高山火绒草植物细胞用于抗糖化作用的抗衰老美容处理的制作方法

1.本发明涉及雪层火绒草高山亚种植物(leontopodium nivale subsp.alpinum cass plant，以下简称高山火绒草(leontopodium alpinum))用于美容处理，特别是局部处理。
2.因此，本发明涉及用于哺乳动物、动物或人类的皮肤及其附属物(例如毛发、睫毛、眉毛、指甲、体毛)的化妆品及卫生和个人护理产品工业。


背景技术：

3.高山火绒草，也称为雪绒花，是菊科的草本植物。它生长在海拔1500m以上的比利牛斯山脉、阿尔卑斯山脉和喜马拉雅山脉，以及沟壑、岩石、寒冷、极易暴露于紫外线的恶劣地区。随后，这种植物在适应极端条件方面表现出色，因为它含有多种感兴趣的分子，并且在花和叶上都有保护性毛发。然而，这种植物的分布相对较差，因此非常罕见。
4.来自所述植物的产品可以通过常规提取方法直接从整株植物或其部分获得，或通过体外培养方法由细胞培养或组织培养从衍生自所述植物的不同器官的细胞或组织系获得。
5.本发明更具体地涉及通过体外细胞或组织培养获得的产品。
6.通过体外培养制备植物来源的提取物相比于农业工业方法(在开阔地中生长植物和随后在设施中提取)具有许多优势。由于对培养条件的全面控制，通过体外培养获得的提取物不含有毒物质(除草剂、杀虫剂、肥料、重金属和其他污染物，例如源自植物寄生虫的污染物)。此外，与存在可变性问题、与气候、天气和地理条件及其危害有关的开放区域培养相比，对体外培养条件的严格控制降低了生产线自发变异的风险，并保证了与所需目标分子相对应的次级代谢物的可再现模式。此外，该技术克服了诸如植物的自然生物循环和次生代谢产物生产的季节性等障碍，从而提高了供应的安全性和速度。此外，由于大大限制了用水量，避免了耕地的消耗，并防止了土壤污染，因此对环境的影响很小。此外，生物多样性得以保存，因为一株植物甚至一粒种子就足以启动新的体外培养。最后，该技术提供了将细胞代谢引导至感兴趣分子的产生(培养物的诱导)的可能性，并实现受控和相对快速的方案以增加某些分子的产量，包括通常在植物中少量产生的分子。
7.在迄今为止在体外植物细胞培养领域的现有技术中，根据本发明可以使用以下技术：
[0008]-未分化或去分化细胞的培养：这种类型的方法首先在琼脂培养基中从未分化细胞的分生组织细胞或从去分化细胞(取下植物、叶、茎、根或其他的片段后作为愈伤组织生长)产生高度增殖的细胞系。此后，将这些细胞系在液体培养基中培养以显著增加生物质。在生长周期结束时，在定义和优化(寻找合适的诱导培养基)的环境条件下，所述细胞生物质将合成感兴趣的分子。然后停止培养并在最佳时间进行提取以获得最大量的目标分子。最初也可以使用已经商业化的现有细胞系。
[0009]-组织或器官的培养：这种类型的培养可以涉及根部分(“根培养”)、地上部分(“芽
培养”)或体细胞胚(“体细胞胚”)。在这种类型的方法中，区分已经历由发根农杆菌细菌(根)或根癌农杆菌(茎)基因组转化的培养物。如此转化的根或地上部分的培养物具有高生长速率并且在遗传上非常稳定。它们用于在优化刺激参数后合成感兴趣的分子。然后通过常规方法对这些培养物进行提取。
[0010]
优选地，本发明更具体地涉及衍生自未分化或去分化细胞的体外培养物(下文称为植物细胞培养物)的产品。
[0011]
示意性的体外细胞培养方法包括：
[0012]-在适当的情况下，从由植物部分(叶、根、茎、芽等)的切口上获得的愈伤组织(未分化或去分化细胞簇)初步建立细胞系；
[0013]-根据预先确定的标准(恒定表型、选定代谢物的最佳和恒定生产、增殖能力)选择能够大规模生产细胞生物质的细胞系；
[0014]-然后从这个选定的细胞系产生所述细胞生物质，可能具有诱导阶段，优选在增殖阶段结束时；和
[0015]-第三，处理获得的细胞生物质以回收整个细胞，通过高压均质化破坏细胞聚集体或裂解这些细胞，然后可能提取所述细胞的内容物。
[0016]
正是这些提取物和/或完整的或破碎的细胞可以作为活性成分与生理学上可接受的赋形剂和任选地与其他额外的活性成分一起用于化妆品组合物中。
[0017]
ep2319914专利申请描述了这种体外技术，用于对理论上33种植物物种(包括高山火绒草)获得具有高产量的咖啡酸衍生物的培养的未分化细胞。相关的咖啡酸衍生物包括苯丙素类糖苷(phenylpropanoid glycosides)以及咖啡酰奎尼酸。对高山火绒草提供透明质酸酶的抑制活性。通过透明质酸酶保护透明质酸消化有助于预防性地保持真皮的完整性。


技术实现要素：

[0018]
本发明的目的在于提供一种通过体外细胞培养法获得的高山火绒草细胞用于美容处理的新用途。
[0019]
为此目的，本发明提供了通过体外细胞培养方法获得的未分化或去分化的高山火绒草植物细胞用于非治疗性的美容处理以预防或减缓皮肤中大分子、特别是蛋白质、核酸和/或脂质的糖化的用途。
[0020]
根据本发明的处理适用于保护皮肤免受由糖化引起的损害。
[0021]
人体需要糖来产生能量。然而，身体从未将消耗的糖完全用于这一有益目的。这种被吸收的糖的剩余部分将与蛋白质、核酸或脂质的氨基发生非酶促反应，产生高级糖化产物(“高级糖化终产物”，简称“age产物”)，它们随着时间的推移在组织中积累。
[0022]
功能、酶促和结构特性都发生了改变的许多糖化蛋白质的形成对细胞或生物体的正常功能发挥产生了影响。
[0023]
对于皮肤，ages不仅存在于真皮中，还存在于表皮中，直至角质层。器官受到的影响更大，因为它们的蛋白质具有较长的寿命，例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。结果是真皮的细胞外基质的机械和弹性特性发生了变化，从而变得柔韧性更差、更僵硬，而且更松弛且反应性弱。
[0024]
在皮肤细胞内，线粒体蛋白质被糖化，导致atp产生效率降低和能量产生不足。
[0025]
ages还通过其基质蛋白的糖化/改变而改变血管的通透性。然后发生的微炎症反应导致血流降低和血液化合物泄漏到血管外。这导致它们周围积聚流体和废物，形成黑眼圈和某些类型的眼袋。
[0026]
因此，ages是细胞功能障碍的一个主要来源，它们的积累往往会改变组织和细胞的特性和性能：柔韧性更小、流动性降低、反应性降低、能量产生减少。所有功能都改变了。
[0027]
因此，这些生化过程对皮肤的影响(其影响刚刚在细胞水平上进行了描述)是显著的。糖化会导致皮肤暗沉、松弛、没有光泽、看起来很疲倦，例如黑眼圈和眼袋、五官松弛以及皮肤缺乏色调和柔软度。
[0028]
因此，本领域确实需要化妆品。
[0029]
申请人已表明，根据本发明的高山火绒草的未分化或去分化细胞对糖化具有预防作用，以减缓或甚至阻止其发生。这种效果与年龄无关，根据本发明的用途不限于治疗老化皮肤。
[0030]
根据本发明，高山火绒草的未分化或去分化细胞尤其可用于：
[0031]-防止皮肤疲劳；和/或
[0032]-防止皮肤失去弹性；和/或
[0033]-保持皮肤及其附属物肤色的光泽；和/或
[0034]-防止黑眼圈和眼袋的形成。
[0035]
根据本发明，可将高山火绒草的未分化或去分化细胞在高压下混合后使用，以使培养基均质化并破坏细胞聚集体。
[0036]
根据本发明，高山火绒草的未分化或去分化细胞可以整体使用或裂解使用，或以由这些细胞产生的细胞提取物的形式(清除或未清除细胞壁)使用。
[0037]
根据本发明，高山火绒草的未分化或去分化细胞可以用任何生理上可接受的溶剂或这些溶剂的任何混合物提取。提取可以根据可以组合的各种已知方法进行：热提取、浸渍、煎煮、输注、加压浸出、超声、微波、通过任何合适的化学或物理方法裂解细胞。相分离可以通过过滤或离心来完成。或者，可以用超临界或亚临界流体提取生物质。
[0038]
根据本发明，细胞提取物的更高纯化也可以考虑通过所有工业上可用的方法，通过液-液分配或色谱法，例如使用吸附树脂，以浓缩感兴趣的分子，例如两种绒花酸(leontopodicacid)a和/或b.
[0039]
根据本发明，高山火绒草的未分化或去分化细胞也可以干燥形式使用，通过雾化或优选通过冻干制备。这允许它们长期储存并保留它们的生物活性。因此也可以有利地生产例如粉末类型的无水制剂。
[0040]
在以下描述中，“植物细胞”包括通过体外细胞培养过程制备的高山火绒草的未分化或去分化细胞，无论是完整的还是裂解的，无论是否经历过高压均质化，无论是新鲜的还是干燥的形式，还包括来自这些细胞的提取物(清除或未清除细胞壁)。
[0041]
根据本发明，所述植物细胞可以掺入(例如悬浮或溶解)在生理可接受的介质中并用于制备化妆品组合物。
[0042]
它们也可以按原样使用，任选地粉碎以限定和均化它们的粒度，以干粉配方，例如用于化妆护理。然后将干燥的植物细胞包含在无水化妆品组合物中。
[0043]
根据另一个实施方案，使用包含悬浮和/或溶解在亲水性基质中的所述植物细胞的根据本发明的化妆品组合物。
[0044]
更优选地，根据本发明的美容处理是局部的。
[0045]
令人惊讶的是，申请人已通过体内试验表明，皮肤的美容处理，包括施用包含通过体外细胞培养过程获得的高山火绒草的未分化或去分化细胞的组合物，在这些皮肤上诱导了抗糖化作用。
[0046]
这些测试的结果在下面的描述中更详细地呈现。
[0047]
最后，本发明提供了如上定义的植物细胞在制造非治疗性化妆品活性成分中的用途，以及在包含悬浮和/或溶解在生理可接受介质(所述介质可以是亲水性基质)中的所述活性成分的组合物的用途，以防止皮肤中大分子特别是蛋白质、核酸和脂质的糖化。下面在描述中给出活性成分和化妆品组合物的实例。
[0048]
根据本发明，使用富含绒花酸a和/或b，优选a和b的植物细胞。蛋白质、氨基酸、植物甾醇、脂质和多糖也已被确定为根据本发明使用的植物细胞中的化合物类别。
[0049]
为了获得可以根据本发明使用的去分化或未分化的植物细胞，可以实施以下方法：
[0050]
1)从选定的高山火绒草品系中，通过连续预培养和增加大小来产生关键的前生物质；
[0051]
2)在生物反应器中由所述前生物质和合适的培养基产生所述去分化或未分化细胞的生物质；和
[0052]
3)从所述培养基中分离富含绒花酸的所述生物质，从而回收所述去分化或未分化细胞。
[0053]
根据可选的性质：
[0054]
1)生物反应器中的生产步骤可以包括激发步骤，有利地用于增加绒花酸a和/或b的含量或改变其相对比例；和/或
[0055]
2)在培养7至21天、优选10至14天后，通过过滤从反应器中收集生物质；使得有利地产生最大可能量的具有高活力的生物质；和/或
[0056]
3)可以对所述生物质进行高压均质化步骤，以破坏细胞聚集体；和/或
[0057]
4)可增加干燥细胞生物质的额外步骤，以更好地长期保存；和/或
[0058]
5)可以提取所述细胞，特别是用于富集绒花酸a和b。
[0059]
通常，感兴趣的化合物的激发可以通过向培养物中添加微生物级分(包括酵母菌)，向培养物中添加生物分子例如壳聚糖、茉莉酸甲酯、茉莉酸、水杨酸，向培养物中添加非生物分子如多效唑，对培养物施加温度、ph或由不可代谢的糖如甘露醇引起的渗透压的变化，使培养基中的大量元素和糖更加贫化，向培养物中添加吸附性树脂，它们除了引起感兴趣的化合物的产生外，还可能捕获所述化合物。
[0060]
优选地，根据本发明，通过改变培养基，特别是营养水平来实现激发。
[0061]
制备用于实施本发明的组合物
[0062]
化妆品组合物，尤其是局部用的，包括在生理可接受的介质中的植物细胞。根据所述植物细胞的赋形剂和剂量，所述组合物将是浓缩的活性成分或直接用于最终用户的较不浓缩的最终组合物。
[0063]“生理上可接受的介质”根据本发明是指但不限于水性或水-醇溶液、油包水乳液、水包油乳液、微乳液、水凝胶、无水凝胶、血清、囊泡分散体或粉末。
[0064]“生理上可接受的”是指组合物适合局部或透皮使用，与哺乳动物，特别是人的粘膜、附属物(指甲、毛发)、头皮和皮肤接触，组合物可被摄入或注射到皮肤中，没有毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等风险。这种“生理上可接受的介质”形成了通常所说的组合物赋形剂。
[0065]
本发明的植物细胞可以与有效浓度的其他活性成分组合，这些活性成分可以协同或额外地用于增强和实现本发明所述的期望效果，例如以下药剂：uva和/或uvb过滤剂、水合剂、保湿剂、湿润剂、镇静剂、皮肤舒缓剂、纤体剂、重塑剂、紧致剂、重新丰盈剂、提升剂、平滑、作用于血液微循环、炎症、自由基、抗衰老、抗细纹和皱纹、美白、作用于肤色、抗糖化、抗羰基化,促进色素沉着、作用于角质层、真皮-表皮交界处、hsp蛋白产生、皮肤紧致、弹性和色调、毛发生长或抗再生(包括睫毛和眉毛)、眼部轮廓(黑眼圈和眼袋)、肽、维生素等。
[0066]
根据本发明，植物细胞可以以本领域技术人员已知的任何形式或载体，特别是以溶液、分散体、乳液、糊剂或粉末，单独或作为预混物或在载体中单独地或作为载体中的预混物，例如大胶囊、微胶囊或纳米胶囊、大球、微球、纳米球、脂质体、油质体或乳糜微粒、大颗粒、微颗粒或纳米颗粒或者大海绵、微海绵或纳米海绵、微乳液或纳米乳液或者吸附在有机聚合物粉末、滑石、膨润土、孢子或外壁以及其他无机或有机载体上。
[0067]
例如，在化妆品中，尤其可以在面部、身体、头发和体毛的护肤系列以及包括眉毛和睫毛在内的彩妆系列中提供应用。
[0068]
一般而言，根据本发明的植物细胞可以以任何形式使用，以结合或掺入或吸收或吸附在大颗粒、微颗粒和纳米颗粒，或者大胶囊、微胶囊和纳米胶囊上的形式使用，用于处理纺织品、天然或合成纤维、羊毛和任何可用于白天或晚上与皮肤接触的衣服或内衣的材料、手帕或布料，以通过这种皮肤/纺织品接触发挥其美容效果并允许持续局部给药。
[0069]
ctfa(《国际化妆品成分词典和手册》(2019年第19版)由“the personal care products counci”出版，前身为“the cosmetic,toiletry,and fragrance association,inc.”，华盛顿特区)，非限制性地描述了皮肤护理工业中常用的各种化妆品和药物成分，它们适合用作根据本发明的组合物中的附加成分。
[0070]
在sederma的商业文献和网站www.sederma.com上可以找到特别有用的其他护肤活性物质。
[0071]
还可以提及以下商业活性物质，例如：甜菜碱、甘油、actimoist bio 2
tm
(活性有机物),aquacacteen
tm
(mibelle ag cosmetics),aquaphyline
tm
(silab),aquaregulk
tm
(solabia),carciline
tm
(greentech),codiavelane
tm
(biotech marine),dermaflux
tm
(arch chemicals,inc),hydra'flow
tm
(sochibo),hydromoist l
tm
(symrise),renovhyal
tm
(soliance),seamoss
tm
(biotech marine),argireline
tm
(lipotec的乙酰基己肽-3的商品名),千日菊素(spilanthol)或已知商品名为gatuline expression
tm
的千日菊(acmella oleracea)提取物,已知商品名为boswellin
tm
的齿叶乳香树(boswellia serrata)提取物,deepaline pvb
tm
(seppic),syn-ake
tm
(pentapharm),ameliox
tm
,bioxilift
tm
(silab),phytocelltec
tm
argan(mibelle),papilactyl d
tm
(silab),preventhelia
tm
(lipotec),来自sederma:subliskin
tm
,venuceane
tm
,moist 24
tm
,vegesome moist 24
tm
,essenskin
tm
,
piiosa)、啤酒花(humulus lupulus)、阿拉比卡咖啡(coffea arabica)、巴拉圭茶(ilex paraguariensis)，或心叶球花(globularia cordifolia)、合欢花(albizzia julibrissin)、铃兰树(oxydendron arboretum)、红球姜(zingimber zerumbetsmith)、膜荚黄(astragaius membranaceus)、白术(atractylodes macrocephalae)、长叶车前(plantago lanceolata)、紫茉莉(mirabilis jalapa)、apium graveolens、欧夏至草(marrubium vulgare)、buddleja davidii franch、engelhardia chrysolepis、syringa vulgaris或兰花的提取物。
[0073]
本发明的组合物可以包含一种或多种另外的肽，包括但不限于二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其衍生物。根据一个具体实施方案，组合物中另外的肽的浓度按重量计是1
×
10-7
％至20％，优选地1
×
10-6
％至10％，优选地1
×
10-5
％至5％。术语“肽”在本文中是指包含10个氨基酸或更少的肽、它们的衍生物、异构体和与其他物类如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)的复合物。术语“肽”是指天然肽和合成肽两者。它也指包含肽并且见于自然界和/或商购可得的组合物。
[0074]
适用于本文的二肽包括但不限于肌肽(βah)、yr、vw、nf、df、kt、kc、ck、kp、kk、tt、pa、pm或pp。
[0075]
适用于本文的三肽包括但不限于rkr、hgg、gkh、ghk、ggh、ghg、kgh、khg、kfk、kavak、kβak、kabuk、kacak、kpk、kmok、kmo2k(mo2是二氧化的甲硫氨酸亚砜)、kvk、ppl、ppr、spr、qpa、lpa、spa、k(ac)hg或k(ac)gh(k(ac)是其侧链胺基官能被乙酰化的赖氨酸，如wo2017/216177中所公开的)、k(p)hg或k(p)gh(k(p)是其侧链接枝有脯氨酸的赖氨酸)、k(pyr)hg或k(pyr)gh(k(pyr)是其侧链接枝有焦谷氨酸的赖氨酸)、k(hyp)hg或k(hyp)gh(k(hyp)是其侧链接枝有羟脯氨酸的赖氨酸，如wo2016/097965中所公开的)。
[0076]
适合用作本文附加肽的四肽包括但不限于rsrk(seq id no:1)、gqpr(seq id no:2)、ktfk(seq id no:3)、ktak(seq id no:4)、kayk(seq id no:5)或kfyk(seq id no:6)。
[0077]
五肽的一个合适的非限制性实例是kttks(seq id no:7)和ktsks(seq id no:8)，六肽的合适例子是gkttks(seq id no:9)、gktsks(seq id no:10)和vgvapg(seq id no:11)。
[0078]
根据本发明使用的其他合适的肽包括但不限于以下列表：肽的亲脂性衍生物，优选地棕榈酰基(pal)衍生物或肉豆蔻酰基(myr)，以及如上所述的金属复合物(例如三肽hgg或ghk的铜复合物)。优选的二肽包括例如n-棕榈酰基-β-ala-his、n-乙酰基-tyr-arg-十六烷基酯(calmosensine
tm
，来自sederma的idealift
tm
)，pal-rt或pal-kt(sederma)。优选的三肽衍生物包括例如pal-gkh和pal-ghk(来自sederma)、hgg的铜衍生物(sigma的lamin
tm
)、lipospondin(n-elaidoyl-kfk)及其保守取代的类似物、n-乙酰基-rkr-nh2(肽ck+)、n-biot-ghk(来自sederma)、pal-kavak、pal-kβalak、pal-kabuk、pal-kacak或pal-kmo2k(来自sederma的)、pal-kvk(dsm的syn-coll
tm
)及其衍生物。
[0079]
本文也可以提及wo2015181688申请中描述的通式x-pro*-pro*-xaa-y的抗衰老三肽，其中xaa选自leu、arg、lys、ala、ser和asp，在n-末端，x选自h、-co-r1和-so
2-r1，并且在c末端y选自oh、or1、nh2、nhr1或nr1r2，r1和r2彼此独立地选自烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、烷氧基和芳氧基基团，其可以是线性、分支、环状、多环、不饱和、羟基化、羰基化、磷酸化和/或硫化的，所述基团在其骨架中可能具有杂原子，特别是o、s和/或n，并且pro*对应于脯氨酸、
其类似物或衍生物；包括例如myr-ppl-oh和myr-ppr-oh。
[0080]
本文还可以进一步引用wo2014/080376中公开的通式x-(xaa1)
n-pro*-xaa
2-y的促着色和/或促-mec二肽和三肽，其中n＝0、1或2，xaa1是选自ala、val、met、leu、iso、phe、pro及其类似物和衍生物的疏水氨基酸；或选自ser、thr、tyr、asp、glu及其类似物和衍生物的极性氨基酸；且当n＝2时，两个氨基酸xaa1相同或不同；xaa2是选自ala、val、met、leu、iso、phe及其类似物和衍生物的疏水性氨基酸，或选自arg、lys、his及其类似物和衍生物的碱性氨基酸；在n末端x选自h、-co-r1和-so
2-r1；在c末端y选自oh、or1、nh2、nhr1或nr1r2；r1和r2彼此独立地选自烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、烷氧基和芳氧基基团，其可以为线性、分支、环状、多环、饱和、不饱和、羟基化、羰基化、磷酸化和/或硫化的，所述基团在其骨架中具有或不具有o、s和/或n杂原子，并且pro*对应于脯氨酸、其类似物或衍生物；包括例如以下肽pal-spr-oh、pal-ppr-oh、pal-qpa-oh、pal-lpaoh、myr-spa-oh、pal-pm-oh、pal-pa-oh和pal-pp-oh。
[0081]
用作根据本发明的附加肽的合适的四肽衍生物包括但不限于pal-gqpr(seq id no:12)(来自sederma)、pal-ktfk(seq id no:13)或ela-ktfk(seq id no:14)、ela-ktak(seq id no:15)、ela-kayk(seq id no:16)或ela-kfyk(seq id no:17)。用作本文附加肽的合适的五肽衍生物包括但不限于pal-kttks(seq id no:18)(可从sederma以获得)、pal-ktsks(seq id no:19),pal-yggfxaa(seq id no:20)，其中xaa是leu或pro，或其混合物。
[0082]
用于本文的合适的六肽衍生物包括但不限于pal-vgvapg(seq id no:21)、pal-gkttks(seq id no:22)、pal-gktsks(seq id no:23)、pal-hldiixaa(其中xaa是trp、phe、tyr、tic、7-羟基-tic或tpi)(seq id no:24)及其衍生物。还可以提及pal-ghk和pal-gqpr(seq id no:12)(3000,sederma)的混合物。
[0083]
可以提及以下市售肽以及其他活性成分：
[0084]-vialox
tm
(inci名称＝五肽-3(包含丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸的合成肽))，syn-ake
tm
(β-ala-pro-dab-nh-bzl)或syn-coll
tm
(pal
–
lys-val-lys-oh)，由pentapharm销售；
[0085]-argireline
tm
(ac-glu-glu-met-gln-arg-arg-nh2(inci名称＝乙酰基六肽-3)(seq id no：25)、leuphasyl
tm
(tyr-d-ala-gly-phe-leu)(seq id no：26)、aldenine
tm
(gly-his-lys)、trylagen
tm
(inci名称＝假交替单胞菌(pseudoalteromonas)发酵提取物，水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三肽10瓜氨酸(瓜氨酸和三肽-10(由天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的合成肽)的反应产物)、三肽-1)、eyeseryl
tm
(ac-β-ala-his-ser-his)(seq id no：27)、serilesine
tm
(ser-ile-lys-val-ala-val)(seq id no 28)或decorinyl
tm
(inci名称：三肽-10瓜氨酸＝瓜氨酸和三肽-10(由天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的合成肽)的反应产物)，由lipotec销售；
[0086]-collaxyl
tm
(gly-pro-gln-gly-pro-gln(seq id no 29))或quintescine
tm
(cys-gly)，由vincience销售；
[0087]-cytokinol
tm
ls(酪蛋白水解物)，由les laboratoires serobiologiques/cognis销售；
[0088]-kollaren
tm
(gly-his-lys)、ip2000
tm
(pal-val-tyr-val)或meliprene
tm
(inci名称＝单氟七肽-1：醋酸与包含精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、正亮氨酸、对氟苯丙氨酸和色氨酸的合成肽的反应产物)，由l’lnstitut europ
é
en de biologie cellulaire销售；
[0089]-neutrazen
tm
(pal-his-d-phe-arg-nh2)，由innovations销售；或
[0090]-bont-l-peptide
tm
(inci名称＝棕榈酰基六肽-19：棕榈酸和六肽-19(由天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸组成的合成肽)的反应产物)、timp-peptide
tm
(inci名称＝乙酰基六肽-20：通过六肽-20(由丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸和脯氨酸组成的合成肽)的乙酰化获得的反应产物)或ecm moduline
tm
(inci名称＝棕榈酰基三肽-28：棕榈酸和三肽-28(由精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸组成的合成肽)的反应产物)，由infinitec activos销售。
[0091]
还可以设想将根据本发明的植物细胞与一种或多种环肽组合，特别是如申请人的专利申请fr1850845中所述从亚麻籽油中提取的那些环肽。
[0092]
更具体地，根据本发明的植物细胞可以与至少一种选自下述的至少一种化合物组合：维生素b3化合物、化合物如烟酰胺或生育酚、类视黄醇化合物如视黄醇、六脒、α-硫辛酸、白藜芦醇或dhea、透明质酸、肽，特别是n-乙酰基-tyr-arg-o-十六烷基酯、pal-vgvapg(seq id no:21)、pal-kttks(seq id no:18)、pal-ktsks(seq id no:19)、pal-ghk、pal-kmo2k和pal-gqpr(seq id no:12)和pal-k(p)hg(在赖氨酸上接枝脯氨酸)，它们是局部化妆品或皮肤药物组合物中广泛使用的活性成分。
[0093]
本发明还提供了一种美容或皮肤局部处理的方法，用于通过防止皮肤中的大分子(特别是蛋白质、核酸和脂质)的糖化来改善皮肤及其附属物的外观和状况，其中包括向有此需要的受试者的皮肤局部施用有效量的植物细胞或在生理上可接受的赋形剂中包含它们的组合物。
[0094]
根据本发明，“局部处理”或“局部使用”意指旨在在其施加的地方
‑‑‑
皮肤、粘膜和/或附属物处起作用的应用。
[0095]
包含根据本发明的植物细胞的组合物可以局部施用于目标区域。
[0096]“有效”量取决于多种因素，例如年龄、患者状况、疾病或病理的严重程度、给药方式等。有效量是指足以达到所需效果的无毒量.
[0097]
当所述植物细胞以液体形式使用时，包含所述植物细胞的形成活性成分的组合物优选包含基于成分总重量计至少0.04％的绒花酸a和b。
[0098]
该成分然后可以以所述制剂的0.1至10重量％，优选1至5重量％，更优选2至3重量％，通常为2重量％用于最终化妆品制剂中；其对应于最终化妆品制剂中绒花酸a和b的含量相对于组合物总重量而言为0.00004％至0.004％，优选0.0004％至0.002％，更优选0.0008％至0.0012％，通常至少0.0008％。
[0099]
当植物细胞以固体形式使用时，包含所述植物细胞的形成活性成分的组合物优选包含基于成分总重量的约5％绒花酸a和b。然后可以将该成分以适合于获得上述优选含量的绒花酸a和b的比例用于最终化妆品配方中。
[0100]
本文使用的所有百分比和比率均以总组合物的重量计，并且所有测量均在25℃下进行，除非另有说明。
[0101]
例如，对于面部的美容处理，european cosmetics directive规定了涂抹乳霜的
标准用量为2.72mg/cm2/天/人，润肤露的标准用量为0.5mg/cm2/天/人。
[0102]
根据其他具体特征，根据本发明的美容处理方法可以与一种或多种其他针对皮肤的处理方法相结合，例如光疗、热疗或芳香疗法。
[0103]
根据本发明，可以提出具有多个隔室或套件的装置以应用上述方法，其中可以例如且非限制性地包括包含根据本发明的活性细胞的组合物的第一区室，以及在第二区室中的另一种活性成分和/或赋形剂，在这种情况下，包含在所述第一和第二区室中的组合物被认为是组合组合物，用于同时、分开或分步使用，特别是在上述处理方法之一中。
[0104]
发明详述
[0105]
通过以下对植物细胞制备实例的详细描述以及在这些细胞上实现的体外和体内试验将更好地理解本发明，并且其他优点将显现出来。
[0106]
a)植物细胞的制备实例
[0107]
细胞系的建立
[0108]
收集选定的高山火绒草属叶子片，清洗并切成几毫米的小片，以提供200至1500个外植体。在经过一系列去污染处理和灭菌处理后，将这些碎片放在琼脂培养基上，其中存在含有植物生长激素的营养培养基，以诱导愈伤组织的发生(愈伤组织的形成)。
[0109]
经过适当的时间后，大量去分化的细胞或愈伤组织形成，然后转移到更大的区域和新鲜的培养基中，使其能够扩增。进行多次继代培养(转移到新鲜培养基)以稳定细胞系，也就是说，直到后者具有高速且恒定的增殖速度、保持表型、恒定含量的目标生物活性化合物(初级要和次级代谢物)。
[0110]
然后对细胞系进行选择步骤，该步骤包括将细胞培养合适的时间、收集形成的细胞聚集体并将它们接种在液体培养基中一段时间以获得细胞聚集体的增殖。最好的细胞系将是尽可能快且可重复地获得具有选定代谢物的最优含量、最佳的生物活性和均一表型的重要生物质的细胞系。
[0111]
还针对相对于通过hplc测量的细胞干重而言以约5重量％产生绒花酸a和b的能力对所述细胞系进行挑选。
[0112]
制备高山火绒草的未分化或去分化细胞生物质的工业方法和该生物质的处理
[0113]
使用如上所述制备的细胞系或现有细胞系开始。
[0114]
高山火绒草系首先增殖以获得足够量的去分化细胞生物量，以进行大规模生产步骤。
[0115]
实施以下步骤：
[0116]
a)在液体培养基中接种所选品系并培养足够长的时间以使生物量增加至少300％；
[0117]
b)任选地，将a)中获得的悬浮液转移到新鲜液体培养基中，并在足够长的时间内再次培养以获得300％的生物量增加；
[0118]
c)可选地重复步骤b)；
[0119]
d)将在步骤a)至c)中获得的细胞悬浮液转移到具有新鲜液体培养基的生物反应器中，并在这样的条件下进行培养足够长的时间以获得含有目标代谢物的细胞生物质，也就是说足够量的苯丙素苷类化合物(phenylpropanoid glycosides)和绒花酸，生物反应器中的该生产步骤包括通过改变培养基营养物的速率实现的激发阶段。
[0120]
生物反应器：
[0121]
体积：比用作接种物的生物质体积大5到50倍；生物反应器内表面光滑均匀(没有可能导致细胞壁破裂的棱角)。
[0122]
生长条件：
[0123]
培养基：含矿物盐(常量元素和微量元素溶液)、维生素、植物激素以及蔗糖的培养基。在固体培养基中加入植物琼脂。
[0124]
温度：15℃至35℃，优选20℃至30℃，更优选25℃。
[0125]
持续时间：7至21天，优选10至14天。
[0126]
生物质的搅拌：重要的是对生物质进行最佳充气，同时通过内部方式或外部方式保持搅拌。搅拌虽然很小，但必须有效，特别是在生物质达到大量的最后阶段。为了本发明的目的，内部合适的装置是在20和120rpm之间，优选以60rpm旋转的搅拌螺旋装置，或优选在40和200rpm之间并且优选以约120rpm旋转的外部轨道旋转装置。
[0127]
充氧：对于10升体积的生物质，通常使用无菌空气以每分钟0.5至4升，优选每分钟2至2.5升的速率进行。或者，可以使用含有10％至100％v/v氧气的气体混合物。优选地使用用于扩散空气或氧气的装置，其具有流速在10ml/min和600ml/min之间、优选在50ml/min和350ml/min之间的喷嘴。
[0128]
获得的生物质的处理
[0129]
过滤以消除培养基并回收细胞生物质。该生物质的特征在于其冻干细胞的等效含量。
[0130]
细胞生物质的高压均质化：允许减少细胞聚集体的尺寸；一些细胞可能会破碎，然后可以获得全细胞和破碎细胞的混合物，优选保留10％的全细胞。
[0131]
通过分析测定由培养物产生的初级和次级代谢物，包括蛋白质、苯丙素苷类化合物(包括绒花酸a和b)来表征细胞中所含的活性化合物。
[0132]
可选地：
[0133]
1)干燥细胞，包括通过冻干或雾化，以提高目标化合物的稳定性，改善长期储存，无需添加防腐剂。
[0134]
2)通过细胞的研磨/裂解/破碎以及液相和固相的分离(通过离心或过滤或其他方式)提取细胞内容物，以获得特定的细胞提取物。
[0135]
3)纯化细胞提取物以增加绒花酸的含量。
[0136]
b)制备用于根据本发明的用途的活性成分
[0137]
如上过滤后获得的细胞生物质，或以干燥形式或是所得提取物的细胞生物质，可以与形成赋形剂的生理学上可接受的介质混合。
[0138]
作为一个优选的例子，这种生理学上可接受的介质是其中悬浮细胞的亲水性基质，例如在化妆品组合物的情况下是甘油和/或丁二醇。如果需要，还可以添加添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、稳定剂、作用于ph的试剂、乳化剂或增稠剂，包括增稠剂例如黄原胶，其将促进细胞保持在悬浮状态。
[0139]
因此可以形成用于化妆品用途的活性成分以用于实施本发明，其在生理学上可接受的赋形剂混合物中包含例如按重量计20％的完整去分化细胞的新鲜生物质(对应于约1％的干细胞)，其中所述生理学上可接受的赋形剂混合物由甘油(约80％)和黄原胶(0.3％
重量)组成，所述成分具有最终含量为约0.05％的绒花酸a和b(约15％酸a和85％酸b)。
[0140]
根据本发明，包含不同含量的绒花酸的植物细胞当然可以使用，尤其是更高的含量，其或者通过体外方法直接获得(例如使用适当的诱导来增加含量)，或者通过纯化/浓缩的步骤从所得细胞获得(例如通过提取细胞内容物后的浓缩步骤)。
[0141]
例如，可以生产纯化提取物形式的植物细胞，该提取物包含高含量的绒花酸，例如相对于干物质而言含量为25％，所述细胞本身如上所述用于制备活性成分。
[0142]
因此，根据另一个实施例，适用于无水制剂如用于化妆护肤的紧致粉末制剂的活性成分可以由冻干细胞形成，然后研磨，例如以获得5和30μm之间的适合于此类型制剂的粒度，并且具有较高的绒花酸含量(a+b)，特别是1至15％，特别是3至8％，优选约5％(总是具有约15％酸a和85％酸b的相同比例)，以获得更明显和更直接的效果，尤其是局部化的效果。
[0143]
本发明使用这些成分用于抗糖化作用的化妆品制剂的实例在以下草药制剂点f)下呈现。
[0144]
c)体外试验结果
[0145]
体外试验使用高山火绒草细胞培养物的冻干细胞的乙醇/水提取物(70/30)(在溶剂混合物中根据上述实施例获得的冻干细胞的21％)进行。该溶液是储液，例如将0.1％的该溶液加入到测试培养基中相当于210ppm细胞相当物的溶液。
[0146]
原则
[0147]
该测试使用模型蛋白即血清白蛋白(其充当靶标)以及来自水果的可食用还原糖。所述蛋白质以不可逆的方式逐渐糖化(与糖结合)，在加热孵育步骤期间，这种变化之后是荧光。在此阶段将提取物与蛋白质接触并监测糖化变化。
[0148]
结果
[0149]
[表1]
[0150][0151]
*fu:荧光单位
[0152]
这些结果表明本发明的活性剂具有很强的抗糖化潜力，可以减少ages的形成，并可能控制它们对暗沉皮肤和蛋白质变性的影响。
[0153]
d)草药制剂
[0154]
下面描述了各种化妆品配方。可以根据其疏水或亲水性质，在适当时为支持和/或在本发明的含有高山火绒草未分化细胞或去分化细胞的活性成分的活性之余，在正确的配制阶段中添加其他活性成分。这些成分可以根据其功能、应用部位(身体、面部、颈部、胸部、
手等)、期望的目的和目标消费者而属于任何类别，例如特定的抗皱、保湿、去黑眼圈、紧致、抗糖化、丰盈、舒缓、肌肉松弛、抗红肿、排毒等。
[0155]
下面给出的草药制剂中使用的活性成分n
°
1。
[0156]
基于成分组合物的总重量，20重量％的本发明的新鲜未分化或去分化细胞(生物质)(对应于约1％的干细胞)，该成分具有最终含量为约0.05％的绒花酸a和b，在由甘油、黄原胶增稠剂和柠檬酸组成的生理上可接受的赋形剂混合物中，以在适当时调节ph。该成分预浓缩为0.1-10％，优选1-5％，更优选2-3％，通常为2％。
[0157]
下面给出草药制剂中使用的活性成分n
°
2。
[0158]
冻干然后磨碎的细胞，其粒径约为15μm(
±
10μm)，并且具有至少3.5％、优选约6％的绒花酸含量(a+b)。
[0159]
推荐该成分在0.025和2％之间，优选在0.005和0.1％之间，更优选在0.01和0.05％之间，通常为0.03％。
[0160]
1)霜形式
[0161]
[表2]
[0162][0163][0164]
方案：称量a部分并在不搅拌的情况下使其膨胀30分钟。在水浴中在75℃将a部分
加热。称量b部分并在水浴中加热至75℃。搅拌均匀。称重并在45℃下熔化c部分。将d部分添加到c部分中，预先冷却。在staro搅拌v＝500rpm下，将c+d部分倒入a部分中。搅拌均匀。在staro搅拌v＝1000rpm下将b部分倒入前述部分中。搅拌均匀。临时加入e部分，均质化。加入f部分，均质化。在45℃以下加入g部分，均质化1小时。
[0165]
可添加到该配方中的成分示例：
[0166]
·
aqualance
tm
：由sederma(wo2009/104118)销售的渗透保护活性保湿成分，其由人参和赤藓糖醇组成。
[0167]
·
citystem
tm
：基于从marrubium vulgare体外获得的活性成分，具有高浓度连翘苷b的植物细胞；用于对抗污染攻击：使皮肤柔软光滑，改善皮肤纹理，减少粉刺的可见度，使皮肤容光焕发，净化。
[0168]
·
eyelis
tm
：是sederma(wo2003/068141)销售的活性成分，有助于预防和对抗眼袋的出现。例如，可以将3％的这种成分添加到配方的e部分中。
[0169]
2)精华液、防晒粉底
[0170]
[表3]
[0171]
[0172][0173]
方案：将a部分置于螺旋桨搅拌下，v＝500rpm。将b部分加入a部分，螺旋桨搅拌v＝800rpm；充分均质化。在水浴中将a+b部分加热至75℃。在75℃的水浴中加热c部分，在搅拌(starov＝1000rpm)下将其添加到a+b部分中。均质化。在35℃以下用d部分将ph值调节至5.80
±
0.1。加入e部分并充分混合。
[0174]
eusolex 4360
tm
是一种uva过滤剂，eusolex 2292
tm
是一种uvb过滤剂。
[0175]
可添加到该配方中的成分示例：
[0176]
·
venuceane
tm
：sederma(wo2002/066668)销售的活性成分，其防止可见的光老化迹象(斑点、皱纹、干燥等)，保护细胞结构免受紫外线伤害并增强皮肤完整性。
[0177]
·
pacifeel
tm
：由sederma销售的活性成分，包含从植物紫茉莉(mirabilis jalapa)(《belle de nuit》)中提取的天然来源提取物，可缓解不适感(瘙痒、刺痛)，减少敏感和反应性皮肤的发红。
[0178]
·
prodizia
tm
：由sederma(wo2013/046137)销售的活性成分，包含合欢(albizia julibrissin)提取物，通过修复和保护皮肤免受由糖化和糖氧化(glycoxydation)的损害。
[0179]
3)化妆用粉状
[0180]
[表4]
[0181][0182]
可添加到该配方中的成分示例：
[0183]
·
vegesome moist24
tm
：由sederma销售的活性成分，专为保湿化妆粉配方而设计；它是一种由25μm中空颗粒(东北石松(lycopodium clavatum)外膜)组成的粉末，负载有具有保湿特性的白茅(imperata cylindrica)提取物。