肌肉组织再生剂

1.本发明涉及一种肌肉组织再生剂。


背景技术：

2.在现有文献1中，记载了一种组织或肌肉缺损等解剖学上的缺损用的可植入式假体。该假体可以使组织在假体内生长，并形成其与组织或肌肉之间的粘连，进而修补缺损区域。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：国际公开第2005/103158号


技术实现要素：

6.发明所要解决的问题
7.现有文献1中记载的假体具有细胞粘连性、术后粘连减少等对治疗有效的多个特征，但在肌肉细胞增殖的过程中所需的成肌细胞分化等过程未获得验证，因此认为在治疗效果方面尚有改进的余地。
8.此外，在假体的一部分中，为了修补而使用聚丙烯等材料，但由于这些材料无法生物降解而半永久地残留在体内，因此残留的材料可能会引起不希望的异物反应(血栓、感染、增厚、包被等)。此外，在用于处于成长过程中的幼儿的情况下，有时也需要在成长过程中将其取出。因此，需要开发一种使用具有生物降解性的材料来再生肌肉组织的材料。
9.本发明的目的在于提供一种肌肉组织再生剂，其含有丝心蛋白。
10.用于解决问题的方法
11.本发明涉及例如下述各发明。
12.1.13.一种肌肉组织再生剂，其中，其含有改造丝心蛋白。
14.2.15.根据[1]所述的肌肉组织再生剂，其中，其为肌肉组织缺损部位的修补和再生剂。
[0016]
[3]
[0017]
根据[1]或[2]所述的肌肉组织再生剂，其中，其为肌肉组织内的卫星细胞的活化剂。
[0018]
[4]
[0019]
根据[1]至[3]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其为成肌细胞向肌肉细胞的分化剂。
[0020]
[5]
[0021]
根据[1]至[4]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其为成肌细胞粘合剂。
[0022]
[6]
[0023]
根据[1]至[5]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，所述改造丝心蛋白为重组丝心蛋白，并且进一步包含在生产该重组丝心蛋白时使用的来源于宿主的物质。
[0024]
[7]
[0025]
根据[6]所述的肌肉组织再生剂，其中，所述宿主为原核生物。
[0026]
[8]
[0027]
根据[1]至[7]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其在哺乳动物体内可在80天内生物降解。
[0028]
[9]
[0029]
根据[1]至[8]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其进一步包含0.01～50质量％的醇、二甲基亚砜中的一种或两种。
[0030]
[10]
[0031]
根据[1]至[9]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，所述改造丝心蛋白是改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0032]
[11]
[0033]
根据[1]至[10]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，所述改造丝心蛋白的疏水性指标的平均值(平均hi)为0以下。
[0034]
[12]
[0035]
根据[1]至[11]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其为选自腹壁切口疝、膈疝、腹股沟疝、残端形成部、褥疮部、创伤部中的任意一种的治疗剂。
[0036]
[13]
[0037]
根据[1]至[12]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其为薄膜、片材、纤维、树脂成形体、粉末和凝胶中的任意1种或它们的多种组合形态。
[0038]
[14]
[0039]
根据[1]至[13]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，其为薄膜和片材中的任意1种或它们的多种组合形态。
[0040]
[15]
[0041]
一种处于需要肌肉组织再生的状态的治疗方法，其中，其包括将[1]至[14]中任一项所述的肌肉组织再生剂与人以外的动物的肌肉细胞的缺损部位相接触的步骤。
[0042]
[16]
[0043]
根据[1]至[14]中任一项所述的肌肉组织再生剂，其中，以肌肉组织再生剂的总质量为基准，改造丝心蛋白的含量为5质量％以上100质量％以下。
[0044]
[17]
[0045]
根据[15]所述的治疗方法，其中，以肌肉组织再生剂的总质量为基准，改造丝心蛋白的含量为5质量％以上100质量％以下。
[0046]
发明效果
[0047]
根据本发明，提供一种含有改造丝心蛋白的肌肉组织再生剂。其可起到修补和再生缺损部位的作用，并具有组织再生后在体内降解的特征。
附图说明
[0048]
图1是表示蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列的一例的示意图。
[0049]
图2是表示蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列的一例的示意图。
[0050]
图3是表示蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列的一例的示意图。
[0051]
图4是表示对术后第6周的腹壁缺损部进行修补后的部位的组织的图片。发现严重炎症1，还确认到薄膜2的残留。在其与已知的骨骼肌的边界处也发现了细骨骼肌纤维束3的形成。
[0052]
图5是表示对术后第6周的腹壁缺损部进行修补后的部位的组织的图片。背景表示严重的炎症，圆圈部分表示异物反应。此外，还确认到薄膜2的残留。
[0053]
图6是表示对术后第12周的腹壁缺损部进行修补后的部位的组织的图片。箭头表示缺损部。
[0054]
图7是对术后第12周的腹壁缺损部进行修补后的部位的组织中的缺损部附近的放大图片。
[0055]
图8是表示对术后第12周的小鼠的腹壁缺损部进行修补后的部位的图片。
[0056]
图9是表示对术后第15周的小鼠的腹壁缺损部进行修补后的部位的图片。
具体实施方式
[0057]
以下，对本发明具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限于以下实施方式。
[0058]
《改造丝心蛋白》在本说明书中，改造丝心蛋白是指具有与天然来源的丝心蛋白不同的氨基酸序列的丝心蛋白。改造丝心蛋白可以是通过基因重组技术利用微生物等来进行制造的重组丝心蛋白，也可以是通过合成来进行制造的合成丝心蛋白。丝心蛋白(包括天然来源的丝心蛋白和改造丝心蛋白)不易引起免疫反应，适用于医疗用途。
[0059]
本实施方式所涉及的改造丝心蛋白例如可以是包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。本实施方式所涉及的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以在结构域序列的n末端侧和c末端侧中的任意一个末端侧或两个末端侧进一步附加有氨基酸序列(n末端序列和c末端序列)。n末端序列及c末端序列并不限定于此，典型地，不具有丝心蛋白中的特征性的氨基酸基序的重复的区域，并且由100个残基左右的氨基酸构成。
[0060]
在本说明书中，"结构域序列"为生成丝心蛋白特有的结晶区域(典型地，相当于氨基酸序列的(a)n基序)和非晶区域(典型地，相当于氨基酸序列的rep)的氨基酸序列，是指式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所表示的氨基酸序列。这里，(a)n基序表示以丙氨酸残基为主的氨基酸序列，氨基酸残基数为2～27。(a)n基序的氨基酸残基数可以为2～20、4～27、4～20、8～20、10～20、4～16、8～16或10～16。此外，只要(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于氨基酸残基总数的比例为40％以上即可，可以为60％以上、70％以上、80％以上、83％以上、85％以上、86％以上、90％以上、95％以上或100％(意味着其仅由丙氨酸残基构成)也可以。在结构域序列中存在的多个(a)n基序中的至少7个可以仅由丙氨酸残基构成。rep表示由2～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。rep可以是由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示2～300的整数，也可以为10～300的整数。存在的多个
(a)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。存在的多个rep可以是彼此相同的氨基酸序列，也可以是彼此不同的氨基酸序列。
[0061]
改造丝心蛋白例如可以为依据天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列对其氨基酸序列进行修饰而得到的丝心蛋白(例如，通过对克隆出的天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的基因序列进行修饰来修饰氨基酸序列而得到的丝心蛋白)，而且也可以为不依赖于天然来源的丝心蛋白而人工设计及合成的丝心蛋白(例如，通过对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成而具有所期望的氨基酸序列的丝心蛋白)。
[0062]
改造丝心蛋白可以是改造蜘蛛丝丝心蛋白。例如可通过对克隆得到的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行例如相当于置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的修饰，从而可以得到改造蜘蛛丝丝心蛋白。氨基酸残基的置换、缺失、插入及/或添加可以通过定点突变方法等本领域技术人员熟知的方法来进行。具体而言，可以根据nucleic acid res.10，6487(1982)、methods in enzymology，100，448(1983)等文献中记载的方法来进行。
[0063]
在本说明书中，“改造蜘蛛丝丝心蛋白”是指具有与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白不同的氨基酸序列的蜘蛛丝丝心蛋白，本说明书中的“天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白”是指具有与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相同的氨基酸序列的蜘蛛丝丝心蛋白。
[0064]
作为天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白，例如，可以列举出大吐丝管牵引丝蛋白、横丝蛋白以及小壶状腺丝蛋白等蜘蛛类所产生的蜘蛛丝丝心蛋白。大吐丝管牵引丝具有由结晶区域和非晶区域(也称为无定形区域)构成的重复区域，因此兼具较高的应力和伸缩性。蜘蛛丝的横丝具有如下特征：虽不具有结晶区域，但是具有由非晶区域构成的重复区域。横丝与大吐丝管牵引丝相比，应力差但具有较高的伸缩性。
[0065]
大吐丝管牵引丝蛋白由蜘蛛的大壶状腺产生，具有强韧性优异的特征。作为大吐丝管牵引丝蛋白，例如可以列举出来自于金纺蜘蛛(nephila clavipes)的大壶状腺丝蛋白masp1及masp2、以及来自于十字园蛛(araneus diadematus)的adf3及adf4。adf3是十字园蛛的2种主要牵引丝蛋白之一。来自于adf3的蜘蛛丝蛋白比较容易合成，并且在强伸度及韧性方面具有优异的特性。
[0066]
横丝蛋白是由蜘蛛的鞭状腺(flagelliform gland)产生的。作为横丝蛋白，例如可以列举出来自于金纺蜘蛛(nephila clavipes)的鞭毛状腺丝蛋白(flagelliform silk protein)。
[0067]
作为蛛丝类所产生的蜘蛛丝丝心蛋白的另一个例子，例如，可以列举出大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛及野岛园蛛等属于园蛛属(araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛及类青新园蛛等属于新园蛛属(neoscona属)的蜘蛛、棕类岬蛛等属于岬蛛属(pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛及对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛及乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛及六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛及横纹金蛛等属于金蛛属(argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(acusilas属)的蜘蛛、摩鹿加云斑蛛、方格云斑蛛及全色云斑蛛等属于云斑蛛属(cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(poltys属)的蜘蛛、八疣尘蛛、四突尘蛛、圆腹尘蛛及黑尾尘蛛等属于尘蛛属(cyclosa属)的蜘蛛及日本壮头蛛等属于
壮头蛛属(chorizopes属)的蜘蛛所产生的蜘蛛丝蛋白、以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸及鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛及小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇及斑络新妇等属于络新妇属(nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(dyschiriognatha属)的蜘蛛、黑寡妇蜘蛛、红背蜘蛛、几何寇蛛及间斑寇蛛等属于寇蛛属(latrodectus属)的蜘蛛、以及属于育儿网蛛属(euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蜘蛛丝蛋白。
[0068]
作为蜘蛛类所产生的蜘蛛丝蛋白的更具体的例子，例如，可以列举出fibroin-3(adf-3)[来自于araneus diadematus](genbank登录号aac47010(氨基酸序列)、u47855(碱基序列))、fibroin-4(adf-4)[来自于araneus diadematus](genbank登录号aac47011(氨基酸序列)、u47856(碱基序列))、dragline silk protein spidroin 1[来自于nephila clavipes](genbank登录号aac04504(氨基酸序列)、u37520(碱基序列))、major ampullate spidroin 1[来自于latrodectus hesperus](genbank登录号abr68856(氨基酸序列)、ef595246(碱基序列))、dragline silk protein spidroin 2[来自于nephila clavata](genbank登录号aal32472(氨基酸序列)、af441245(碱基序列))、major ampullate spidroin 1[来自于euprosthenops australis](genbank登录号caj00428(氨基酸序列)、aj973155(碱基序列))、以及major ampullate spidroin2[euprosthenops australis](genbank登录号cam32249.1(氨基酸序列)、am490169(碱基序列))、minor ampullate silk protein1[nephila clavipes](genbank登录号aac14589.1(氨基酸序列))、minor ampullate silkprotein 2[nephila clavipes](genbank登录号aac14591.1(氨基酸序列))、minor ampullate spidroin-likeprotein[nephilengys cruentata](genbank登录号abr37278.1(氨基酸序列)等。
[0069]
作为改造蜘蛛丝丝心蛋白的具体实施例，可以列举出来自于蜘蛛的大壶状腺所产生的大吐丝管牵引丝蛋白的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第1改造蜘蛛丝丝心蛋白)、降低了甘氨酸残基含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第2改造蜘蛛丝丝心蛋白)、降低了(a)n基序含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第3改造蜘蛛丝丝心蛋白)、降低了甘氨酸残基的含量及(a)n基序的含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第4改造蜘蛛丝丝心蛋白)、具有局部包含疏水性指标大的区域的结构域序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第5改造蜘蛛丝丝心蛋白)、及具有降低了谷氨酰胺残基的含量的结构域序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第6改造蜘蛛丝丝心蛋白)。
[0070]
作为来自于蜘蛛的大壶状腺所产生的大吐丝管牵引丝蛋白的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第1改造蜘蛛丝丝心蛋白)，可以列举出包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。在第1改造蜘蛛丝丝心蛋白中，式1中的n优选为3～20的整数，更优选为4～20的整数，进一步优选为8～20的整数，更进一步优选为10～20的整数，进一步还优选为4～16的整数，特别优选为8～16的整数，最优选为10～16的整数。在第1改造蜘蛛丝丝心蛋白中，式1中构成rep的氨基酸残基数优选为10～200个残基，更优选为10～150个残基，进一步优选为20～100个残基，更进一步优选为20～75个残基。在第1改造蜘蛛丝丝心蛋白中，式1：[(a)n基序-rep]m所示的氨基酸序列所含的甘氨酸残基、丝氨酸残基及丙氨酸残基的合计残基数相对于氨基酸残基总数优选为40％以上，更优选为60％以上，进一步优选为70％以上。
[0071]
第1改造蜘蛛丝丝心蛋白可以为以下这种蛋白质：包含式1：[(a)n基序-rep]m所示
的氨基酸序列的单元，并且c末端序列为序列号1～3中任意一个所示的氨基酸序列、或与序列号1～3中任意一个所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
[0072]
序列号1所示的氨基酸序列与由adf3(gi：1263287、ncbi)的氨基酸序列的c末端的50个残基的氨基酸构成的氨基酸序列相同，序列号2所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的c末端除去20个残基后的氨基酸序列相同，序列号3所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的c末端除去29个残基后的氨基酸序列相同。
[0073]
作为第1改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(1-i)序列号4所示的氨基酸序列、或(1-ii)序列号4所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。序列一致性优选为95％以上。
[0074]
序列号4所示的氨基酸序列为在n末端添加有由起始密码子、his10标签及hrv3c蛋白酶(human rhinovirus 3c蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)的adf3的氨基酸序列中，以使第1～13位的重复区域增加为约2倍、并且在第1154位氨基酸残基处终止翻译的方式突变后得到。序列号4所示的氨基酸序列的c末端的氨基酸序列与序列号3所示的氨基酸序列相同。
[0075]
(1-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号4所示的氨基酸序列构成。
[0076]
降低了甘氨酸残基的含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第2改造蜘蛛丝丝心蛋白)具有其结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比甘氨酸残基的含量降低的氨基酸序列。第2改造蜘蛛丝丝心蛋白与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，可以具有与至少rep中的一个或多个甘氨酸残基被置换为其他氨基酸残基相当的氨基酸序列。
[0077]
第2改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，在rep中的选自ggx及gpgxx(其中，g表示甘氨酸残基，p表示脯氨酸残基，x表示甘氨酸以外的氨基酸残基)中的至少一种基序序列中，可以具有相当于至少一个或多个该基序序列中的一个甘氨酸残基被置换为其他氨基酸残基的氨基酸序列。
[0078]
第2改造蜘蛛丝丝心蛋白中，上述甘氨酸残基被置换为其他氨基酸残基的基序序列的比例相对于全部基序序列可以为10％以上。
[0079]
第2改造蜘蛛丝丝心蛋白包括式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列并且可以具有下述氨基酸序列：当将从上述结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至上述结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列中的全部rep所包含的由xgx(其中，x表示甘氨酸以外的氨基酸残基)构成的氨基酸序列的氨基酸残基总数设为z、并且将从上述结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至上述结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列中的氨基酸残基总数设为w时，z/w为30％以上、40％以上、50％以上或50.9％以上。(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于氨基酸残基总数可以为83％以上，优选为86％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，更进一步优选为100％(意味着仅由丙氨酸残基构成)。
[0080]
第2改造蜘蛛丝丝心蛋白优选地通过将ggx基序中的一个甘氨酸残基置换为其他氨基酸残基来提高由xgx构成的氨基酸序列的含有比例。在第2改造丝心蛋白中，结构域序列中的由ggx构成的氨基酸序列的含有比例优选为30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为10％以下，更进一步优选为6％以下，进一步还优选为4％以下，特别优选为2％以下。结构域序列中的由ggx构成的氨基酸序列的含有比例可以通过与下述的由xgx构成的氨基酸
序列的含有比例(z/w)的计算方法相同的方法来计算。
[0081]
对z/w的计算方法进一步进行详细说明。首先，在包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蜘蛛丝丝心蛋白(改造蜘蛛丝丝心蛋白)中，从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后所得序列中包含的全部rep中，提取由xgx构成的氨基酸序列。构成xgx的氨基酸残基的总数为z。例如，当提取了50个由xgx构成的氨基酸序列时(没有重复)，z为50
×
3＝150。此外，例如，如由xgxgx构成的氨基酸序列的情况那样，当包含在2个xgx中的x(中间的x)存在时，通过扣除重复部分来进行计算(当为xgxgx时，为5个氨基酸残基)。w为从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列所含的氨基酸残基总数。例如，当为图1所示的结构域序列时，w为4+50+4+100+4+10+4+20+4+30＝230(除去位于最靠c末端侧的(a)n基序)。然后，通过将z除以w，可以计算出z/w(％)。
[0082]
在第2改造蜘蛛丝丝心蛋白中，z/w优选为50.9％以上，更优选为56.1％以上，进一步优选为58.7％以上，更进一步优选为70％以上，进一步还优选为80％以上。z/w的上限并没有特别限制，例如可以为95％以下。
[0083]
例如可以通过如下方式进行修饰而获得第2改造蜘蛛丝丝心蛋白：从克隆出的天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的基因序列中，对编码甘氨酸残基的碱基序列的至少一部分进行置换并使其编码其他氨基酸残基。此时，作为修饰的甘氨酸残基，可以选择ggx基序及gpgxx基序中的一个甘氨酸残基、另外也可以用将z/w设定为50.9％以上的方式进行置换。此外，例如，也可以通过根据天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列设计满足上述方式的氨基酸序列，并通过对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成后得到。在任何一种情况下，除了与在从天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列中将rep中的甘氨酸残基置换为其他氨基酸残基相当的修饰之外，还可以进一步进行与置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基相当的氨基酸序列的修饰。
[0084]
作为上述的其他氨基酸残基，只要是除甘氨酸残基以外的氨基酸残基即可，并没有特别限制，优选缬氨酸(v)残基、亮氨酸(l)残基、异亮氨酸(i)残基、蛋氨酸(m)残基、脯氨酸(p)残基、苯丙氨酸(f)残基及色氨酸(w)残基等疏水性氨基酸残基、谷氨酰胺(q)残基、天冬酰胺(n)残基、丝氨酸(s)残基、赖氨酸(k)残基及谷氨酸(e)残基等亲水性氨基酸残基，更优选缬氨酸(v)残基、亮氨酸(l)残基、异亮氨酸(i)残基及谷氨酰胺(q)残基，进一步优选谷氨酰胺(q)残基。
[0085]
作为第2改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(2-i)序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列、或者(2-ii)序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0086]
对(2-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白进行说明。序列号6所示的氨基酸序列通过将相当于将天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的序列号10所示的氨基酸序列的rep中的所有ggx置换为gqx而得到。序列号7所示的氨基酸序列在序列号6所示的氨基酸序列中从n末端侧向c末端侧使(a)n基序每隔2个发生缺失，并进一步在c末端序列的近端插入一个[(a)n基序-rep]。序列号8所示的氨基酸序列在序列号7所示的氨基酸序列的各个(a)n基序的c末端侧插入2个丙氨酸残基，进一步将部分谷氨酰胺(q)残基置换为丝氨酸(s)残基、并且使n末端侧的部分
氨基酸缺失以使得其与序列号7的分子量几乎相同。序列号9所示的氨基酸序列在将序列号11所示的氨基酸序列中存在的20个结构域序列的区域(其中，该区域的c末端侧的数个氨基酸残基被置换)重复4次后的序列的c末端中添加his标签。
[0087]
序列号10所示的氨基酸序列(相当于天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白)中的z/w的值为46.8％。序列号6所示的氨基酸序列、序列号7所示的氨基酸序列、序列号8所示的氨基酸序列及序列号9所示的氨基酸序列中的z/w值分别为58.7％、70.1％、66.1％及70.0％。此外，序列号10、序列号6、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列的锯齿比率(在下文中说明)为1:1.8～11.3的x/y的值分别为15.0％、15.0％、93.4％、92.7％及89.3％。
[0088]
(2-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列构成。
[0089]
(2-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包含与序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性的氨基酸序列。(2-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白亦为包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0090]
(2-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白与序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性，并且将rep中所含的由xgx(其中，x表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)构成的氨基酸序列的氨基酸残基总数设为z，将上述结构域序列中的rep的氨基酸残基总数设为w时，z/w优选为50.9％以上。
[0091]
第2改造蜘蛛丝丝心蛋白可以在n末端及c末端中的任意一端或两端包含标签序列。由此，可以实现改造蜘蛛丝丝心蛋白的分离、固定、检测及可视化等。
[0092]
作为标签序列，例如，可以列举出利用与其他分子的特异性亲和性(结合性、亲和性)的亲和性标签。作为亲和性标签的具体示例，可以列举出组氨酸标签(his标签)。his标签是由4至10个左右的组氨酸残基排列而成的短肽，具有与镍等的金属离子特异性结合的性质，因此可以用于通过金属螯合层析(chelating metal chromatography)进行的改造丝心蛋白的分离。作为标签序列的具体实施例，例如，可以列举出序列号12所示的氨基酸序列(包含his标签序列及铰链序列的氨基酸序列)。
[0093]
此外，也可以利用与谷胱甘肽特异性结合的谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、与麦芽糖特异性结合的麦芽糖结合蛋白(mbp)等标签序列。
[0094]
更进一步地，还可以使用利用抗原抗体反应的“表位标签”。通过添加用于显示抗原性的肽(表位)作为标签序列，可以结合针对该表位的抗体。作为表位标签，可以列举出ha(流感病毒血凝素的肽序列)标签、myc标签、flag标签等。通过利用表位标签，可以轻易地以高特异性对改造蜘蛛丝丝心蛋白进行纯化。
[0095]
更进一步地，也可以使用利用特定的蛋白酶将标签序列切除而得到的标签。也可以通过对经由该标签序列吸附的蛋白质进行蛋白酶处理，来回收切除标签序列后的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0096]
作为含有标签序列的第2改造丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(2-iii)序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列、或(2-iv)序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0097]
序列号16、序列号17、序列号13、序列号11、序列号14及序列号15所示的氨基酸序
列分别在序列号10、序列号18、序列号6、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列的n末端添加序列号12所示的氨基酸序列(包含his标签序列及铰链序列)。
[0098]
(2-iii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列构成。
[0099]
(2-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包含与序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性的氨基酸序列。(2-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白亦为包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0100]
(2-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白与序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性，并且将rep中所含的由xgx(其中，x表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)构成的氨基酸序列的氨基酸残基总数设为z，将上述结构域序列中的rep的氨基酸残基总数设为w时，z/w优选为50.9％以上。
[0101]
第2改造蜘蛛丝丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白生产系统所生产的蛋白质释放到宿主外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主种类来适当设定。
[0102]
降低了(a)n基序的含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第3改造蜘蛛丝丝心蛋白)具有其结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比(a)n基序的含量降低的氨基酸序列。第3改造丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，具有相当于缺失了至少一个或多个(a)n基序的氨基酸序列。
[0103]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白可以具有相当于从天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白中缺失了10～40％的(a)n基序的氨基酸序列。
[0104]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其可以至少从n末端侧向c末端侧具有相当于每1～3个(a)n基序中缺失一个(a)n基序的氨基酸序列。
[0105]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其可以至少从n末端侧向c末端侧具有相当于依次重复发生了2个连续的(a)n基序的缺失及一个(a)n基序的缺失的氨基酸序列。
[0106]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列可以具有相当于至少从n末端侧向c末端侧每隔2个发生一次(a)n基序缺失的氨基酸序列。
[0107]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列，并且可以具有下述氨基酸序列：即从n末端侧向c末端侧依次比较相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的rep的氨基酸残基数，将氨基酸残基数少的rep的氨基酸残基数设为1，并且将另一个rep的氨基酸残基数的比值为1.8～11.3的相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x，将结构域序列的氨基酸残基总数设为y时，x/y为20％以上、30％以上、40％以上或50％以上。(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于氨基酸残基总数可以为83％以上，优选为86％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，更进一步优选为100％(意味着仅由丙氨酸残基构成)。
[0108]
参照图1进一步详细说明x/y的计算方法。图1示出了从蜘蛛丝丝心蛋白中除去n末端序列及c末端序列后的结构域序列。该结构域序列从n末端侧(左侧)起具有(a)n基序-第1rep(50个氨基酸残基)-(a)n基序-第2rep(100个氨基酸残基)-(a)n基序-第3rep(10个氨基
酸残基)-(a)n基序-第4rep(20个氨基酸残基)-(a)n基序-第5rep(30个氨基酸残基)-(a)n基序的序列。
[0109]
以不重复的方式从n末端侧向c末端侧依次选择相邻的2个[(a)n基序-rep]单元。此时，也可以存在未被选择的[(a)n基序-rep]单元。图1示出了模式1(第1rep与第2rep的比较、以及第3rep与第4rep的比较)、模式2(第1rep与第2rep的比较、以及第4rep与第5rep的比较)、模式3(第2rep与第3rep的比较、以及第4rep与第5rep的比较)、模式4(第1rep与第2rep的比较)。另外，除此之外还存在选择方法。
[0110]
然后，对各模式中所选择的相邻的2个[(a)n基序-rep]单元中的各rep的氨基酸残基数进行比较。将氨基酸残基数较少的一方设为1，求出另一方氨基酸残基数与其的比值，通过这种方式进行比较。例如，将第1rep(50个氨基酸残基)与第2rep(100个氨基酸残基)进行比较时，将氨基酸残基数较少的第1rep设为1，则第2rep的氨基酸残基数的比值为100/50＝2。同样地，将第4rep(20个氨基酸残基)与第5rep(30个氨基酸残基)进行比较时，将氨基酸残基数较少的第4rep设为1，则第5rep的氨基酸残基数的比值为30/20＝1.5。
[0111]
图1中，用实线表示将氨基酸残基数较少一方设为1时另一方氨基酸残基数的比值为1.8～11.3的[(a)n基序-rep]单元的组。下面将这样的比称为锯齿比率。用虚线表示将氨基酸残基数较少一方设为1时另一方氨基酸残基数的比值小于1.8或大于11.3的[(a)n基序-rep]单元的组。
[0112]
在各个模式中，将实线所示的相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的所有氨基酸残基数相加(不仅仅是rep，也是(a)n基序的氨基酸残基数。)。而且，将相加后的合计值进行比较，并将该合计值最大的模式的合计值(合计值的最大值)设为x。在图1所示的示例中，模式1的合计值最大。
[0113]
然后，可以通过x除以结构域序列的氨基酸残基总数y来计算出x/y(％)。
[0114]
在第3改造蜘蛛丝丝心蛋白中，x/y优选为50％以上，更优选为60％以上，进一步优选为65％以上，更进一步优选为70％以上，进一步还优选为75％以上，特别优选为80％以上。x/y的上限并没有特别限制，例如可以为100％以下。当锯齿比率为1:1.9～11.3时，x/y优选为89.6％以上，当锯齿比率为1:1.8～3.4时，x/y优选为77.1％以上，当锯齿比率为1:1.9～8.4时，x/y优选为75.9％以上，当锯齿比率为1:1.9～4.1时，x/y优选为64.2％以上。
[0115]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白为结构域序列中存在多个的(a)n基序的至少7个仅由丙氨酸残基构成的改造蜘蛛丝丝心蛋白时，x/y优选为46.4％以上，更优选为50％以上，进一步优选为55％以上，更进一步优选为60％以上，进一步还优选为70％以上，特别优选为80％以上。x/y的上限并没有特别限制，为100％以下即可。
[0116]
例如可以通过从克隆出的天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的基因序列中，以将x/y设为64.2％以上的方式使编码(a)n基序的序列中的一个或多个缺失，从而得到第3改造蜘蛛丝丝心蛋白。此外，例如也可以通过设计出相当于从天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列中，以将x/y设为64.2％以上的方式使一个或多个(a)n基序发生缺失的氨基酸序列，并且对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成后得到。在任何情况下，除了与在从天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列中缺失(a)n基序相当的修饰之外，还可以进一步进行与置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基相当的氨基酸序列的修饰。
[0117]
作为第3改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(3-i)序列号
18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列、或者(3-ii)序列号18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0118]
对(3-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白进行说明。序列号18所示的氨基酸序列通过在相当于天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的序列号10所示的氨基酸序列中从n末端侧向c末端侧使(a)n基序每隔2个发生缺失，并进一步在c末端序列的近前插入一个[(a)n基序-rep]而得到。序列号7所示的氨基酸序列通过将序列号18所示的氨基酸序列的rep中的所有ggx置换为gqx而得到。序列号8所示的氨基酸序列在序列号7所示的氨基酸序列的各个(a)n基序的c末端侧插入2个丙氨酸残基，进一步将部分谷氨酰胺(q)残基置换为丝氨酸(s)残基、并且使n末端侧的部分氨基酸缺失以使得其与序列号7的分子量几乎相同。序列号9所示的氨基酸序列在将序列号11所示的氨基酸序列中存在的20个结构域序列的区域(其中，该区域的c末端侧的数个氨基酸残基被置换)重复4次后的序列的c末端中添加his标签。
[0119]
序列号10所示的氨基酸序列(相当于天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白)的锯齿比率为1:1.8～11.3中的x/y的值为15.0％。序列号18所示的氨基酸序列及序列号7所示的氨基酸序列中的x/y的值均为93.4％。序列号8所示的氨基酸序列中的x/y的值为92.7％。序列号9所示的氨基酸序列中的x/y的值为89.3％。序列号10、序列号18、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列中的z/w的值分别为46.8％、56.2％、70.1％、66.1％及70.0％。
[0120]
(3-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列构成。
[0121]
(3-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包含与序列号18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性的氨基酸序列。(3-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白亦为包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0122]
(3-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白与序列号18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性，并且从n末端侧向c末端侧依次比较相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的rep的氨基酸残基数，将氨基酸残基数少的rep的氨基酸残基数设为1，并且将另一个rep的氨基酸残基数的比值为1.8～11.3(锯齿比率为1：1.8～11.3)的相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x，将结构域序列的氨基酸残基总数设为y时，x/y优选为64.2％以上。
[0123]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白可以在n末端及c末端中的任意一端或两端含有上述标签序列。
[0124]
作为含有标签序列的第3改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(3-iii)序列号17、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列、或(3-iv)序列号17、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0125]
序列号16、序列号17、序列号13、序列号11、序列号14及序列号15所示的氨基酸序列分别在序列号10、序列号18、序列号6、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列的n末端添加序列号12所示的氨基酸序列(包含his标签序列及铰链序列)。
[0126]
(3-iii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号17、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列构成。
[0127]
(3-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包含与序列号17、序列号11、序列号14或序列号15
所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性的氨基酸序列。(3-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白亦为包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0128]
(3-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白与序列号17、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性，并且从n末端侧向c末端侧依次比较相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的rep的氨基酸残基数，将氨基酸残基数少的rep的氨基酸残基数设为1，并且将另一个rep的氨基酸残基数的比值为1.8～11.3的相邻的2个[(a)n基序-rep]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x，将结构域序列的氨基酸残基总数设为y时，x/y优选为64.2％以上。
[0129]
第3改造蜘蛛丝丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白生产系统所生产的蛋白质释放到宿主外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主种类来适当设定。
[0130]
将降低甘氨酸残基的含量及(a)n基序的含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第4改造蜘蛛丝丝心蛋白)的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其除了降低(a)n基序的含量之外，还具有降低甘氨酸残基的含量的氨基酸序列。第4改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其除了至少一个或多个(a)n基序缺失之外，还可以具有相当于至少rep中的一个或多个甘氨酸残基被其他氨基酸残基置换的氨基酸序列。即，第4改造蜘蛛丝丝心蛋白为兼具上述降低甘氨酸残基的含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第2改造蜘蛛丝丝心蛋白)和降低(a)n基序的含量的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第3改造蜘蛛丝丝心蛋白)的特征的改造蜘蛛丝丝心蛋白。具体实施方式等如第2改造蜘蛛丝丝心蛋白及第3改造蜘蛛丝丝心蛋白的说明所示。
[0131]
作为第4改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(4-i)序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列、(4-ii)序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。包含序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白的具体实施方式如上所述。
[0132]
具有局部包含疏水性指标大的区域的结构域序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第5改造蜘蛛丝丝心蛋白)的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其可以具有相当于rep中的一个或多个氨基酸残基被置换为疏水性指标大的氨基酸残基及/或在rep中插入了一个或多个疏水性指标大的氨基酸残基的、且局部包含疏水性指标大的区域的氨基酸序列。
[0133]
局部疏水性指标大的区域优选由连续的2～4个氨基酸残基构成。
[0134]
上述疏水性指标大的氨基酸残基更优选为选自异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、苯丙氨酸(f)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)及丙氨酸(a)中的氨基酸残基。
[0135]
第5改造丝心蛋白与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其除了相当于将rep中的一个或多个氨基酸残基置换为疏水性指标大的氨基酸残基及/或在rep中插入一个或多个疏水性指标大的氨基酸残基的修饰之外，进一步与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，还可以进行相当于与置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的修饰。
[0136]
例如可以通过从克隆出的天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的基因序列中将rep中的一个或多个亲水性氨基酸残基(例如疏水性指标为负的氨基酸残基)置换为疏水性氨基酸残基(例如疏水性指标为正的氨基酸残基)、及/或在rep中插入一个或多个疏水性氨基酸残
基，从而得到第5改造蜘蛛丝丝心蛋白。此外，例如也可以通过设计出相当于从天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列中，将rep中的一个或多个亲水性氨基酸残基置换为疏水性氨基酸残基、及/或在rep中插入一个或多个疏水性氨基酸残基的氨基酸序列，并且对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成后得到。在任何情况下，除了相当于从天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列中将rep中的一个或多个亲水性氨基酸残基置换为疏水性氨基酸残基、及/或在rep中插入一个或多个疏水性氨基酸残基的修饰之外，还可以进一步进行与置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基相当的氨基酸序列的修饰。
[0137]
第5改造丝心蛋白包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列，并且可以具有下述氨基酸序列：即在从上述结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至上述结构域序列的c末端为止的序列所得序列中包含的所有rep中，将连续4个氨基酸残基的疏水性指标的疏水性指标平均值值为2.6以上的区域中包含的氨基酸残基总数设为p，将从上述结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至上述结构域序列的c末端为止的序列所得序列中包含的氨基酸残基总数设为q时，p/q为6.2％以上。
[0138]
关于氨基酸残基的疏水性指标，使用公知的指标(hydropathy index：kyte j，&doolittle r(1982)”a simple method for displaying the hydropathic character of a protein”，j.mol.biol.，157，pp.105-132)。具体而言，各氨基酸的疏水性指标(亲水指数，以下也记为
″
hi
″
)。)如下述表1所示。
[0139]
[表1]
[0140]
氨基酸hi氨基酸hi异亮氨酸(ile)4.5色氨酸(trp)-0.9缬氨酸(val)4.2酪氨酸(tyr)-1.3亮氨酸(leu)3.8脯氨酸(pro)-1.6苯丙氨酸(phe)2.8组氨酸(his)-3.2半胱氨酸(cys)2.5天冬酰胺(asn)-3.5蛋氨酸(met)1.9天冬氨酸(asp)-3.5丙氨酸(ala)1.8谷氨酰胺(gln)-3.5甘氨酸(gly)-0.4谷氨酸(glu)-3.5苏氨酸(thr)-0.7赖氨酸(lys)-3.9丝氨酸(ser)-0.8精氨酸(arg)-4.5
[0141]
对p/q的计算方法进一步进行详细说明。在计算中，使用从式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列所得序列(以下称为“序列a”)。首先，在序列a包含的所有rep中，计算连续4个氨基酸残基的疏水性指标的平均值。疏水性指标的平均值是通过将连续的4个氨基酸残基中所含有的各氨基酸残基的hi的总和除以4(氨基酸残基数)而求出的。疏水性指标的平均值是针对所有连续的4个氨基酸残基而求出的(各氨基酸残基用于1～4次平均值的计算)。接下来，确定连续的4个氨基酸残基的疏水性指标的平均值为2.6以上的区域。即使某个氨基酸残基属于多处“疏水性指标的平均值为2.6以上的连续4个氨基酸残基”，也会作为一个氨基酸残基包含在区域中。而且，该区域中所含的氨基酸残基总数为p。此外，序列a中所含的氨基酸残基总数为q。
[0142]
例如，提取到20处“疏水性指标的平均值为2.6以上的连续4个氨基酸残基”时(没有重复)，在连续4个氨基酸残基的疏水性指标的平均值为2.6以上的区域中含有20处连续4个氨基酸残基(没有重复)，p为20
×
4＝80。此外，例如在2处“疏水性指标的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”仅有一个氨基酸残基重复存在的情况下，在连续的4个氨基酸残基的疏水性指标的平均值为2.6以上的区域中，含有7个氨基酸残基(p＝2
×
4-1＝7。
“‑
1”为重复部分的扣除)。例如，图2所示的结构域序列中，“疏水性指标的平均值为2.6以上的连续4个氨基酸残基”没有重复且存在7个，因此p为7
×
4＝28。此外，例如，图2所示的结构域序列中，q为4+50+4+40+4+10+4+20+4+30＝170(不包含位于c末端侧最后的(a)n基序)。然后，通过p除以q，可以计算出p/q(％)。在图2的情况下，28/170＝16.47％。
[0143]
在第5改造蜘蛛丝丝心蛋白中，p/q优选为6.2％以上，更优选为7％以上，进一步优选为10％以上，更进一步优选为20％以上，进一步还优选为30％以上。p/q的上限并没有特别限制，例如可以为45％以下。
[0144]
例如，对于克隆出的天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列，通过将rep中的一个或多个亲水性氨基酸残基(例如疏水性指标为负的氨基酸残基)置换为疏水性氨基酸残基(例如疏水性指标为正的氨基酸残基)、及/或在rep中插入一个或多个疏水性氨基酸残基，以使其满足上述p/q的条件，并且通过将其修饰成局部含有疏水性指标大的区域的氨基酸序列，从而得到第5改造蜘蛛丝丝心蛋白。此外，例如，也可以通过根据天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列设计满足上述p/q的条件的氨基酸序列，并通过对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成后得到。在任何情况下，与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，除了进行相当于rep中的一个或多个氨基酸残基被置换为疏水性指标大的氨基酸残基、及/或在rep中插入一个或多个疏水性指标大的氨基酸残基的修饰之外，还可以进一步进行相当于置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的修饰。
[0145]
作为疏水性指标大的氨基酸残基，并没有特别限制，优选为异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、苯丙氨酸(f)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)及丙氨酸(a)，更优选为缬氨酸(v)、亮氨酸(l)及异亮氨酸(i)。
[0146]
作为第5改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(5-i)序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列、或者(5-ii)序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0147]
对(5-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白进行说明。序列号22所示的氨基酸序列通过使天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的(a)n基序中的丙氨酸残基连续的氨基酸序列发生缺失，从而使得丙氨酸残基连续的个数变为5。序列号19所示的氨基酸序列相对于序列号22所示的氨基酸序列，每隔一个rep插入2处分别由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(vli)，并且使c末端侧的部分氨基酸发生缺失以使得其与序列号22所示的氨基酸序列的分子量大致相同。序列号23所示的氨基酸序列相对于序列号22所示的氨基酸序列，各个(a)n基序的c末端侧插入2个丙氨酸残基，进一步将部分谷氨酰胺(q)残基置换为丝氨酸(s)残基、并且使c末端侧的部分氨基酸缺失以使得其与序列号22所示的氨基酸序列的分子量几乎相同。序列号20所示的氨基酸序列相对于序列号23所示的氨基酸序列，每隔一个rep插入一处分别由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(vli)。序列号21所示的氨基酸序列相对于序列号23所示的氨基酸序列，每隔一个rep插入2处分别由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(vli)。
[0148]
(5-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列构成。
[0149]
(5-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包含与序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性的氨基酸序列。(5-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白亦为包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0150]
(5-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白与序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性，并且在从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后所得序列中包含的所有rep中，将连续4个氨基酸残基的疏水性指标的平均值为2.6以上的区域中包含的氨基酸残基总数设为p，将从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后所得序列中包含的氨基酸残基总数设为q时，p/q优选为6.2％以上。
[0151]
第5改造蜘蛛丝丝心蛋白可以在n末端及c末端中的任意一端或两端包含标签序列。
[0152]
作为含有标签序列的第5改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括与(5-iii)序列号24、序列号25或序列号26所示的氨基酸序列、或(5-iv)序列号24、序列号25或序列号26所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0153]
序列号24、序列号25或序列号26所示的氨基酸序列分别在序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列的n末端添加序列号12所示的氨基酸序列(包含his标签序列及铰链序列)。
[0154]
(5-iii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号24、序列号25或序列号26所示的氨基酸序列构成。
[0155]
(5-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包括与序列号24、序列号25或序列号26所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。(5-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白亦为包含式1：[(a)n基序-rep]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0156]
(5-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白与序列号24、序列号25或序列号26所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性，并且优选地，从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列所含的所有rep中，将连续的4个氨基酸残基的疏水性指标的平均值为2.6以上的区域所含的氨基酸残基的总数设为p、将从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列所含的氨基酸残基的总数设为q时，p/q为6.2％以上。
[0157]
第5改造蜘蛛丝丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白生产系统所生产的蛋白质释放到宿主外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主种类来适当设定。
[0158]
具有降低谷氨酰胺残基的含量的结构域序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白(第6改造蜘蛛丝丝心蛋白)与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，具有降低谷氨酰胺残基的含量的氨基酸序列。
[0159]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白优选在rep的氨基酸序列中包含选自ggx基序及gpgxx基序中的至少1种基序。
[0160]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白在rep中包含gpgxx基序时，gpgxx基序含有率通常为1％
以上，也可以为5％以上，优选为10％以上。gpgxx基序含有率的上限并没有特别限制，可以为50％以下，也可以为30％以下。
[0161]
在本说明书中，“gpgxx基序含有率”是通过以下方法计算出的值。
[0162]
在包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所示的结构域序列的蜘蛛丝丝心蛋白中，在从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列所含的所有rep中，当将该区域所含的gpgxx基序的个数的总数乘以3而得到的数(即，相当于gpgxx基序中的g及p的总数)设为s，并且将从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列且除去(a)n基序后得到的所有rep的氨基酸残基的总数设为t时，以s/t来计算gpgxx基序含有率。
[0163]
在gpgxx基序含有率的计算中，将“从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列”作为对象是为了排除下述影响：“位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列”(相当于rep的序列)中有时包含与蜘蛛丝丝心蛋白的特征性序列相关性低的序列，在m较小的情况下(也就是说，结构域序列短的情况下)会影响gpgxx基序含有率的计算结果。另外，“gpgxx基序”位于rep的c末端时，即使“xx”例如为“aa”，也作为“gpgxx基序”来处理。
[0164]
图3是表示蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列的示意图。参照图3来具体说明gpgxx基序含有率的计算方法。首先，在图3所示的蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列(“[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序”类型)中，所有rep都包含在“从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列”(图3中“区域a”所示的序列)中，因此用于计算s的gpgxx基序的个数为7，s为7
×
3＝21。同样地，由于所有rep都包含在“从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列”(图3中“区域a”所示的序列)中，因此从该序列中进一步除去(a)n基序后得到的所有rep的氨基酸残基的总数t为50+40+10+20+30＝150。接下来，通过将s除以t，可以计算出s/t(％)，在图3的丝心蛋白的情况下，为21/150＝14.0％。
[0165]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白中，谷氨酰胺残基含有率优选为9％以下，更优选为7％以下，进一步优选为4％以下，特别优选为0％。
[0166]
在本说明书中，“谷氨酰胺残基含有率”是通过以下方法计算出的值。
[0167]
在包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所示的结构域序列的蜘蛛丝丝心蛋白中，在从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列(相当于图3的“区域a”的序列)所含的所有rep中，当将该区域所含的谷氨酰胺残基的总数设为u，并且将从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列且除去(a)n基序后得到的所有rep的氨基酸残基的总数设为t时，以u/t来计算谷氨酰胺残基含有率。在谷氨酰胺残基含有率的计算中，以“从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列”为对象的理由与上述的理由相同。
[0168]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，可以具有相当于使rep中的一个或多个谷氨酰胺残基发生缺失或置换为其他氨基酸残基的氨基酸序列。
[0169]“其他氨基酸残基”只要是谷氨酰胺残基以外的氨基酸残基即可，优选为疏水性指
标大于谷氨酰胺残基的氨基酸残基。氨基酸残基的疏水性指标如表1所示。
[0170]
如表1所示，作为疏水性指标大于谷氨酰胺残基的氨基酸残基，可以列举出选自异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、苯丙氨酸(f)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)、丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、苏氨酸(t)、丝氨酸(s)、色氨酸(w)、酪氨酸(y)、脯氨酸(p)及组氨酸(h)中的氨基酸残基。其中，更优选为选自异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、苯丙氨酸(f)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)及丙氨酸(a)中的氨基酸残基，进一步优选为选自异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)及苯丙氨酸(f)中的氨基酸残基。
[0171]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白中的rep的疏水性程度优选为-0.8以上，更优选为-0.7以上，进一步优选为0以上，更进一步优选为0.3以上，特别优选为0.4以上。rep的疏水性程度的上限并没有特别限制，可以为1.0以下，也可以为0.7以下。
[0172]
在本说明书中，“rep的疏水性程度”为通过以下方法而计算出的值。
[0173]
在包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所示的结构域序列的蜘蛛丝丝心蛋白中，在从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列(相当于图3的“区域a”的序列)所含的所有rep中，当将该区域的各氨基酸残基的疏水性指标的总和设为v，并且将从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列且除去(a)n基序后得到的所有rep的氨基酸残基的总数设为t时，以v/t来计算rep的疏水性程度。在rep的疏水性程度的计算中，以“从结构域序列中除去自位于最靠c末端侧的(a)n基序至结构域序列的c末端为止的序列后得到的序列”为对象的理由与上述的理由相同。
[0174]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白的结构域序列与天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白相比，其除了相当于缺失了rep中的一个或多个谷氨酰胺残基、及/或将rep中的一个或多个谷氨酰胺残基置换为其他氨基酸残基的修饰之外，还可以进一步进行相当于置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的修饰。
[0175]
例如可以通过在克隆出的天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的基因序列中使rep中的一个或多个谷氨酰胺残基发生缺失、及/或将rep中的一个或多个谷氨酰胺残基置换为其他氨基酸残基，从而得到第6改造蜘蛛丝丝心蛋白。此外，例如也可以通过设计出相当于在天然来源的蜘蛛丝丝心蛋白的氨基酸序列中，使rep中的一个或多个谷氨酰胺残基发生缺失、及/或将rep中的一个或多个谷氨酰胺残基置换为其他氨基酸残基的氨基酸序列，并且对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成后得到。
[0176]
作为第6改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括(6-i)序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33或序列号43所示的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白，或者包括与(6-ii)序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33或序列号43所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0177]
对(6-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白进行说明。
[0178]
序列号7所示的氨基酸序列(met-prt410)根据作为天然来源的丝心蛋白的nephila clavipes(genbank登录号：p46804.1、gi：1174415)的碱基序列及氨基酸序列，对(a)n基序中的丙氨酸残基连续而成的氨基酸序列进行使丙氨酸残基连续数为5个等的用于提高生产率的氨基酸修饰。另一方面，met-prt410未进行谷氨酰胺残基(q)的修饰，因此谷
氨酰胺残基含有率与天然来源的丝心蛋白的谷氨酰胺残基含有率相同。
[0179]
序列号27所示的氨基酸序列(m＿prt888)是将met-prt410(序列号7)中的qq全部置换为vl而得到的氨基酸序列。
[0180]
序列号28所示的氨基酸序列(m＿prt965)是将met-prt410(序列号7)中的qq全部置换为ts、并且将其余的q置换为a而得到的氨基酸序列。
[0181]
序列号29所示的氨基酸序列(m＿prt889)是将met-prt410(序列号7)中的qq全部置换为vl、并且将其余的q置换为i而得到的氨基酸序列。
[0182]
序列号30所示的氨基酸序列(m＿prt916)是将met-prt410(序列号7)中的qq全部置换为vi、并且将其余的q置换为l而得到的氨基酸序列。
[0183]
序列号31所示的氨基酸序列(m＿prt918)是将met-prt410(序列号7)中的qq全部置换为vf、并且将其余的q置换为i而得到的氨基酸序列。
[0184]
序列号34所示的氨基酸序列(m＿prt525)相对于met-prt410(序列号7)，在丙氨酸残基连续而成的区域(a5)中插入2个丙氨酸残基、使c末端侧的结构域序列缺失2个以使得其与met-prt410的分子量几乎相同、并且将13处的谷氨酰胺残基(q)置换为丝氨酸残基(s)或脯氨酸残基(p)而得到的氨基酸序列。
[0185]
序列号32所示的氨基酸序列(m_prt699)是将m_prt525(序列号34)中的qq全部置换为vl而得到的氨基酸序列。
[0186]
序列号33所示的氨基酸序列(m_prt698)是将m_prt525(序列号34)中的qq全部置换为vl、并且将其余的q置换为i而得到的氨基酸序列。
[0187]
序列号43所示的氨基酸序列(met-prt966)是将序列号9所示的氨基酸序列(在c末端添加序列号42所示的氨基酸序列之前的氨基酸序列)中的qq全部置换为vf，并且将其余的q置换为i而得到的氨基酸序列。
[0188]
序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33及序列号43所示的氨基酸序列的谷氨酰胺残基含有率均为9％以下(表2)。
[0189]
[表2]
[0190][0191]
(6-i)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33或序列号43所示的氨基酸序列构成。
[0192]
(6-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包括与序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33或序列号43所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。(6-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白也为包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0193]
(6-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白的谷氨酰胺残基含有率优选为9％以下。此外，(6-ii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白的gpgxx基序含有率优选为10％以上。
[0194]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白可以在n末端及c末端中的任意一端或两端包含标签序列。由此，可以实现改造蜘蛛丝丝心蛋白的分离、固定、检测及可视化等。
[0195]
作为包含标签序列的第6改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体的例子，可以列举出包括(6-iii)序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41或序列号44所示的氨基酸序列的改造丝心蛋白，或者包括与(6-iv)序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41或序列号44所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0196]
序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41及序列号44所示的氨基酸序列分别在序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33及序列号43所示的氨基酸序列的n末端添加序列号12所示的氨基酸序列(包含his标签序列及铰链序列)。由于仅在n末端添加了标签序列，因此谷氨酰胺残基含有率没有变化，序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41及序列号44所示的氨基酸序列的谷氨酰胺残基含有率均为9％以下(表3)。
[0197]
[表3]
[0198][0199]
(6-iii)的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以由序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41或序列号44所示的氨基酸序列构成。
[0200]
(6-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白包括与序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41或序列号44所示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。(6-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白也为包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0201]
(6-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白的谷氨酰胺残基含有率优选为9％以下。此外，(6-iv)的改造蜘蛛丝丝心蛋白的gpgxx基序含有率优选为10％以上。
[0202]
第6改造蜘蛛丝丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白生产系统所生产的蛋白质释放
到宿主外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主种类来适当设定。
[0203]
改造蜘蛛丝丝心蛋白可以为兼具第1改造蜘蛛丝丝心蛋白、第2改造蜘蛛丝丝心蛋白、第3改造蜘蛛丝丝心蛋白、第4改造蜘蛛丝丝心蛋白、第5改造蜘蛛丝丝心蛋白及第6改造蜘蛛丝丝心蛋白所具有特征中的至少2种以上特征的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0204]
改造蜘蛛丝丝心蛋白可以是亲水性改造蜘蛛丝丝心蛋白，也可以是疏水性改造蜘蛛丝丝心蛋白。求出构成改造蜘蛛丝丝心蛋白的所有氨基酸残基的疏水性指标(hi)总和，然后通过该总和除以氨基酸残基总数得到值(平均hi)，疏水性改造蜘蛛丝丝心蛋白是指该值(平均hi)为0以上的改造蜘蛛丝丝心蛋白。疏水性指标如表1所示。此外，亲水性改造蜘蛛丝丝心蛋白是指上述平均hi小于0的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0205]
作为疏水性改造蜘蛛丝丝心蛋白，例如，可以列举出上述第6改造丝心蛋白。作为疏水性改造蜘蛛丝丝心蛋白的更具体示例，可以列举出包含序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33或序列号43所示的氨基酸序列、以及序列号35、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41或序列号44所示的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0206]
作为亲水性改造蜘蛛丝丝心蛋白，例如，可以列举出上述第1改造丝心蛋白、第2改造丝心蛋白、第3改造丝心蛋白、第4改造丝心蛋白及第5改造丝心蛋白。作为亲水性蜘蛛丝蛋白的更具体的例子，可以列举出包括序列号4所示的氨基酸序列，序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列，序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列，序列号18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列，序列号17、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列，序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列的改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0207]
上述的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以单独使用1种，或者组合使用2种以上。
[0208]
例如，通过对具有编码该改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸序列和以可工作的方式连接于该核酸序列的一个或多个调控序列的表达载体进行转化的宿主来表达该核酸，从而也可以生产改造蜘蛛丝丝心蛋白。
[0209]
编码改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸的制造方法并没有特别限制。例如，可以通过利用编码改造蜘蛛丝丝心蛋白的基因，并通过聚合酶链式反应(pcr)进行扩增、克隆的方法，或进行化学合成的方法来制造该核酸。核酸的化学合成方法也没有特别限制，例如，可以通过将基于由ncbi的网络数据库等获得的蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列信息、并且用akta oligopilot plus 10/100(ge healthcare
·
japan株式会社)等自动合成的寡核苷酸利用pcr等进行连接的方法来化学合成基因。此时，为了容易地进行改造蜘蛛丝丝心蛋白的纯化及/或确认，可以对编码在n末端添加了由起始密码子及his10标签构成的氨基酸序列的氨基酸序列所构成的改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸进行合成。
[0210]
调控序列为控制宿主中的重组蛋白的表达的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，并且可以根据宿主的种类进行适当选择。作为启动子，也可以使用在宿主细胞中发挥功能，可表达诱导作为目标的改造蜘蛛丝丝心蛋白的诱导性启动子。诱导型启动子为可以通过诱导物质(表达诱导剂)的存在、阻遏分子的不存在或者温度、渗透压或ph值的上升或下降等物理因素来控制转录的启动子。
[0211]
表达载体的种类可以根据宿主的种类来适当地选择质粒载体、病毒载体、柯斯质
粒载体、福斯质粒载体、人工染色体载体等。作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够整合到宿主的染色体中且在能够转录编码改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸的位置处包含启动子的载体。
[0212]
作为宿主，可以优选使用原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞及植物细胞等真核生物中的任意一种。
[0213]
在使用细菌等原核生物作为宿主的情况下，表达载体优选为能够在原核生物中自主复制且同时包含启动子、核糖体结合序列、编码改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸及转录终止序列的载体。也可以含有控制启动子的基因。
[0214]
作为原核生物，可以列举出属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属及假单胞菌属等的微生物。作为属于埃希氏菌属的微生物，例如，可以列举出大肠杆菌等。作为属于短芽孢杆菌属的微生物，例如，可以列举出土壤短芽孢杆菌等。作为属于沙雷氏菌属的微生物，例如，可以列举出液化沙雷氏菌等。作为属于芽孢杆菌属的微生物，例如，可以列举出枯草芽孢杆菌等。作为属于微杆菌属的微生物，例如，可以列举出嗜氨微杆菌等。作为属于短杆菌属的微生物，例如，可以列举出叉开短杆菌等。作为属于棒杆菌属的微生物，例如，可以列举出产氨棒杆菌等。作为属于假单胞菌(pseudomonas)属的微生物，例如，可以列举出恶臭假单胞菌等。
[0215]
在以原核生物作为宿主的情况下，作为导入编码改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸的载体，例如，可以列举出pbtrp2(勃林格殷格翰公司制)、pgex(pharmacia公司制)、puc18、pbluescriptii、psupex、pet22b、pcold、pub110、pnco2(日本特开2002-238569号公报)等。
[0216]
作为真核生物宿主，例如，可以列举出酵母及丝状真菌(霉菌等)。作为酵母，例如，可以列举出属于酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属等的酵母。作为丝状真菌，例如，可以列举出属于曲霉属、青霉属、木霉(trichoderma)属等的丝状真菌。
[0217]
在以真核生物作为宿主的情况下，作为导入编码改造蜘蛛丝丝心蛋白的核酸的载体，例如，可以列举出yep13(atcc37115)、yep24(atcc37051)等。作为向上述宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向上述宿主细胞中导入dna的方法都可以使用。例如，可以列举出使用钙离子的方法[proc.natl.acad.sci.usa,69,2110(1972)]、电穿孔法、原生质球法、原生质体法、乙酸锂法、感受态法等。
[0218]
作为基于利用表达载体进行转化后的宿主的核酸表达方法，除了直接表达以外，还可以依据分子克隆第2版中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。
[0219]
改造蜘蛛丝丝心蛋白例如可以通过将进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养，使改造蜘蛛丝丝心蛋白在培养用培养基中生成蓄积，并从该培养用培养基中收集来进行制造。在培养用培养基中培养转化后的宿主的方法可以按照在宿主的培养中通常使用的方法来进行。
[0220]
在宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为培养用培养基，只要是含有该宿主可同化的碳源、氮源及无机盐类等、并且能够高效地进行该宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。
[0221]
作为碳源，只要是该宿主可同化的物质即可，例如，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉及淀粉水解物等碳水化合物、乙酸及丙酸等有机酸、以及乙醇及丙醇等醇类。
[0222]
作为氮源，例如，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵及磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕及豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。
[0223]
作为无机盐类，例如，可以使用磷酸氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜及碳酸钙。
[0224]
大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的ph值优选保持在3.0～9.0之间。培养用培养基的ph的调整可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙及氨等进行。
[0225]
此外，在培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄西林及四环素等抗生素。当对通过使用诱导型启动子以作为启动子的表达载体进行转化后的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对通过使用lac启动子的表达载体进行转化后的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷等；在对通过使用trp启动子的表达载体进行转化后的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
[0226]
由转化后的宿主生产的改造蜘蛛丝丝心蛋白可以通过通常用于蛋白质的分离纯化的方法进行分离及纯化。例如，在改造蜘蛛丝丝心蛋白以溶解状态在细胞内进行表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、manton-gaulin高压匀浆器和戴诺研磨机(dyno-mill)等将宿主细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过对该无细胞提取液进行离心分离而得到的上清液中，单独或组合使用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(deae)-琼脂糖、diaion hpa-75(三菱化成公司制)等树脂的阴离子交换层析法、使用s-sepharose ff(pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。
[0227]
作为上述层析，优选采用使用了phenyl-toyopearl(东曹)、deae-toyopearl(东曹)、sephadex g-150(pharmacia biotech)的柱层析。
[0228]
此外，在改造蜘蛛丝丝心蛋白在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，同样在回收宿主细胞后将其破碎并进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收改造蜘蛛丝丝心蛋白的不溶体。回收的改造蜘蛛丝丝心蛋白的不溶体可以利用蛋白变性剂进行可溶化。该操作后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到改造蜘蛛丝丝心蛋白的纯化制备品。
[0229]
在改造蜘蛛丝丝心蛋白分泌到细胞外的情况下，可以从培养上清液中回收改造蜘蛛丝丝心蛋白。即，利用离心分离等方法对培养物进行处理，由此获得培养上清，通过使用与上述同样的分离纯化法，能够从该培养上清中得到纯化制备品。
[0230]
[肌肉组织再生剂]本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂含有改造丝心蛋白。
[0231]
本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂的形态并没有特别限制，例如可以是薄膜、片材、纤维、树脂成形体、粉末和凝胶中的任意1种或它们的多种组合，也可以是薄膜和片材中的任意1种或它们的多种组合。也可以是薄膜形态或包含薄膜形态的形态。本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂可以含有改造丝心蛋白和在不损害生物体的范围内的醇或二甲基
亚砜等溶剂。溶剂可以包含在该肌肉组织再生剂的内部。溶剂可以分散并包含在肌肉组织再生剂的内部。溶剂可以均匀地分散在肌肉组织再生剂的内部。
[0232]
由于第一实施方式所涉及的肌肉组织再生剂含有改造丝心蛋白和溶剂，因此伸长率显著提高。由于第一实施方式所涉及的肌肉组织再生剂在维持应力的同时提高了伸长率，因此还提高了韧性。
[0233]
由于本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂具有优异的强度、伸长率、韧性，因此可以优选用于医疗用途。大幅度改善手术时等的可操作性。此外，在将其粘贴于脏器等时，可起到承受反复伸缩运动的效果。
[0234]
本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂的断裂点位移优选为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、100％以上或200％以上。断裂点位移越大，表示伸长率越优异(具有高伸长率)。
[0235]
本实施方式所涉及的蛋白质薄膜的应变能优选为5mj以上、10mj以上、20mj以上或30mj以上。应变能越高，表示韧性(韧度)越优异。本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂的最大点应力例如可以为5mpa以上或10mpa以上。最大点应力(mpa)越高，表示应力越优异(具有高应力)。
[0236]
蛋白质薄膜的韧性优选为10mj/m3以上、20mj/m3以上、30mj/m3以上或40mj/m3以上。作为未拉伸膜的蛋白质薄膜的韧性可以在上述范围内。
[0237]
肌肉组织再生剂的断裂点位移、最大点应力、应变能和韧性可以通过拉伸试验来求出。具体而言，首先是将切成哑铃形状的肌肉组织再生剂作为试验片，通过拉伸试验在温度为20℃、相对湿度为65％的条件下测定的断裂点位移。拉伸试验可以在测定长度(夹具间)为8mm、测定宽度为2mm、两个夹具部的长度为7mm、两个夹具部的宽度为5mm的条件下进行。厚度测定是以n＝1对8mm的部分进行测定。拉伸试验机采用instron3345，测力计使用10n，拉伸速度为10mm/min。测定次数为每1个等级最少3次，并使用平均值。
[0238]
肌肉组织再生剂的厚度可以根据肌肉组织再生剂的用途来适当设定。例如，从容易抑制伸长率的偏差的观点出发，肌肉组织再生剂的厚度可以为1～1000μm，也可以为10～300μm，还可以为10～100μm，也可以为30～100μm，还可以为50～200μm，优选为30～70μm。肌肉组织再生剂的厚度可以通过后述的实施例中记载的方法进行测定。肌肉组织再生剂的厚度可以通过选择纺液中使用的溶剂等来调整。例如，当纺液溶剂使用水的情况下，存在容易获得厚度为30～100μm的肌肉组织再生剂的倾向，而当纺液溶剂使用有机溶剂的情况下，存在容易获得厚度为50～200μm的蛋白质薄膜的倾向。
[0239]
肌肉组织再生剂可以进行甲醇处理，也可以不进行甲醇处理。从伸长率和韧性的观点出发，优选不进行甲醇处理，而从应力的观点出发，也可以进行甲醇处理。甲醇处理可以通过使蛋白质薄膜与甲醇相接触来实施。甲醇处理可以包括在其与甲醇接触后使甲醇干燥的步骤。例如，甲醇处理是将肌肉组织再生剂在室温(20～30℃)下浸渍于甲醇中，然后用离子交换水洗涤，洗涤时间例如可以为1～10分钟。然后，可以通过在室温(20～30℃)下干燥来实施。肌肉组织再生剂与甲醇相接触的时间例如可以为1～10分钟。作为甲醇，可以使用和光纯药试剂特级99.5％甲醇。
[0240]
由于本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂以改造丝心蛋白为原料，因此还具有生物降解性。本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂可以为例如在哺乳动物体内可在120天以
内、100天以内、80天以内、70天以内、60天以内或50天以内进行生物降解的再生剂。从抑制因长时间残留在体内而可能引起的不期望的异物反应(血栓、感染、增厚、包被等)的发生风险，并有效地促进治愈的观点出发，优选为在80天以内分解，更优选为在70天以内、60天以内或50天以内分解。用于可在上述天数内生物降解的肌肉组织再生剂可以仅仅含有改造丝心蛋白，也可以含有改造丝心蛋白以外的成分。作为改造丝心蛋白以外的成分，例如，可以列举出上述醇、水、有机溶剂和高分子增塑剂等，而从保持改造丝心蛋白的生物降解性的观点出发，优选为具有生物降解性的成分且不阻碍改造丝心蛋白的生物降解的成分。作为这种成分，例如，可以列举出醇、水和二甲基亚砜。此外，从相同的观点出发，优选肌肉组织再生剂中除了改造丝心蛋白以外的成分含量较少的成分，例如，以肌肉组织再生剂的总质量％为基准，优选为50质量％以下、40质量％以下、30质量％以下。
[0241]
丝心蛋白具有生物降解性，包括可在生物体内降解的产物，无毒，并且安全。
[0242]
作为人工制备的改造丝心蛋白比从蚕中获得的丝心蛋白更为优异的方面，可以列举出如下的特性。
[0243]
例如，当天然来源的丝心蛋白在用于医疗用途的情况下，例如在饲养蚕时，有时会因其所食用的桑叶中所含的金属等而引发过敏。根据蚕的饲养、保管条件，有时高级结构、在水中的溶解性、耐性会发生变化，因此在确保产品稳定性方面尚有改进的余地。在制备丝膜之前还需要考虑用于动物饲养的金钱成本、时间成本。另一方面，通过工业制备改造丝心蛋白，可以控制品质，还可以确保在短时间内进行量产，因此作为实施方式，可以说是特别优选。
[0244]
蚕丝材料的生物降解速度比较慢，因此未被美国药事事务部认定为可生物降解性材料，有时需要从体内取出。另一方面，改造丝心蛋白的生物降解性的速度快，并且不需要从体内取出，因此有望起到大幅度降低治疗后血栓、感染、增厚、包被等风险的效果。
[0245]
特别是，疏水性指标的平均值(平均hi)为0以下的丝心蛋白对水的亲和性高，因此将其作为成分进行制作的药剂有望具有更为优异的生物降解性。因此，改造丝心蛋白的平均hi优选为0以下，更优选为-0.2以下，进一步优选为-0.5以下。
[0246]
例如，将上述肌肉组织再生剂与人或人以外的动物(优选为哺乳类动物)的肌肉细胞缺损部位相接触，这有望成为一种有效的治疗方法。
[0247]
因此，本实施方式的肌肉组织再生剂可以用作处于需要肌肉组织再生的状态的治疗方法。处于需要肌肉组织再生的状态的治疗方法可以包括将肌肉组织再生剂与人或人以外的动物的肌肉细胞的缺损部位相接触的步骤。此外，肌肉组织再生剂也可以是处于需要肌肉组织再生的状态的治疗剂。作为需要肌肉组织再生的状态，例如可以列举出包含肌肉组织的缺损部位的状态，具体而言，可以列举出疝气(包括腹壁切口疝、膈疝和腹股沟疝)、残端形成部、褥疮部以及创伤部等。需要肌肉组织再生的状态可以是选自由腹壁切口疝、膈疝、腹股沟疝、残端形成部、褥疮部以及创伤部构成的组中的任意一个或它们的组合。
[0248]
肌肉组织由肌纤维的多核细胞构成，在肌纤维的细胞之间存在单核卫星细胞。此外，作为肌纤维的特征，可以列举出其不是进行细胞分裂而是通过作为干细胞的卫星细胞的作用进行再生。因此，可进行细胞游走或细胞分裂的皮肤组织等的再生与肌肉组织再生所需的要求不同。
[0249]
骨骼肌的再生包括以下过程。1)卫星细胞通常处于静止状态，不会增殖。由于肌肉
组织的损伤等刺激，其变为成肌细胞。2)成肌细胞通过细胞分裂而分化为肌肉细胞。多个肌肉细胞融合，成为多核肌管。3)肌管形成肌纤维，通过其与原有的肌纤维融合来再生骨骼肌。各个过程很难自发地发生。通过促进所有的过程，能够实现肌肉组织的再生。
[0250]
本发明的一实施方式是促进并实现包含上述过程的肌肉组织再生。本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂可以是肌肉组织缺损部位的修补和再生剂。此外，本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂也可以是肌肉组织内的卫星细胞的活化剂。此外，本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂也可以是成肌细胞向肌肉细胞的分化剂。此外，本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂也可以是成肌细胞粘合剂。本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂可以是处于需要进行肌肉组织再生的状态的、例如选自腹壁切口疝、膈疝、腹股沟疝、残端形成部、褥疮部、创伤部中的任意一种治疗剂。
[0251]
以肌肉组织再生剂的总质量为基准，肌肉组织再生剂中的改造丝心蛋白的含量优选为30质量％以上100质量％以下。此外，以肌肉组织再生剂的总质量为基准，改造丝心蛋白的含量可以为5质量％以上100质量％以下，也可以为10质量％以上100质量％以下，还可以为15质量％以上100质量％以下，也可以为30质量％以上100质量％以下。肌肉组织再生剂中的改造丝心蛋白的含量例如可以在将酸加至再生剂后，根据使用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析而获得的数据来计算。
[0252]
本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂例如可以仅仅由改造丝心蛋白构成，也可以包含改造丝心蛋白和选自醇、水、有机溶剂和高分子增塑剂中的1种以上。
[0253]
醇的类型并没有限制，可以优选地列举出碳原子数为1～20的醇。具体而言，例如可以列举出甲醇、乙醇、丙醇等。此外，从熔点高、且在常温常压下不易从含有肌肉组织再生剂的成分中消失的观点出发，醇更优选为多元醇。
[0254]
多元醇是指分子内具有2个以上羟基的醇。多元醇的羟基数例如可以为2～10，也可以为2～8，还可以为2～6，也可以为3～5，还可以是3。
[0255]
醇的碳原子数例如可以为20以下、15以下、10以下或6以下，也可以为2以上或3以上。
[0256]
作为多元醇，可以列举出低级醇、糖类、糖醇、聚乙二醇等。
[0257]
低级醇是指碳原子数为2～5个的直链醇或支链醇。作为低级醇，可以列举出甘油、丙二醇、二甘醇、乙二醇。从能够进一步提高肌肉组织再生剂的伸长率的观点出发，低级醇优选为甘油。
[0258]
作为糖类，例如可以列举出单糖类、二糖类。作为单糖类，例如可以列举出葡萄糖类。作为二糖类，例如可以列举出蔗糖、乳糖、海藻糖和麦芽糖。
[0259]
作为糖醇，可以列举出山梨糖醇、甘露糖醇等。
[0260]
以肌肉组织再生剂的总质量为基准，醇的含量可以为0.01～50质量％，也可以为0.1～40质量％，还可以为1～30质量％，或者也可以为0.01～1质量％0.01～5质量％。醇的含量可以通过凝胶渗透色谱(例如，岛津制作所制作的prominence504h)来测定。
[0261]
当肌肉组织再生剂含有水时，例如，从进一步提高肌肉组织再生剂的伸长率的观点出发，肌肉组织再生剂的含水率可以为1～70质量％或5～60质量％，优选为5～40质量％。肌肉组织再生剂的含水率是指以肌肉组织再生剂的总质量为基准的水的含量。肌肉组织再生剂可以在内部含有水。肌肉组织再生剂的含水率可以通过卡尔费休水分计mkh－
700(京都电子工业(株)，加热干燥式水分计mx－50(a&d株式会社)等来测定。
[0262]
作为有机溶剂，例如，可以列举出乙酸、甲酸、hfip、二甲基亚砜(dmso)、n,n－二甲基甲酰胺(dmf)和n,n－二甲基乙酰胺(dmac)等非质子极性溶剂。最好使用对动物无毒的挥发性溶剂，例如优选二甲基亚砜等。二甲基亚砜的熔点高，且在常温常压下几乎不会从含有肌肉组织再生剂的成分中消失，并且有助于溶解更多的有用的生物物质，从这一点出发作为材料更为有效。当肌肉组织再生剂含有有机溶剂时，蛋白质薄膜中的有机溶剂的含量可以为0.01～50质量％，也可以为0.1～40质量％，还可以为1～30质量％，或者也可以为0.01～1质量％、0.01～5质量％。有机溶剂的含量例如可以通过凝胶渗透色谱(例如，岛津制作所制作的prominence504h)来测定。
[0263]
假设在医疗用途中使用时，作为肌肉组织再生剂中含有的具有增塑效果的液体，在考虑到对患者身体的影响的情况下，优选使用醇、水、二甲基亚砜。此外，含有醇或二甲基亚砜的丝心蛋白组合物有可能有助于受损肌肉细胞位于坏死区域附近的吞噬细胞(中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等)的游走，可以期待以下效果：激活产生用于构成肌肉内结缔组织的细胞外基质(ecm)成分的成纤维细胞的生长动力学、激活肌肉卫星细胞，以及使这些细胞增殖。
[0264]
包含在肌肉组织再生剂中的液体的含量并没有特别的限制，但是从保持肌肉组织再生剂的强度的观点以及显示出有效的伸长率提高效果的观点出发，以肌肉组织再生剂的总质量为基准，液体的总量优选为0.01～50质量％，更优选为0.1～40质量％，进一步优选为1～30质量％。
[0265]
本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂可以含有不可避免的成分，例如非蛋白质中所含的夹杂物。所谓夹杂物，在合成丝心蛋白中例如为未反应的成分，在重组丝心蛋白中例如为在利用宿主细胞制备的丝心蛋白组合物中来源于宿主的组成细胞的微量磷脂等物质。可以期待这种来源于宿主的物质(夹杂物)具有促进细胞的炎症，并激活产生用于构成肌肉内结缔组织的细胞外基质(ecm)成分的成纤维细胞的生长动力学的效果。因此，认为进一步包含用于制备重组丝心蛋白的来源于宿主的物质的重组丝心蛋白组合物作为肌肉组织再生剂是有用的。
[0266]
《蛋白质薄膜》
[0267]
本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂可以是薄膜形态，也可以是包含薄膜的形态。含有改造丝心蛋白的薄膜(以下也表示为“蛋白质薄膜”)可以含有改造丝心蛋白和在不损害生物体的范围内的醇或二甲基亚砜等溶剂。溶剂可以包含在该蛋白质薄膜的内部。溶剂可以分散并包含在蛋白质薄膜的内部。溶剂可以均匀地分散在蛋白质薄膜的内部。
[0268]
由于第一实施方式所涉及的蛋白质薄膜含有改造丝心蛋白和溶剂，因此伸长率显著提高。由于第一实施方式所涉及的蛋白质薄膜在维持应力的同时提高了伸长率，因此还提高了韧性。
[0269]
由于本实施方式所涉及的蛋白质薄膜具有优异的强度、伸长率、韧性，因此可以优选用于医疗用途。大幅度改善手术时等的可操作性。此外，在将其粘贴于脏器等时，可起到承受反复伸缩运动的效果。
[0270]
本实施方式所涉及的蛋白质薄膜的断裂点位移优选为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、100％以上或200％以上。断裂点位移越大，表示伸长率越优异
(具有高伸长率)。
[0271]
本实施方式所涉及的蛋白质薄膜的应变能优选为5mj以上、10mj以上、20mj以上或30mj以上。应变能越高，表示韧性(韧度)越优异。本实施方式所涉及的蛋白质薄膜的最大点应力例如可以为mpa以上或10mpa以上。最大点应力(mpa)越高，表示应力越优异(具有高应力)。
[0272]
蛋白质薄膜的韧性优选为10mj/m3以上、20mj/m3以上、30mj/m3以上或40mj/m3以上。作为未拉伸膜的蛋白质薄膜的韧性可以在上述范围内。
[0273]
蛋白质薄膜的断裂点位移、最大点应力、应变能和韧性可以通过拉伸试验来求出。具体而言，首先是将切成哑铃形状的蛋白质薄膜作为试验片，通过拉伸试验在温度为20℃，相对湿度65％为的条件下测定的断裂点位移。拉伸试验可以在测定长度(夹具间)为8mm、测定宽度为2mm、两个夹具部的长度为7mm、两个夹具部的宽度为5mm的条件下进行。厚度测定是以n＝1对8mm的部分进行测定。拉伸试验机采用instron3345，测力计使用10n，拉伸速度为10mm/min。测定次数为每1个等级最少3次，并使用平均值。
[0274]
蛋白质薄膜的厚度可以根据蛋白质薄膜的用途来适当设定。例如，从容易抑制伸长率的偏差的观点出发，蛋白质薄膜的厚度可以为1～1000μm，也可以为10～300μm，还可以为10～100μm，也可以为30～100μm，还可以为50～200μm，优选为30～70μm。蛋白质薄膜的厚度可以通过后述的实施例中记载的方法进行测定。蛋白质薄膜的厚度可以通过选择纺液中使用的溶剂等来调整。例如，当纺液溶剂使用水的情况下，存在容易获得厚度为30～100μm的蛋白质薄膜的倾向，而当纺液溶剂使用有机溶剂的情况下，存在容易获得厚度为50～200μm的蛋白质薄膜的倾向。
[0275]
蛋白质薄膜可以是未拉伸膜，也可以是拉伸膜。拉伸膜可以是单轴拉伸膜或双轴拉伸膜。
[0276]
蛋白质薄膜可以进行甲醇处理，也可以不进行甲醇处理。从伸长率和韧性的观点出发，优选不进行甲醇处理，而从应力的观点出发，也可以进行甲醇处理。甲醇处理可以通过使蛋白质薄膜与甲醇相接触来实施。甲醇处理可以包括在其与甲醇接触后使甲醇干燥的步骤。例如，甲醇处理可以是将蛋白质薄膜在室温(20～30℃)下浸渍于甲醇中，然后用离子交换水洗涤，洗涤时间例如为0.1～10分钟。然后，可以通过在室温(20～30℃)下干燥来实施。蛋白质薄膜与甲醇相接触的时间例如可以为1～10分钟。作为甲醇，可以使用和光纯药试剂特级99.5％甲醇。
[0277]
以蛋白质薄膜的总质量为基准，改造丝心蛋白的含量可以为50～90质量％，也可以为60～85质量％，还可以为65～80质量％。蛋白质薄膜中的改造丝心蛋白的含量例如可以通过测定水和醇的含量，求出总质量与水和醇的质量之差来计算。
[0278]
《多元醇》多元醇是指分子内具有2个以上羟基的醇。多元醇的羟基数例如可以为2～10，也可以为2～8，还可以为2～6，也可以为3～5，还可以是3。
[0279]
多元醇的碳原子数例如可以为12以下、10以下、8以下或6以下，也可以为2以上或3以上。
[0280]
作为多元醇，可以列举出低级醇、糖类、糖醇、聚乙二醇等。
[0281]
低级醇是指碳原子数为2～5个的直链醇或支链醇。作为低级醇，可以列举出甘油、丙二醇、二甘醇、乙二醇。从能够进一步提高蛋白质薄膜的伸长率的观点出发，低级醇优选
为甘油。
[0282]
作为糖类，例如可以列举出单糖类、二糖类。作为单糖类，例如可以列举出葡萄糖类。作为二糖类，例如可以列举出蔗糖、乳糖、海藻糖和麦芽糖。
[0283]
作为糖醇，可以列举出山梨糖醇、甘露糖醇等。
[0284]
以蛋白质薄膜的总质量为基准，醇的含量可以为3～40质量％，也可以为5～35质量％，还可以为5～50质量％，也可以为10～30质量％。醇的含量可以通过凝胶渗透色谱(例如，岛津制作所制作的prominence504h)来测定。
[0285]
《其他成分》
[0286]
蛋白质薄膜可以仅仅由蜘蛛丝丝心蛋白和甘油构成，也可以包含其他成分。作为其他成分，可以包含水、有机溶剂、高分子增塑剂。
[0287]
当蛋白质薄膜含有水时，例如，从进一步提高蛋白质薄膜的伸长率的观点出发，蛋白质薄膜的含水率可以为1～70质量％或5～60质量％，优选为5～40质量％。蛋白质薄膜的含水率是指以蛋白质薄膜的总质量为基准的水的含量。蛋白质薄膜可以在内部含有水。蛋白质薄膜的含水率可以通过卡尔费休水分计mkh－700(京都电子工业(株)，加热干燥式水分计mx－50(a&d株式会社)等来测定。
[0288]
作为有机溶剂，例如，可以列举出乙酸、甲酸、hfip、二甲基亚砜(dmso)、n,n－二甲基甲酰胺(dmf)和n,n－二甲基乙酰胺(dmac)等非质子极性溶剂。最好使用对动物无毒的挥发性溶剂，例如优选二甲基亚砜等。当蛋白质薄膜含有有机溶剂时，蛋白质薄膜中的有机溶剂的含量可以为2～50质量％或2～30质量％。有机溶剂的含量例如可以通过凝胶渗透色谱(例如，岛津制作所制作的prominence504h)来测定。
[0289]
本实施方式所涉及的蛋白质薄膜可以含有不可避免的成分，例如蛋白质中所含的夹杂物。
[0290]
《蛋白质薄膜的制备方法》
[0291]
当本实施方式所涉及的肌肉组织再生剂为蛋白质薄膜或含有蛋白质薄膜时，蛋白质薄膜可以通过将含有蜘蛛丝丝心蛋白和溶剂的纺液流延成型于基材表面，并进行干燥和/或脱溶剂来制备。可以预先将醇添加到纺液中。当纺液含有醇时，也可以同样地获得目标蛋白质薄膜。当纺液含有醇时，通过上述方法成型，由此可以获得内部分散并包含醇的蛋白质薄膜。当纺液不含醇时，将通过上述方法成型的蛋白质薄膜浸渍在醇中，由此可以获得内部分散并包含醇的蛋白质薄膜。
[0292]
一实施方式所涉及的蛋白质薄膜具备成型工序，该成型工序使用含有蜘蛛丝丝心蛋白、醇和溶剂的纺液来成型蛋白质薄膜。
[0293]
纺液含有蜘蛛丝丝心蛋白和醇、以及用于溶解它们的溶剂。作为溶剂，只要是能够溶解蛋白质的溶剂即可，并没有特别限制，例如，可以列举出六氟－2－丙醇(hfip)和甲酸等质子极性溶剂、以及二甲基亚砜(dmso)、n,n－二甲基甲酰胺(dmf)和n,n－二甲基乙酰胺(dmac)等非质子极性溶剂。
[0294]
纺液中的蜘蛛丝丝心蛋白的含量可以根据蜘蛛丝丝心蛋白、醇和溶剂的种类等来适当设定。例如，以纺液的总质量为基准，纺液中的蜘蛛丝丝心蛋白的含量可以为1～30质量％、2～25质量％、3～20质量％、4～15质量％或5～10质量％。
[0295]
纺液中的醇的含量可以为0.1质量％以上、0.3质量％以上、0.5质量％以上、1.0质
量％以上或3.0质量％以上，也可以为15质量％以下、10质量％以下、8质量％以下或6质量％以下。
[0296]
纺液的粘度可以适当设定。例如，在温度为35℃、转速为1000rpm的条件下，纺液的粘度为15～1000cp(厘泊)。纺液的粘度可以使用例如京都电子工业公司制造的商品名“ems粘度计”进行测定。
[0297]
在成型工序中，首先，以预定厚度(例如，以干燥和/或脱溶剂后的厚度为1～1000μm)将纺液涂布在基材表面上。
[0298]
基材可以是树脂基板、硅橡胶模具、玻璃基板、金属基板等。从能够将流延成形后的膜容易地剥离的观点出发，基材优选为树脂基板。作为树脂基板，例如可以为聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜、聚四氟乙烯等氟树脂膜、聚丙烯(pp)膜、或在这些膜表面固定有机硅化合物而得到的剥离膜。从对dmso溶剂稳定、能够将纺液稳定地流延成形、能够容易地剥离成形后的膜的观点出发，基材更优选为pet膜或在pet膜表面固定有机硅化合物而得到的剥离膜。
[0299]
在成型工序中，其次，对涂布在基材上的纺液进行干燥和/或脱溶剂。干燥和/或脱溶剂可以通过例如选自真空干燥、热风干燥和风干中的至少一种方法来进行。最好尽可能地脱离溶剂。脱溶剂可以在拉伸薄膜后进行。
[0300]
干燥和/或脱溶剂后的未拉伸膜可以进行单轴拉伸或双轴拉伸。单轴拉伸或双轴拉伸可以在水中进行。双轴拉伸可以为逐级拉伸也可以为同步双轴拉伸。也可以设定为两步以上的多步拉伸。拉伸倍率优选纵、横均为1.01～6倍，更优选为1.05～4倍。若为该范围，则容易取得应力-应变的平衡。水中拉伸优选在20～90℃的水温下进行。拉伸后的膜优选在50～200℃的干热下进行5～600秒钟的热固定。通过该热固定，能够得到常温下的尺寸稳定性。需要说明的是，单轴拉伸后的膜成为单轴取向膜，双轴拉伸后的膜成为双轴取向膜。
[0301]
干燥和/或脱溶剂后的未拉伸膜、或将未拉伸膜拉伸而获得的拉伸膜可以通过与甲醇相接触来进行甲醇处理。通过甲醇处理，可以获得更硬的蛋白质薄膜。从进一步提高伸长率和韧性的观点出发，也可以不实施甲醇处理。甲醇处理的条件如上所述。通过对含有蜘蛛丝丝心蛋白和醇的蛋白质薄膜进行甲醇处理，可以控制蛋白质薄膜的韧性。因此，作为本发明的一实施方式，提供一种控制蛋白质薄膜的韧性的方法，其具备对含有蜘蛛丝丝心蛋白和醇的蛋白质薄膜进行甲醇处理的工序。
[0302]
《薄膜以外的组合物的制备方法》
[0303]
在本实施方式中，再生剂的制备方法并没有特别限制，除了薄膜以外，例如，也可以是包括以下各工序的方法。此外，在这些工序中，根据所需的组合物的物性，也可以增加用于添加溶剂或控制结晶度的工序。
[0304]
(溶液制备工序)
[0305]
溶液制备工序是用于将蛋白质溶解于dmso或hfip之类的溶剂中而获得蛋白质溶液的工序。
[0306]
在溶解工序中，作为要溶解的蛋白质，可以使用经过纯化的蛋白质，也可以使用表达蛋白质(重组蛋白质)的宿主细胞中的蛋白质。经过纯化的蛋白质可以是从表达蛋白质的宿主细胞中纯化的蛋白质。将宿主细胞中的蛋白质作为目标蛋白质溶解时，使宿主细胞与溶剂相接触，并使该宿主细胞中的蛋白质溶解于溶剂中。宿主细胞只要是表达目标蛋白质
的细胞即可，例如，可以是无损伤的细胞，也可以是进行破坏处理等处理后的细胞。此外，也可以是已进行过简单纯化处理的细胞。
[0307]
作为从表达出蛋白质的宿主细胞中纯化蛋白质的方法，并没有特别限制，但是可以使用例如日本特许6077570号公报及日本特许6077569号公报中记载的方法等。
[0308]
溶解工序可以在室温下实施，也可以在各种加热温度下进行保持，以使蛋白质溶解在溶剂中。加热温度的保持时间并没有特别限制，可以是10分钟以上，并且考虑到工业生产，优选为10～120分钟，更优选为10～60分钟，进一步优选为10～30分钟。加热温度的保持时间可以在蛋白质充分溶解且夹杂物(目标蛋白质以外的物质)溶解较少的条件下来适当设定。
[0309]
为溶解蛋白质而添加的溶剂的添加量只要是能够溶解蛋白质的量即可，并没有特别限制。
[0310]
溶解经过纯化的蛋白质时，溶剂的添加量按溶剂体积(ml)相对于蛋白质(含蛋白质的干粉)重量(g)的比值(体积(ml)/重量(g))计算，可以为1～100倍、1～50倍、1～25倍、1～10倍、1～5倍。
[0311]
溶解表达出蛋白质的宿主细胞中的蛋白质时，溶剂的添加量按溶剂(ml)相对于宿主细胞重量(g)的比值(体积(ml)/重量(g))计算，可以为1～100倍、1～50倍、1～25倍、1～10倍、1～5倍。
[0312]
蛋白质溶液可以根据需要去除不溶物。即，本实施方式中的蛋白质成型体的制备方法在溶解工序后可根据需要包含从蛋白质溶液中去除不溶物的工序。作为从蛋白质溶液中去除不溶物的方法，可以列举出离心分离、鼓式过滤器、加压过滤器等过滤器过滤等一般方法。采用过滤器过滤时，通过同时使用铈硅石、硅藻土等助滤剂及预涂剂等，可以更加有效地从蛋白质溶液中去除不溶物。
[0313]
蛋白质溶液含有蛋白质和溶解该蛋白质的溶剂(溶解用溶剂)。蛋白质溶液在溶解工序中可以含有与蛋白质一起包含的夹杂物。蛋白质溶液可以是蛋白质成型体的成型用溶液。
[0314]
蛋白质溶液中的蛋白质含量相对于蛋白质溶液总量可以为1质量％以上35质量％以下，或者5质量％以上50质量％以下。
[0315]
(成型工序)
[0316]
成型工序是用于使用含有蛋白质和生物降解性材料的粉末或溶液来成型蛋白质成型体的工序。作为蛋白质成型体的形状，并没有特别限制，除了薄膜以外，例如，可以列举出片材、纤维、多孔质体、树脂成型体、粉末等。
[0317]
(纤维成型工序)
[0318]
蛋白质溶液优选通过待成型的蛋白质成型体来调节蛋白质的浓度和粘度。
[0319]
作为调节蛋白质溶液中蛋白质浓度的方法，并没有特别限制，例如，可以列举出通过蒸馏使溶剂挥发从而提高蛋白质浓度的方法、在溶解工序中使用蛋白质浓度较高物质的方法、或者将溶剂添加量相对于蛋白质的量减少的方法等。
[0320]
适用于纺丝的粘度通常为10～50,000cp(厘泊)，粘度例如可以使用京都电子工业公司制造的商品名“ems粘度计”进行测量。蛋白质溶液的粘度不在10～10,000cp(厘泊)范围内时，可以将蛋白质溶液的粘度调节到能够纺丝的粘度。粘度调节可以使用上述方法等。
溶剂可以包含上述列出的优选无机盐。
[0321]
上述要成型的蛋白质成型体为蛋白质纤维时，可根据需要将蛋白质溶液中的蛋白质含量(浓度)调节到能够纺丝的浓度及粘度。调节蛋白质浓度及粘度的方法并没有特别限制。此外，作为纺丝方法，可以列举出湿法纺丝等。将调节到适于纺丝的浓度及粘度的蛋白质溶液作为纺液添加到凝固液中后，蛋白质凝固。此时，通过将蛋白质溶液作为丝状液体添加到凝固液中，蛋白质可凝固成丝状，并形成丝(未拉伸丝)。未拉伸丝例如可依据日本特许第5584932号公报所记载的方法来形成。
[0322]
下面示出湿法纺丝的示例，但是纺丝方法并没有特别限制，可以是干湿法纺丝等。
[0323]
作为湿法纺丝-拉伸(a)湿法纺丝凝固液，只要是能够脱溶剂的溶液即可。凝固液优选使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子数1～5的低级醇或丙酮。凝固液可以含有水。从纺丝稳定性的角度来看，凝固液温度优选为5～30℃。
[0324]
将蛋白质溶液作为丝状液体添加的方法并没有特别限制，例如，可以列举出从纺丝用喷丝头挤到脱溶剂槽的凝固液中的方法。蛋白质凝固后得到未拉伸丝。将蛋白质溶液挤到凝固液中时的挤出速度可根据喷丝头直径及蛋白质溶液粘度等适当设定，例如，采用具有直径0.1～0.6mm喷嘴的注射泵时，从纺丝稳定性的角度来看，挤出速度优选为每孔0.2～6.0ml/h，更优选为每孔1.4～4.0ml/h。装盛凝固液的脱溶剂槽(凝固液槽)的长度并没有特别限制，例如，长度可以为200～500mm。蛋白质凝固形成的未拉伸丝的收丝速度可以为例如1～14m/min，停滞时间可以为例如0.01～0.15min。从脱溶剂效率的角度来看，未拉伸丝的收丝速度优选为1～3m/min。蛋白质凝固形成的未拉伸丝可以进一步在固液中拉伸(预拉伸)，但是从抑制凝固液所用低级醇蒸发的角度来看，优选为将凝固液维持在低温，以未拉伸丝的状态从凝固液中收取。
[0325]
(b)拉伸
[0326]
还可以包括将通过上述方法获得的未拉伸丝进一步拉伸的工序。拉伸可以是一段拉伸，也可以是两段以上的多段拉伸。多段拉伸后，可以使分子多段取向，总拉伸倍率也会增加，因此适合制备高韧性纤维。
[0327]
含有蛋白质的成型体为薄膜(蛋白质薄膜)时，可根据需要将蛋白质溶液调节到能够薄膜化的浓度及粘度。作为对蛋白质进行薄膜化的方法并没有特别限制，可以列举出通过将蛋白质溶液以指定厚度涂布到对溶剂具有耐受性的平板上，形成涂膜，从涂膜上去除溶剂，从而得到指定厚度薄膜的方法等。
[0328]
含有蛋白质的成型体为多孔质体(蛋白质多孔质体)时，可根据需要调节到能够多孔质化的浓度及粘度。形成蛋白质多孔质体的方法并没有特别限制。例如，可以列举出以下方法：向调节到适于多孔质化的浓度及粘度的蛋白质溶液中添加适量的发泡剂，去除溶剂后，得到多孔质体的方法；或者，依据日本特许第5796147号中记载的方法进行。
[0329]
含有蛋白质的成型体为树脂成型体时，形成蛋白质树脂成型体的方法并没有特别限制。例如，将上述粉末制备工序中制作的干燥蛋白质粉末加入加压成型机后，使用手压机等进行加压及加热，可达到干燥蛋白质粉末所需的温度，从而获得树脂成型体。此外，蛋白质树脂成型体可依据日本特许文献(特愿2017-539869、pct/jp2016/076500)中记载的方法来形成。
[0330]
含有蛋白质的成型体为凝胶成型体(蛋白质凝胶成型体)时，形成蛋白质凝胶成型
体的方法并没有特别限制。例如，可通过将干燥蛋白质溶解到溶解用溶剂中以得到多肽溶液的溶液生成工序、以及将该溶液生成工序中生成的溶液置换为水溶性溶剂的工序，得到凝胶成型体。此时，可以在溶液生成工序与将溶解用溶剂置换为水溶性溶剂的工序之间增加浇筑到模具中成型为指定形状的工序，或者在将该溶解用溶剂置换为水溶性溶剂的工序后切割成指定形状。此外，蛋白质凝胶成型体可依据日本特许第05782580中记载的方法来形成。
[0331]
实施例
[0332]
以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限于以下实施例。
[0333]
(prt799)
[0334]
[试验例1：改造蜘蛛丝丝心蛋白的制备]
[0335]
《(1－1)蜘蛛丝蛋白(改造蜘蛛丝丝心蛋白：prt799)的制备》(编码蜘蛛丝蛋白的基因的合成、以及表达载体的构建)根据来源于金纺蜘蛛(nephila clavipe)的丝心蛋白(genbank登录号：p46804.1、gi：1174415)的碱基序列和氨基酸序列，设计了具有序列号15所示的氨基酸序列的改造丝心蛋白(以下也称为“prt799”。)。
[0336]
序列号15所示的氨基酸序列具有相对于来源于金纺蜘蛛的丝心蛋白氨基酸序列，以提高生产性能为目的对氨基酸残基执行置换、插入和缺失后获得的氨基酸序列，并且进一步地将序列号12所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加至n末端。
[0337]
接下来，合成编码prt799的核酸。在该核酸中，在5'末端添加ndei位点，并在终止密码子的下游添加ecori位点。将该核酸克隆到克隆载体(puc118)上。然后，利用ndei和ecori对该核酸进行限制酶处理并将其切出后，重组到蛋白质表达载体pet-22b(+)中，得到表达载体。
[0338]
用含有编码prt799的核酸的pet22b(+)表达载体，转化大肠杆菌blr(de3)。将该转化的大肠杆菌在含有氨苄西林的2ml lb培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄西林的100ml的种子培养用培养基(表4)中，以使od600达到0.005。将培养液温度保持在30℃，进行烧瓶培养直至od600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。
[0339]
[表4]
[0340]
种子培养用培养基
[0341][0342]
将该种子培养液添加到加有500ml生产培养基(下述表5)的发酵罐中，以使od600达到0.05。将培养液温度保持在37℃，将ph恒定控制在6.9下进行培养。此外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。
[0343]
[表5]
[0344]
生产培养基
[0345][0346]
在生产培养基中的葡萄糖完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加进料液(葡萄糖455g/1l、酵母提取物120g/1l)。将培养液温度保持在37℃，将ph恒定控制在6.9下进行培养。此外，将培养液中的溶解氧浓度维持在溶解氧饱和浓度的20％，培养20小时。然后，向培养液中添加1m的异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以使其最终浓度为1mm，并表达诱导prt799。在添加iptg后经过20个小时，离心分离培养液，并且回收菌体。使用由添加iptg前和添加iptg后的培养液制备的菌体进行sds-page，根据依赖于iptg添加的相当于prt799尺寸的条带的出现，确认到prt799的表达。
[0347]
(prt799的纯化)
[0348]
将自添加iptg起2小时后回收的菌体用20mm tris-hcl buffer(ph7.4)洗涤。将清洗后菌体悬浮在含有约1mm pmsf的20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)中，用高压均质器(gea niro soavi公司制)来破碎细胞。对破碎后的细胞进行离心分离，得到沉淀物。利用20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后沉淀物以达到100mg/ml浓度的方式悬浮在8m胍缓冲液(8m胍盐酸盐、10mm磷酸二氢钠、20mm nacl、1mm tris-hcl、ph7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制的纤维素管36/32)用水进行透析。通过离心分离来回收透析后得到的白色凝聚蛋白质(prt799)，用冷冻干燥机去除水分，回收冷冻干燥粉末。
[0349]
通过使用totallab(nonlinear dynamics ltd.)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行图像分析，确认所获得的冷冻干燥粉末中的prt799的纯化度。由其结果可知，prt799的纯化度约为85％。
[0350]
[试验例2：蛋白质薄膜的制备]
[0351]
《(2－1)蛋白质薄膜的制备》
[0352]
将在试验例1的(1－1)中获得的蜘蛛丝丝心蛋白(prt799)和甘油添加至二甲基亚砜中，制作纺液。(质量百分比为蜘蛛丝丝心蛋白5.0％、二甲基亚砜92.9％、甘油2.1％)。使用不锈钢瓶，在80℃下以200rpm搅拌溶解纺液30分钟后，冷却，并去除灰尘和气泡。
[0353]
通过以下步骤由纺液制备蛋白质薄膜。即，将上述制备的纺液浇铸成型在硅胶制的四边形模具(尺寸(长
×
宽
×
高))：2英寸
×
2英寸
×
2英寸)上，制成湿膜。然后，在60℃负压条件下使二甲基亚砜蒸发，并去除湿膜。干燥后，从硅胶制模具上剥离蛋白质薄膜。所获得的蛋白质薄膜的厚度为40～50μm左右。蛋白质薄膜的厚度使用新泻精机社制造的数字外径千分尺来测定。
[0354]
断裂点位移越高，表示伸长率越优异(具有高伸长率)，最大点应力(mpa)越高，表
示应力越优异(具有高应力)，应变能越高，表示韧性越优异。
[0355]
[实施例1：与肌肉组织再生相关的in vivo试验]
[0356]
在通过三种混合麻醉剂腹腔内给药来进行全身麻醉的条件下(盐酸美托咪啶为0.375mg/kg、咪达唑仑为2mg/kg、酒石酸布托啡诺为2.5mg/kg)，纵向切开10周龄的sd大鼠的腹部中线。将左侧的皮下组织钝性剥离后，露出左腹壁，切除2
×
3cm大小的整个腹壁，并使腹壁完全缺损。用8根7－0尼龙针将4
×
4cm大小的prt799的蜘蛛丝蛋白质薄膜固定在缺损部。用4－0vicryl缝线缝合闭合皮肤，结束手术。
[0357]
在术后第6、12、15周实施安乐死，并进行耐压试验和病理组织学评价。耐压试验是将带有10ml注射器的25g翼状针穿刺腹腔内并注入空气来进行的。病理组织学评价是通过摘除修补腹壁缺损部后的部位的组织，并在固定福尔马林后进行苏木素-伊红染色来进行的。
[0358]
(病理组织学评价)
[0359]
术后第6周
[0360]
如图4和图5所示，发现了薄膜2的残留和伴随异物反应的严重炎症细胞的浸润。在其与已知的骨骼肌的边界处发现了细骨骼肌纤维束的形成。
[0361]
术后第12周
[0362]
如图6和图7所示，骨骼肌的缺损不明显，发现了肌肉组织的再生。薄膜2没有残留，也没有发现炎症。由于材料在术后12周以内消失，因此可知其具有非常优异的生物降解性。
[0363]
与术后第15周术后第12周的发现相同，薄膜没有残留，也没有发现明显的炎症。发现骨骼肌，认为组织已被修复。
[0364]
(耐压试验结果)
[0365]
术后第6周
[0366]
即使勒紧腹部，腹壁缺损部的修补部位也不会隆起。在病理学上仅仅形成了细骨骼肌纤维束，但由于有薄膜残留，因此在肌肉组织再生之前的这个时期，认为薄膜具有能够承受腹压的强度。
[0367]
术后第12周
[0368]
即使勒紧腹部，腹壁缺损部的修补部位也不会隆起(图8)。由于薄膜在病理学上已经消失，因此认为能够充分承受腹压的肌肉组织已经再生。
[0369]
术后第15周
[0370]
与术后第12周的结果相同，由于没有隆起，因此认为肌肉组织已经再生(图9)。
[0371]
由于能够确认到肌肉组织完全缺损后肌肉会再生，因此认为肌肉再生的各个步骤、即(1)卫星细胞的活性化、(2)成肌细胞向肌肉细胞分化、(3)通过肌肉细胞的融合形成肌管、(4)从肌管形成肌纤维的各个步骤全部已进行。还进一步认为在成肌细胞或肌肉细胞与再生材料之间形成了细胞粘连。
[0372]
在本发明中，发现丝心蛋白兼具肌肉组织再生、物理强度、生物体吸收性、低过敏性等实际的肌纤维再生所需的多种特性。只有具有这样的特性，才能获得肌肉组织缺损部位的修补和再生的效果。
[0373]
由于能够对所述肌肉组织缺损部位进行修补和再生，因此能够用于例如腹壁切口疝、膈疝、腹股沟疝、残端形成部、褥疮部、创伤部的治疗。
[0374]
由于肌纤维已经再生，因此可进一步期待包括肺在内的气管和血管等的再生。
[0375]
符号说明
[0376]
1 严重炎症
[0377]
2 薄膜
[0378]
3 细骨骼肌纤维束。