜微透镜的令人期望的特性。
[0166]
对于使用确定直径的喷嘴生物打印聚合物溶液(生物墨水调配物)，墨水(生物墨水调配物)应该足够粘以支持打印参数，从而获得所需产品(生物打印的角膜微透镜)。评估以下两种主要组分以不同的分子量和浓度组合的混合：甲基丙烯酸酯化透明质酸(ha-ma)和硫醇化重组胶原蛋白肽(rcp-sh)，以获得具有在1690cp到5300cp的范围内的足够粘度的令人期望的生物墨水。
[0167]
生物墨水调配物的制备
[0168]
可以将官能化的透明质酸(ha)与官能化的rcp以所需浓度比混合并溶解以获得盐水中的均相溶液。在第一种方法中，光引发剂可以即将在生物打印过程之前与聚合物混合物以单剂量混合(图1a)，这导致产生限制生物墨水的可打印性的低粘度溶液。在第二种方法中，光引发剂(伊红溶液)可以以2个步骤添加到聚合物中。这里首先添加10％体积的伊红并与聚合物混合物温育过夜，以得到半凝胶溶液。这种半凝胶溶液具有较高的粘度，这极大地增强了生物墨水的可打印性。即将在生物打印过程之前添加其余体积的光引发剂(图1b)。这种方法增强了给定浓度范围的可打印性范围，否则其对于生物打印将具有较小的粘度，并且恢复生物打印的微透镜的物理和生物性质。然而，用半凝胶方法观察到不一致的结果，因为结果在短时间段后不稳定，从而导致预凝胶溶液在打印盒内部高度易于凝胶化。因此，评估了第三种方法，其中使用增稠剂来增加聚合物溶液的总粘度，以使其达到可打印范围内，并且在打印之后可以容易地将其浸出(图1c)。根据增稠剂的类型，可以通过调节温度、洗涤或通过使用温和的化学品从外部控制其去除。实际上，聚合物溶液(生物墨水调配物)的可打印性可以通过改变增稠剂的浓度而容易地控制，而不需要增加生物聚合物浓度，所述生物聚合物浓度将使基质变硬并且使细胞难以生长，并且其在打印之后的去除恢复了预期的基质特性。
[0169]
生物墨水调配物中的ha-ma和rcp-sh的分子量
[0170]
为了确保如此开发的生物墨水具有对于生物打印必需的性质，基于以下变量进行一系列实验：ha-ma的分子量(33kda到250kda)、用甲基丙烯酸酯基团的取代度(dos)(30％或50％)以及与不同浓度的硫醇化重组胶原蛋白肽(rcp-sh)的组合。
[0171]
用于实验的生物打印机是cellink其压力范围为0kpa到200kpa，并且可以打印粘度高达约100,000cp(＝1000pa-s)的生物墨水。为了确保所开发的生物墨水具有期望粘度，选择在粘度方面具有广泛差异但仍可打印的两个参考标准，如测试墨水(65,000cp)和海藻酸盐(2％)+明胶(4％)调配物(2126cp)。
[0172]
由于聚合物溶液的粘度取决于其分子量和浓度，因此分析了具有不同分子量(250kda、50kda和33kda)和取代度(dos)(30％和50％)的ha-ma。所评估的粘度范围是基于溶液的稳定性和易操作性来决定的。
[0173]
图2描绘了通过采用如图1a中所描述的方法获得的生物墨水调配物的结果。结果(图2)表明，对于具有同一聚合物浓度的生物墨水调配物，粘度与其分子量成正比。使用40mg/ml到60mg/ml的250kda ha-ma制备的溶液显示出在所要求范围内的粘度值，而取代度对粘度具有最小影响。
[0174]
基于粘度的具有rcp-sh(约51kda)的250kda ha-ma(dos 30％)或50kda ha-ma(50％dos)的浓度
[0175]
生物墨水调配物的粘度通过改变具有50mg/ml rcp-sh(dos 50％)的250kda ha-ma(30％dos)的浓度来评估。为了进一步研究光引发剂(伊红)添加模式的影响，将0.2μl伊红添加到生物墨水调配物中并温育过夜，随后在生物打印过程之前添加其余的1.8μl伊红(如图1b中所描述的)。在第二种方法中，仅在生物打印之前添加2μl伊红(如图1c中所描述的)。
[0176]
结果(图3)揭示，聚合物组分的过夜温育显著增加了溶液(通过图1b中所公开的方法获得的生物墨水)的粘度。发现较高浓度的ha-ma(50mg/ml和60mg/ml)与50mg/ml rcp-sh溶液是不稳定的并且在可以测量粘度之前发生凝胶化。然而，发现含有低浓度(10mg/ml和20mg/ml)的ha-ma的溶液的粘度相应地低，这又导致在打印和交联过程期间凝胶在模具中心处的积累。无论是否预先添加伊红，具有30mg/ml和40mg/ml ha-ma的溶液都会产生期望范围内的粘度。
[0177]
如上所述的方法不产生具有所有令人期望的质量的生物墨水调配物，因此，评估了另外两种方法。首先是半凝胶法，在所述半凝胶法中，将组分混合在一起并允许通过将组分一起温育更长时间来形成更粘稠的溶液(半凝胶)。这导致粘度增加，但是预凝胶混合物非常不稳定并且没有为生物打印溶液提供足够的时间。第二种方法涉及使用增稠剂，所述增稠剂除了改进粘度之外，还提供了对预凝胶溶液的热响应稳定性。
[0178]
关于添加增稠剂的粘度评估结果(图4)还揭示了粘度是增稠剂浓度的函数。将ha-ma(250kda)/rcp-sh的浓度保持固定为30/80(mg/ml)并且评估添加甲基纤维素(mc，14kda)对37℃下溶液粘度的影响揭示了mc的浓度必须是20mg/ml或更高才能使溶液的粘度增加至少2倍。
[0179]
然而，当明胶(中等bloom，40kda到50kda)用作基于50kda ha-ma的体系的增稠剂时，观察到除了明胶的浓度之外，降低温度也对生物墨水调配物的粘度具有显著影响。根据图1c中所公开的方法制备生物墨水。本文所使用的明胶属于bloom值在175到225的范围内的中等bloom，所述bloom值转化为40kda到50kda的范围。
[0180]
实例3
[0181]
生物墨水调配物的打印和增稠剂的作用
[0182]
使用生物墨水调配物获得生物打印的角膜微透镜的方法
[0183]
用于实验的生物打印机是cellink其压力范围为0kpa到200kpa，并且可以打印粘度高达约100,000cp(＝1000pa-s)的生物墨水。为了确保所开发的生物墨水具有期望粘度，选择在粘度方面具有广泛差异但仍可打印的两个参考标准，如测试墨水(65,000cp)和海藻酸盐(2％)+明胶(4％)调配物(2126cp)。
[0184]
图5以示意性方式描绘了过程。将生物墨水转移到具有22g喷嘴的注射器(打印头)中。在需要细胞的情况下，将生物墨水连同细胞一起转移到注射器中。基于由软件提供的打
印速度、压力、形状等输入，打印头将在模具(支架)之上移动，从而挤出注射器的内容物。将打印的结构暴露于波长为470nm到570nm的高强度光(100mw/cm2)，持续4分钟到5分钟的总时间，以产生生物打印的角膜微透镜。这可以从模具中去除并转移到培养基中，用于将封装细胞(在使用细胞的情况下)维持在其所需的生理状态。
[0185]
生物墨水调配物的可打印性评估
[0186]
将增稠剂以不同的浓度添加到生物聚合物溶液中，以获得不同的生物墨水调配物，并且评估生物墨水调配物的可打印性(表2和3，图6a)。使用不同浓度的mc与30mg/ml的250kda ha-ma(30％dos)以及80mg/ml的50kda rcp-sh(50％dos)作为生物墨水打印的微透镜导致软且脆的无法保持形状并在从模具中去除时分解的微透镜(图6a(i))。进一步增加生物聚合物浓度是不可能的，因为溶液在添加光引发剂时会变得太粘稠且不稳定。因此，使用较低分子量的ha-ma，其中浓度范围可以根据需要增加。使用60mg/ml明胶(中等bloom，40kda到50kda)与50mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)和80mg/ml的50kda rcp-sh(50％dos)组合作为生物墨水打印的微透镜在不同温度下提供良好的可打印性但很脆(图6a(ii))。
[0187]
然而，在将生物聚合物组合改变为35mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)和150mg/ml的50kda rcp-sh(50％dos)时，结果是正面的，因为完整的微透镜可以成功地从模具中去移除(图6a(iii))。连续打印10分钟时获得的微透镜仅需要间歇性地少量温度变化就能获得同一输出。相应地调整打印参数以在生物打印期间实现层流。图6b中示意性地表示了层流在生物打印过程中的重要性。如图6a(i、ii和iii)所示，打印的微透镜的厚度为大约400微米且直径为14mm。
[0188]
表2：用甲基纤维素(14kda，约30％dos)作为增稠剂打印的微透镜
[0189][0190]
表3：用明胶(中等bloom，40kda到50kda)作为增稠剂打印的微透镜
[0191][0192]
如从表2和3中可以观察到的，明胶是待用于期望的生物墨水调配物中的优选增稠剂。在表3中，观察表中描述的打印温度，可以理解，打印生物墨水的温度起着至关重要的作用。22.5℃和25℃的温度提供了期望的生物打印的角膜微透镜。然而在较高温度下，墨水是不可打印的(图6a(iii))。另外，可以观察到，通过使用35mg/ml的ha-ma(50kda，dos 50％)和150mg/ml的rcp(50kda，dos 50％)获得的生物打印的角膜微透镜提供了最佳结果。
[0193]
生物打印的角膜微透镜的压缩模量
[0194]
类似于实例1中提及的制备生物墨水调配物中的修改，评估了将光引发剂(伊红)添加到聚合物溶液中的不同模式对最终产品(生物打印的角膜微透镜)的物理性质(压缩模量)的影响。
[0195]
使用biss机械测试仪以1毫米/分钟的速率进行压缩研究，直到最大应变为50％。反过来，压缩模量是根据应力(kpa)对应变(毫米/毫米)曲线上的线性区域(0.1mm/mm到0.2mm/mm应变)的斜率计算的。
[0196]
与即将在水凝胶形成之前添加伊红的样品相比，向组件中添加伊红过夜未引起压缩模量的实质增加(图7)。对于40mg/ml的250kda ha-ma观察到最高的压缩模量，而发现20mg/ml和30mg/ml的ha-ma更具弹性但是显示压缩模量比天然角膜的压缩模量更低(约300kpa)。
[0197]
具有35/150mg/ml浓度的50kda ha-ma和rcp-sh的水凝胶的压缩模量在添加明胶(中等bloom，40kda到50kda，60mg/ml)时增加。本研究还描绘了在从打印的微透镜去除增稠剂之后，模量将仍足以维持其完整性并且执行所需的物理功能。基于以上所讨论的筛选实验，使用明胶作为基于ha-ma(50kda)和rcp-sh的生物墨水中的增稠剂提供了可打印性的再现性，同时满足材料要求。因此，使用50kda ha-ma/rcp-sh(35/150mg/ml)和60mg/ml明胶水凝胶/生物打印的微透镜作为可能的实施例之一进行进一步表征，但是也描述了其它组合。
[0198]
实例4
[0199]
包括50kda ha-ma(50％dos，35mg/ml)与50kda rcp-sh(50％dos，150mg/ml)和明胶(中等bloom，40kda到50kda，60mg/ml)的生物墨水的物理化学表征
[0200]
本实例描述了用于包括35mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)、150mg/ml的50kda rcp-sh(50％dos)以及60mg/ml的明胶(中等bloom—40kda到50kda)的生物墨水调配物的不同参数，其中使用如图1c和实例2中所描述的方法来制备生物墨水调配物。
[0201]
尽管本实例描述了生物墨水调配物以及通过包括35mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)、150mg/ml的50kda rcp-sh(50％dos)以及60mg/ml明胶(中等bloom—40kda到50kda)的生物墨水调配物获得的相应的生物打印的角膜微透镜，但可以设想，可以使用包括以下的生物墨水调配物：改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在10kda到80kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml。本领域的技术人员可以使用落入上述范围内的任何调配物。未提供良好结果的调配物已在表2和3中进行了解释。例如，生物墨水调配物包括：
[0202]
40mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；100mg/ml的50kda rcp(50％dos)；以及20mg/ml到100mg/ml的中等bloom明胶；或
[0203]
45mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；120mg/ml的50kda rcp(50％dos)；以及30mg/ml到75mg/ml的中等bloom明胶；或
[0204]
35mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；90mg/ml的50kda rcp(50％dos)；以及60mg/ml的中等bloom明胶；或
[0205]
32mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；180mg/ml的50kda rcp(50％dos)；以及30mg/ml到75mg/ml的中等bloom明胶；或者可以用于获得令人期望的生物墨水调配物和相应的生
物打印的角膜微透镜。类似地，聚合物的分子量也可以变化以适应需要。
[0206]
透射率研究
[0207]
对于透射率研究，使用在图1c中描述的并且在实例2中解释的方法来获得生物墨水调配物。使用35mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)、150mg/ml的50kda rcp-sh(50％dos)以及60mg/ml的明胶(中等bloom—40kda到50kda)来制备生物墨水调配物。作为对照，还制备了不使用明胶的生物墨水调配物。将生物墨水倾倒在96孔板(n＝3)的孔内并暴露在光以形成水凝胶。如本文所使用的水凝胶是指生物墨水的交联形式，其中通过暴露于强度在100mw/cm2到150mw/cm2的范围内的白光进行交联。使用与水凝胶等体积的盐水作为空白，在350nm到750nm的范围内进行吸光度扫描。最后，使用公式％t＝10^(2-abs)将吸光度读数转化为透射率并且在图表中表示(根据在wang等人,2015.《生物大分子(biomacromolecules)》2014,15,9,3421
–
3428.https://doi.org/10.1021/bm500969d中提及的协议)。相对于1x pbs，无论是否存在明胶，显示水凝胶对可见光的透射率为85％到99％(图8)。在可见光范围内，两个研究组的平均透射率值保持》94％(表4)。
[0208]
表4：平均透射率值
[0209]
序号50kda ha-ma(mg/ml)50kda rcp-sh(mg/ml)明胶透射率％135150694.67％235150094.63％
[0210]
溶胀曲线研究
[0211]
根据以下文献中发布的方法对生物打印的微透镜进行溶胀研究：sani,e.s.等人,2019,使用天然源性生物粘合剂水凝胶的角膜损伤的无缝合线修复(sutureless repair of corneal injuriesusing naturally derived bio-adhesive hydrogels),《科学进展(science advances)》,5(3),p.eaav1281。
[0212]
结果显示于(图9)中。在pbs中温育时，观察到水凝胶在6小时内最大溶胀为25.07％，之后水凝胶不会进一步溶胀。随后，在所有重复中都有明显的重量损失，这可以归因于明胶从水凝胶中的释放。
[0213]
明胶释放曲线
[0214]
在从本实例中研究的生物墨水调配物获得的生物打印的角膜微透镜(基于raut等人,2019.《材料科学杂志(journal of materials science)》,第54卷,第10457-10472页,https://doi.org/10.1007/s10853-019-03643-0)上研究明胶释放曲线。明胶从生物打印的微透镜的释放遵循相释放曲线，其中在第1相中，释放在前30分钟内具有爆发释放模式，在此之后存在3小时的逐渐增加，随后稳定减少，并且最终从6小时开始稳定。在22小时内，总共63.9％的明胶从微透镜释放(图10)。所获得的结果是来自不含明胶的ha-ma/rcp-sh(35/150mg/ml)水凝胶的归一化值，以避免来自蛋白质组分(rcp-sh)释放对定量的任何干扰。
[0215]
生物降解研究
[0216]
图11描绘了生物墨水调配物的水凝胶的降解曲线。简而言之，制备确定体积的水凝胶，冻干并称重(wi)。然后将重复的水凝胶在37℃下在pbs或ph为约7.4的盐水中温育，并且在定轨振荡器中振荡。在具体时间点，取出水凝胶，冻干并称重(wd)，并且将质量计算为重量损失或降解(％)＝(wi-wd)/wi
×
100(li 2006,《生物材料(biomaterials)》,https://
dx.doi.org/10.1016％2fj.biomaterials.2005.07.019)。
[0217]
水凝胶的降解最初是缓慢的，持续3天，在此之后速率增加，并且30.8％的水凝胶质量在第7天时被降解，并且此后速率几乎保持稳定(图11)。
[0218]
生物相容性-体外研究
[0219]
通过培养封装在预凝胶混合物内的供体源性clsc(每毫升300万个细胞)(图12)和bm-msc(图13)，并且利用细胞对墨水进行生物打印，评估所制备的水凝胶调配物引发角膜组织再生的适合性。细胞均匀地分布在水凝胶内，由此约80％的封装细胞在整个培养持续时间过程中都是活的。显示细长形态的细胞群从第9天开始出现，并且此后在包括clsc的生物墨水中略有增加。一些封装细胞朝向底部迁移并且已经在水凝胶表面上形成单层。然而，在bm-msc培养中，在第7天观察到一些细胞的细长形态。
[0220]
对于缺损部位处的完全组织再生，最重要的是基质干细胞维持其表型并且帮助伤口的无疤痕愈合，同时逐渐达到分化状态。在体外条件下，这种逐渐分化的过程可以通过检查对细胞生命周期的特定阶段具有特异性的生物标志物的表达来评估。cd90是由基质干细胞表达的一种此类生物标志物，而由细胞表达αsma将反映其对角质细胞或肌成纤维细胞的分化状态。所获得的结果(图14)显示包括clsc的生物墨水在培养中保持17天时表达cd90，并且不表达αsma。然而，在2d表面上培养的细胞显示出αsma的显著表达，这表明其分化表型。如本文所描绘的结果为生物打印的微透镜(从本实例的生物墨水调配物获得的)提供了显著的优点，即所述生物打印的微透镜可以抑制肌成纤维细胞分化并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。
[0221]
实例5
[0222]
包括50kda ha-ma(50％dos)与胶原蛋白ma(250kda colma，dos 29％)的生物墨水的物理化学表征
[0223]
尽管本实例描述了生物墨水调配物以及通过包括50kda ha-ma(50％dos)、250kda col-ma(29％dos)(无明胶)的生物墨水调配物获得的相应的生物打印的角膜微透镜，但可以设想，可以使用包括以下的生物墨水调配物：改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在200kda到300kda的范围内并且取代度在10％到80％的范围内；以及明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，其中明胶相对于生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml。不含明胶的水凝胶调配物在透射率和生物相容性方面给出了令人期望的结果(本实例的结果)，本领域的技术人员可以使用落入上述范围内的任何调配物。然而，需要明胶来获得生物墨水调配物的令人期望的粘度，从而能够对其进行打印以获得生物打印的角膜微透镜。因此，生物墨水调配物包括：
[0224]
60mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；10mg/ml的250kda col-ma(29％dos)；以及20mg/ml到100mg/ml的中等bloom明胶；或
[0225]
80mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；20mg/ml的250kda col-ma(29％dos)；以及40mg/ml到100mg/ml的中等bloom明胶；或
[0226]
60mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；10mg/ml的250kda col-ma(29％dos)；以及20mg/ml到100mg/ml的中等bloom明胶；或
[0227]
10mg/ml的50kda ha-ma(50％dos)；5mg/ml的50kda col-ma(50％dos)；以及30mg/
ml到75mg/ml的中等bloom明胶；或者可以用于获得令人期望的生物墨水调配物和相应的生物打印的角膜微透镜。
[0228]
透射率
[0229]
用于满足功能要求的任何角膜模拟材料的重要性质是透射率。图15示出了代表性生物墨水相对于单独组分在可见范围(400nm到700nm)内的光的透射率，其中1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)用作空白。从结果可以明显看出，单个组分和组合，即50/9mg/ml浓度的ha-ma/colma生物墨水显示出与pbs相当的透射率。
[0230]
生物相容性-体外研究
[0231]
将clsc封装在水凝胶(50mg/ml的dos为50％的50kda ha-ma和9mg/ml的dos为29％的250kda col-ma)内，以检查聚合物混合物和交联过程与在天然人角膜中发现的细胞的相容性。图16表示活细胞和死细胞的染色。结果表明，水凝胶基质具有高度的细胞相容性，并且组合物支持封装细胞的附着。
[0232]
对于缺损部位处的完全组织再生，最重要的是基质干细胞维持其表型并且帮助伤口的无疤痕愈合，同时逐渐达到分化状态。在体外条件下，这种逐渐分化的过程可以通过检查对细胞生命周期的特定阶段具有特异性的生物标志物的表达来评估。cd90是由基质干细胞表达的一种此类生物标志物，而由细胞表达αsma将反映其对角质细胞或肌成纤维细胞的分化状态。所获得的结果(图17)显示，在ha-ma/colma生物墨水(50mg/ml的dos为50％的50kda ha-ma，以及9mg/ml的dos为29％的250kda col-ma)中培养的clsc表现出cd90的更好表达和αsma的弱表达。然而，在2d表面(指玻璃盖玻片)上培养的细胞在培养中6天内显示出αsma的显著表达，这表明其分化表型。ha-ma/colma生物墨水抑制了肌成纤维细胞分化，并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。
[0233]
实例6
[0234]
使用包括“33kda”ha-ma(50％dos)/50kda rcp-sh(50％dos)的生物墨水调配物进行的研究
[0235]
评估所制备的具有75/125mg/ml和75/150mg/ml浓度比的33kda ha-ma(50％dos)和50kda rcp-sh(50％dos)的水凝胶调配物引发角膜组织再生的适合性。根据本实例的水凝胶是在没有明胶的情况下制备的，然而，可以设想具有明胶的水凝胶也将提供类似的结果。首先，研究了在水凝胶表面上使用角膜缘或角膜上皮细胞(lec或cec)的上皮再形成能力。其次，为了证明基质再生，将clsc封装在水凝胶内，并且在体外研究其活力、增殖能力和表型。
[0236]
上皮再形成研究
[0237]
为了证明ha-ma/rcp-sh水凝胶调配物(“33kda”，含有比率为75/125mg/ml和75/150mg/ml的ha-ma(33kda)/rcp-sh(50kda)的调配物)的生物相容性，将原代人cec接种并培养在水凝胶的表面上。在两周结束时，上皮细胞粘附并增殖在水凝胶的表面上，从而产生汇合单层(图18)。这一观察结果与用作阳性对照的2d盖玻片表面和gel-ma(200mg/ml)水凝胶相当。这一数据证明ha-ma/rcp-sh水凝胶充当可以促进角膜伤口愈合/体内再生的角膜模拟生物工程化的材料。
[0238]
基质再生：将clsc封装在水凝胶中
[0239]
通过在水凝胶表面上培养clsc，随后进行封装研究来评估水凝胶与clsc的相容
性，这将最终表明水凝胶的基质再生能力。
[0240]
图19表示当在水凝胶表面上培养5天时clsc的活力评估。从结果可以明显看出，细胞显示出快速增殖并在5天内覆盖水凝胶表面。此外，由染成绿色的细胞质标记的活细胞群显示培养环境与细胞增殖相容。ha-ma/rcp-sh水凝胶表面上的细胞生长高于用作阳性对照的gel-ma上的细胞生长，而这类似于盖玻片上的细胞。
[0241]
在将细胞封装在水凝胶基质中一周后，还评估了clsc的活力。图20中呈现绿色的细胞(由于活细胞摄取钙黄绿素-am)代表活细胞群。封装在ha-ma/rcp-sh水凝胶中的clsc在整个培养持续时间过程中都是有活力的，并且有活力的群体类似于2d盖玻片并且高于gel-ma(20％w/v或200mg/ml，其中dos大于95％)。此外，ha-ma/rcp-sh水凝胶的第3天图像中的插图显示，一些细胞已经开始获得细长形态，这由在2d表面上培养的细胞显示出来。图21显示，在ha-ma/rcp-sh水凝胶基质中培养的clsc显示出cd90的更好表达和αsma的弱表达，而在2d表面上培养的细胞显示出αsma的显著表达，这表明其分化表型。ha-ma/rcp-sh水凝胶抑制了肌成纤维细胞分化，并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。
[0242]
实例7
[0243]
生物墨水和包括外泌体的相应的生物打印的角膜微透镜
[0244]
作为本公开的实施方案，在存在干细胞连同聚合物ha-ma和rcp-sh以及增稠剂明胶的情况下，本文提供了生物墨水调配物和包括外泌体的相应的生物打印的角膜微透镜。通过先前的实例可以理解，生物墨水调配物和水凝胶允许干细胞生长并且是生物相容的，因此设想包含外泌体有助于干细胞的生长并且有助于伤口以无疤痕的方式愈合。
[0245]
作为另一种实施方案，本文还公开了生物墨水调配物和包括聚合物ha-ma和rcp-sh以及增稠剂明胶连同外泌体(在不存在干细胞的情况下)的相应的生物打印的角膜微透镜，并且设想其会提供令人期望的结果。
[0246]
实例8
[0247]
本公开的生物墨水调配物与已知的生物墨水调配物的比较
[0248]
本实例将如本公开中所公开的生物墨水调配物的某些参数与已知的生物墨水调配物的参数进行比较。
[0249]
表5：比较分析
[0250]
[0251]
从表5中可以观察到，与在提及的现有技术(ulag等人,2020)中所公开的人工角膜相比，本公开中所公开的生物墨水调配物产生了显著更优越的水凝胶/生物打印的角膜微透镜，其具有受控溶胀、更小降解以及更高透射率。
[0252]
实例9
[0253]
用于培养干细胞、获得经纯化外泌体的方法
[0254]
本公开还公开了以二维或三维方式培养干细胞以获得大量经扩增的干细胞的方面，以及用于生物医学应用的条件培养基。
[0255]
使用条件培养基来对高质量外泌体进行纯化。将如此获得的外泌体用于如本公开中所公开的生物墨水调配物中。
[0256]
细胞培养方法还包含用源自角膜缘干细胞的培养的条件培养基(被称为角膜基质干细胞源性条件培养基)致敏间充质干细胞，将通过致敏方法获得的间充质干细胞的条件培养基用于纯化要在本公开的生物墨水调配物中使用的外泌体。
[0257]
在pct申请：pct/in2020/050622和pct/in2020/050623中公开了用于获得经扩增干细胞以及获得细胞培养条件培养基的干细胞的培养的各个方面，进一步地，用于从条件培养基的分泌组获得外泌体的方法，所述申请以其整体并入本公开中。
[0258]
实例10
[0259]
治疗患有角膜缺损的受试者的方法
[0260]
如本公开中所公开的生物打印的角膜微透镜可以进一步用于治疗患有角膜缺损的受试者。角膜缺损或病症可以选自由以下组成的组：传染性角膜炎、炎性病症、遗传性角膜上皮-基质营养不良、退行性病状和创伤诱导的损伤。可以用如本公开中所公开的生物打印的角膜微透镜治疗可能引起角膜失明的角膜病症。所述方法包括向有需要的受试者植入生物打印的角膜微透镜。生物打印的角膜微透镜可以根据islam等人,生物材料使供体组织移植排斥反应高风险患者的角膜再生(biomaterials-enabled cornea regeneration in patients at high risk for rejection of donor tissue transplantation.),《npj再生医学杂志(npj regen med)》3,2(2018).https://doi.org/10.1038/s41536-017-0038-8中提及的方法在患者身上缝合。
[0261]
治疗方法可以包含或可以不包含提供包括以下的调配物的步骤：包括：(i)选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体；以及(ii)临床批准的滴眼剂调配物。临床批准的滴眼剂调配物可以选自由以下组成的组：
[0262]
1.(透明质酸钠，0.1％到0.3％溶液)
[0263]
2.refresh(羧甲基纤维素，0.5％溶液)
[0264]
3.systane(聚乙二醇，mw 400，0.4％溶液)
[0265]
4.人工泪液溶液(聚乙烯醇，1.4％溶液)
[0266]
5.systane(丙二醇，0.6％溶液)
[0267]
6.la(基于海藻酸盐)
[0268]
另外，治疗方法可以涉及提供调配物作为独立治疗选择。
[0269]
本公开的优点
[0270]
本公开提供了具有仿生、生物相容性和生物可降解的令人期望的特征的生物工程化的生物墨水和生物打印的角膜基质微透镜。此外，如本文所述的生物墨水调配物在优选的粘度范围内，以允许易于进行3d打印，从而获得生物打印的角膜微透镜。生物墨水以及生物打印的角膜微透镜促进无疤痕角膜愈合，由此产生如本公开所述的移植后透明角膜。另一个显著优点是，本公开公开了使用透明质酸(其是一种存在于眼睛中的天然组分)的透明可缝合的3d生物打印的角膜微透镜可以用作用部分或全层移植移植物替换患病/损伤角膜的可行治疗选择。因此，生物打印的角膜微透镜是仿生微透镜，所述仿生微透镜在治疗方面肯定是有利的。在生物打印的角膜微透镜中包含外泌体和/或干细胞可以进一步有助于为患有广泛角膜缺损的受试者提供再生治疗选择。如本文所述的生物打印的角膜微透镜连同如pct申请第pct/in2020/050622号中公开的三维细胞培养的过程连同如pct申请第pct/in2020/050623号中公开的间充质干细胞的致敏方面可以潜在地满足许多有需要的受试者的要求。
[0271]
由于生物打印的角膜微透镜是仿生的，因此其也可以用作用于研究药物毒性的模型。此外，微透镜还可以用于研究和更好地理解各种角膜疾病/缺损，并且有助于推进研究。如本文所公开的生物打印的角膜微透镜可以用作研究药物毒性的工具，并且还可以用作理解疾病进展和机制的工具(疾病建模)。
[0272]
本公开公开了具有仿生、生物相容性和生物可降解的令人期望的特征的生物工程化的生物墨水调配物和生物打印的角膜微透镜。本公开还公开了生物墨水调配物，其包括：(a)第一聚合物，所述第一聚合物选自由以下组成的组：改性透明质酸、改性聚乙二醇、改性聚乙烯醇、改性聚(n-异丙基丙烯酰胺)、改性海藻酸盐、丝以及改性丝；(b)第二聚合物，所述第二聚合物选自由以下组成的组：胶原蛋白肽、改性胶原蛋白肽、胶原蛋白以及改性胶原蛋白；以及(c)选自由以下组成的组的增稠剂：明胶、改性纤维素、结冷胶、黄原胶、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯醇和海藻酸盐，所述生物墨水调配物的粘度在1690cp到5300cp的范围内。
[0273]
本文还公开了生物墨水调配物，其包括：改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到100kda的范围内并且取代度在30％到70％的范围内；改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在30kda到70kda的范围内并且取代度在30％到70％的范围内；以及明胶，所述明胶的bloom值在50到325的范围内，并且相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为0.1mg/ml到150mg/ml。生物墨水调配物进一步包括用于引发聚合物交联的光引发剂(0.5-1x伊红)。将一定强度的白光照射在生物墨水上，以进一步完成交联过程。生物墨水调配物进一步包括选自由以下组成的组的干细胞：人骨髓间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、脐带间充质干细胞、华顿氏胶间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞和角膜缘干细胞源性条件培养基致敏的间充质干细胞。另外，生物墨水调配物还包括选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体。生物墨水调配物还可以在不存在干细胞的情况下包括外泌体。此外，本文公开了一种用于获得生物墨水调配物的方法。另外，本公开提供了一种包括如本文所述的生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜。由上述生物墨水调配物获得的生物打印的角膜微透镜提供了受控溶胀和高拉伸强度。另外，生物打印的角膜微透镜还具有抗生物降解性(在体外条件下30天内2％到40％)，并且表现出的透射率超过93％。由此获得的生物打印的角
膜微透镜促进干细胞的生长(生物相容性)，并且还促进了上皮形成和基质再生，从而提供治愈角膜组织中的瘢痕的机会。此外，生物打印的角膜微透镜和/或水凝胶抑制了肌成纤维细胞分化，并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。水凝胶/角膜微透镜中外泌体的存在进一步支持再生治疗。因此，本公开提供了生物墨水调配物以及具有拉伸强度、压缩模量、透射率、受控溶胀和抗降解性的期望特性的对应的生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜可以用于治疗受试者的角膜缺损以促进无疤痕伤口愈合。
[0274]
本文还公开了生物墨水调配物，其包括：改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在40kda到70kda的范围内并且取代度在30％到70％的范围内；改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在30kda到70kda的范围内并且取代度在20％到70％的范围内；以及明胶，所述明胶的bloom值在175到225的范围内，并且相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为40mg/ml到80mg/ml。生物墨水调配物进一步包括用于引发聚合物交联的光引发剂(0.5-1x伊红)。将一定强度的白光照射在生物墨水上，以进一步完成交联过程。生物墨水调配物进一步包括选自由以下组成的组的干细胞：人骨髓间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、脐带间充质干细胞、华顿氏胶间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞和角膜缘干细胞源性条件培养基致敏的间充质干细胞。另外，生物墨水调配物还包括选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体。生物墨水调配物还可以在不存在干细胞的情况下包括外泌体。此外，本文公开了一种用于获得生物墨水调配物的方法。另外，本公开提供了一种包括如本文所述的生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜。由上述生物墨水调配物获得的生物打印的角膜微透镜提供了受控溶胀和高拉伸强度。另外，生物打印的角膜微透镜还具有抗生物降解性(在体外条件下30天内2％到40％)，并且表现出的透射率超过93％。由此获得的生物打印的角膜微透镜促进干细胞的生长(生物相容性)，并且还促进了上皮形成和基质再生，从而提供治愈角膜组织中的瘢痕的机会。此外，生物打印的角膜微透镜和/或水凝胶抑制了肌成纤维细胞分化，并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。水凝胶/角膜微透镜中外泌体的存在进一步支持再生治疗。因此，本公开提供了生物墨水调配物以及具有拉伸强度、压缩模量、透射率、受控溶胀和抗降解性的期望特性的对应的生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜可以用于治疗受试者的角膜缺损以促进无疤痕伤口愈合。
[0275]
本文还公开了生物墨水调配物，其包括：改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在30kda到50kda的范围内并且取代度在30％到70％的范围内；改性胶原蛋白肽，所述改性胶原蛋白肽的分子量在30kda到70kda的范围内并且取代度在20％到70％的范围内；以及明胶，所述明胶的bloom值在175到225的范围内，并且相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为40mg/ml到80mg/ml。生物墨水调配物进一步包括用于引发聚合物交联的光引发剂(0.5-1x伊红)。将一定强度的白光照射在生物墨水上，以进一步完成交联过程。生物墨水调配物进一步包括选自由以下组成的组的干细胞：人骨髓间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、脐带间充质干细胞、华顿氏胶间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞和角膜缘干细胞源性条件培养基致敏的间充质干细胞。另外，生物墨水调配物还包括选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体。生物墨水调配物还可以在不存在干细胞的情况下包括外泌体。此外，本文公开了一种用于获得生物墨水调配物的方法。另外，本公开提供了一种包括如本文所述的生
物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜。由上述生物墨水调配物获得的生物打印的角膜微透镜提供了受控溶胀和高拉伸强度。另外，生物打印的角膜微透镜还具有抗生物降解性(在体外条件下30天内2％到40％)，并且表现出的透射率超过93％。由此获得的生物打印的角膜微透镜促进干细胞的生长(生物相容性)，并且还促进了上皮形成和基质再生，从而提供治愈角膜组织中的瘢痕的机会。此外，生物打印的角膜微透镜和/或水凝胶抑制了肌成纤维细胞分化，并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。水凝胶/角膜微透镜中外泌体的存在进一步支持再生治疗。因此，本公开提供了生物墨水调配物以及具有拉伸强度、压缩模量、透射率、受控溶胀和抗降解性的期望特性的对应的生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜可以用于治疗受试者的角膜缺损以促进无疤痕伤口愈合。
[0276]
本文还公开了生物墨水调配物，其包括：改性透明质酸，所述改性透明质酸的分子量在35kda到70kda的范围内并且取代度在30％到70％的范围内；改性胶原蛋白，所述改性胶原蛋白的分子量在230kda到270kda的范围内并且取代度在20％到40％的范围内；以及明胶，所述明胶的bloom值在175到225的范围内，并且相对于所述生物墨水调配物的浓度范围为40mg/ml到80mg/ml。生物墨水调配物进一步包括用于引发聚合物交联的光引发剂(0.5-1x伊红)。将一定强度的白光照射在生物墨水上，以进一步完成交联过程。生物墨水调配物进一步包括选自由以下组成的组的干细胞：人骨髓间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、脐带间充质干细胞、华顿氏胶间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞和角膜缘干细胞源性条件培养基致敏的间充质干细胞。另外，生物墨水调配物还包括选自由以下组成的组的外泌体：角膜基质干细胞源性外泌体、致敏间充质干细胞源性外泌体和初始间充质干细胞源性外泌体。生物墨水调配物还可以在不存在干细胞的情况下包括外泌体。此外，本文公开了一种用于获得生物墨水调配物的方法。另外，本公开提供了一种包括如本文所述的生物墨水调配物的生物打印的角膜微透镜。由上述生物墨水调配物获得的生物打印的角膜微透镜提供了受控溶胀和高拉伸强度。另外，生物打印的角膜微透镜还具有抗生物降解性(在体外条件下30天内2％到40％)，并且表现出的透射率超过93％。由此获得的生物打印的角膜微透镜促进干细胞的生长(生物相容性)，并且还促进了上皮形成和基质再生，从而提供治愈角膜组织中的瘢痕的机会。此外，生物打印的角膜微透镜和/或水凝胶抑制了肌成纤维细胞分化，并且因此有可能支持角膜组织的无疤痕伤口愈合。水凝胶/角膜微透镜中外泌体的存在进一步支持再生治疗。因此，本公开提供了生物墨水调配物以及具有拉伸强度、压缩模量、透射率、受控溶胀和抗降解性的期望特性的对应的生物打印的角膜微透镜，所述生物打印的角膜微透镜可以用于治疗受试者的角膜缺损以促进无疤痕伤口愈合。如本公开中所描述的生物打印的角膜微透镜具有这样的性质：其中在20小时到25小时内，在体外条件下(在存在缓冲液或培养基的情况下)浸出按重量计总计约60％到65％的明胶。