1.本发明总体上涉及蛋白酶反应性药物递送水凝胶、其用途及其相关生产方法的领域。更特别地，本发明涉及在与炎症相关蛋白酶反应时释放抗炎剂的水凝胶。
背景技术：
：：2.炎症是由宿主免疫系统发动的一系列生物反应，以去除有害刺激并将受损组织恢复到其损伤前的状态[serhan,c.n.等人fundamentalsofinflammation,cambridgeuniversitypress,cambridge,(2010)]。急性炎症反应是在组织损伤后消除有害刺激和恢复细胞稳态所必需的[serhan,c.n.等人fundamentalsofinflammation,cambridgeuniversitypress,cambridge,(2010)]。相比之下，白细胞活性的不期望的持续导致与慢性组织损伤相关的过度炎症[serhan,c.n.等人fundamentalsofinflammation,cambridgeuniversitypress,cambridge,(2010)]。这种慢性病症通常在许多病理状态如类风湿性关节炎、慢性糖尿病性溃疡、炎性肠病(ibd)和慢性阻塞性肺病中遇到[serhan,c.n.等人fundamentalsofinflammation,cambridgeuniversitypress,cambridge,(2010)]。[0003]全身施用抗炎治疗剂是临床接受的减轻慢性疾病中的过度炎症的治疗范例。基于患有类风湿性关节炎和ibd的患者的临床症状凭经验为所述患者开具小分子药物，如非类固醇抗炎药(nsaid)和类固醇免疫抑制剂。然而，这些药物的全身施用也参与熟知副作用的发生，这些副作用与由于缺乏受控药物释放而导致的过量剂量相关。例如，全身施用的nsaid增加心肌梗塞、脑血管意外和胃溃疡的风险。此外，当在延长的持续时间段内开处方时，皮质类固醇导致严重的药物诱导的并发症，如骨坏死、青光眼和机会性感染。[0004]为了改善药物释放动力学的时空控制并使全身毒性最小化，已经设计了几种药物递送平台用于施用抗炎治疗剂[m.等人basic&clinicalpharmacology&toxicology112(5)296-301(2013)]。例如，在囊泡系统中包封糖皮质激素延长了药物半衰期，并实现了治疗药物的缓慢释放[maestrelli,f.等人journalofdrugdeliveryscienceandtechnology32192-205(2016)]。可替代地，已经将小分子nsaid与纳米级聚合物膜的共价缀合报道为通过药物-聚合物酯连接的水解显著增加治疗有效载荷并实现逐渐长期释放的替代方法[hsu,b.b.proceedingsofthenationalacademyofsciences111(33)12175(2014)]。然而，这些系统没有考虑其炎性特征需要施用抗炎治疗剂的患病组织的特殊病理状态。因此，它们的药物释放曲线与生物学要求不匹配，因为释放主要由递送平台的物理化学特征如聚合物组成和载药能力决定。[0005]可以利用患病组织处的生物微环境的炎性特征来设计可以由免疫信号触发的智能药物递送系统。特别地，已公开的研究已经确定了蛋白酶，尤其是丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶(mmp)在慢性炎症中的上调，提示它们作为治疗性施用调节炎症级联的生化信号的潜力[pham,c.t.n.theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology40(6)1317-1333(2008)]。与其他刺激如ph、温度或氧化还原作用相比，蛋白酶仍然是如与其他刺激相比更具特异性的生物信号，主要是由于蛋白酶的失调与病理状态之间的密切关系所致。此外，其他刺激可能由于环境状况而受到影响。例如，体温可能由于潮湿天气状况而不是由于疾病状态而出现急升。尽管蛋白酶是较好的生物信号，但蛋白酶作为生物触发的药物递送系统调节炎症的免疫信号的潜力仍在很大程度上未被探索。最近，joshi等人利用小分子两亲体三甘油单硬脂酸酯(tg-18)的自组装将皮质类固醇物理截留在水凝胶平台中，所述水凝胶平台可以在暴露于增加的关节炎爆发活动时被触发以释放这种药物[joshi,n.等人naturecommunications9(1)1275(2018)]。然而，这种报道的载药水凝胶平台缺乏可一般化的设计框架，因此限制了替代其组分以开发替代性生物触发物的可能性。具体地，药物从这种平台的释放依赖于主要通过酯酶切割tg-18主链上的酯键，所述酯酶在炎性关节炎中上调[ravaud,p.等人rheumatology41(7)815-818(2002)]，但可能在其他炎性疾病中不是关键的生物信号。这些酯键在与炎性病症相关的低ph环境中的非酶水解[bellocq,a.等人journalofbiologicalchemistry273(9)5086-5092(1998)；riemann,a.等人molecularbasisofdisease1862(1)72-81(2016)]也可能导致不期望的非特异性药物释放。[0006]因此，如下蛋白酶触发的药物递送平台仍然代表着解决现有递送系统的限制的未满足的需求：(1)模块化设计，(2)免疫相容的，并且(3)对于在室温下注射施用和局部施用两者是通用的。首先，药物在包埋在蛋白酶触发的递送系统中的颗粒域如脂质体或聚合物微粒中的物理截留可能与扩散驱动的基础药物释放相关。这种基础释放可能是管理慢性炎性病症所期望的，当所述病症由于感染发作或关节炎爆发而突然恶化时，所述管理需要蛋白酶触发的增加的剂量。然而，这种基础释放并非在所有炎症相关的病症中总是期望的，特别是在服用免疫抑制药物或用于急性损伤管理(其中正常愈合需要一定程度的炎症)的一名或多名免疫受损患者中。消除或最小化这种基础药物释放的蛋白酶触发的递送系统的替代设计对于如下病症也是期望的：其中药物施用部位经历从不需要药物的生理状态到高度炎性病理状态(如急性伤口上细菌感染的突然发作或脂溢性皮炎爆发)的转变。[0007]其次，在炎症相关病理的管理中利用单一蛋白酶作为触发药物释放的生物化学刺激可以部分地帮助针对疾病的炎性病症调整剂量。然而，在病理性炎性病症中，多种蛋白酶可能被上调。因此，利用蛋白酶的子集代替单一蛋白酶可以增加蛋白酶活性与疾病特异性病症的特异性关联，以实现针对目的炎症相关疾病特异性调整的药物释放动力学。因此，还存在对于开发如下药物递送系统的实质性需要，所述药物递送系统的药物释放由两种或更多种蛋白酶刺激触发(或多重蛋白酶反应性)以实现增强的特异性。技术实现要素：[0008]本发明提供一种炎症反应性药物递送平台，其包含(1)具有调整的基础药物释放曲线的载药域(包封抗炎药物或缀合的抗炎药物的颗粒)和/或(2)蛋白酶可切割的水凝胶域。本发明提供了一种药物递送平台，其可以定制为通过改变其载药域的构型和/或调节其蛋白酶触发的域的多重敏感性以调整其对目的疾病的反应性和特异性来应对炎性疾病。[0009]根据本发明的第一方面，提供了一种载药的蛋白酶反应性水凝胶，其包含；[0010]a)包封在颗粒中的药物；[0011]b)聚合物构建单元，其包含具有官能部分的多臂聚乙二醇(peg)；以及[0012]c)双官能蛋白酶敏感性交联剂，其包含侧接两个含有官能部分的间隔子序列的蛋白酶可切割的底物；[0013]其中b)的所述聚合物构建单元在存在c)的蛋白酶可切割的交联剂的情况下形成凝胶以截留a)的颗粒。[0014]在一些实施方案中，所述载药的蛋白酶反应性水凝胶进一步包含：[0015]a)至少第二双官能蛋白酶敏感性交联剂，其包含侧接含有官能部分的间隔子序列的蛋白酶可切割的底物，所述底物对与c)的所述交联剂的蛋白酶不同的蛋白酶敏感；和/或[0016]b)至少一种另外的双官能蛋白酶抗性交联剂，其包含蛋白酶抗性底物。[0017]所述颗粒可以由任何合适的材料构成，所述材料可以携带和释放药物(如小分子、治疗性肽、蛋白质、mrna等)并且被由聚合物构建单元和交联剂形成的凝胶所截留。例如，所述颗粒可以是二氧化硅、脂质体、sirna复合物或聚合物材料。颗粒可以使用熟知的现有技术方法如乳化、电喷雾、静电络合、流动聚焦法等制得[abdelaziza,hadeerm.等人,journalofcontrolledrelease269374–392(2018)]。[0018]在一些实施方案中，所述药物被包封在颗粒中，所述颗粒包含选自聚己内酯、聚(甲基丙烯酸)、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和明胶的聚合物材料。优选地，所述颗粒是微粒和/或纳米颗粒，优选地具有在约10nm至约100μm范围内的直径。[0019]在一些实施方案中，所述聚合物构建单元包含多臂peg-乙烯砜或多臂peg-马来酰亚胺或多臂peg-叠氮化物或多臂peg-炔。有利地，所述砜部分与交联剂臂上的半胱氨酸部分相互作用。[0020]本发明还包括一种载药的蛋白酶反应性水凝胶，其不需要将药物包封在颗粒中以供限制直到被所述蛋白酶释放。[0021]根据本发明的第二方面，提供了一种载药的蛋白酶反应性水凝胶，其包含；[0022]a)与具有官能部分的蛋白酶可切割的肽锚共价缀合的药物；[0023]b)聚合物构建单元，其包含具有至少一个官能部分的多臂peg聚合物；以及[0024]c)双官能交联剂，其包含侧接含有官能部分的间隔子序列的肽底物；[0025]其中所述肽锚的官能部分将所述药物共价连接至所述多臂peg聚合物的臂，并且其中所述聚合物构建单元的官能部分共价连接至所述双官能交联剂的所述部分以形成凝胶。[0026]肽锚和交联剂的排列提供了灵活性和对载药水凝胶的释放曲线的调节，由此所述药物的释放可能对一种或多种不同的蛋白酶敏感。[0027]有利地，药物缀合的域使所述药物的基础释放最小化。[0028]在一些实施方案中：[0029]a)所述交联剂不可被蛋白酶切割；或[0030]b)所述肽锚可被蛋白酶切割，并且所述交联剂可被相同或不同的蛋白酶切割；和/或[0031]c)所述载药水凝胶包含多种交联剂，其中的一种或多种可被不同的蛋白酶切割。[0032]有利地，所期望的肽锚由含有官能部分的蛋白酶可切割的间隔子序列组成，所述间隔子序列包含至少4个氨基酸。[0033]有利地，交联剂由蛋白酶可切割的底物序列组成，所述底物序列侧接含有官能部分的间隔子序列，所述间隔子序列各自包含至少4个氨基酸。[0034]不可切割的交联剂用于控制酶向凝胶网络中的扩散，并因此有助于调节释放曲线。[0035]在一些实施方案中，所述药物可以是小分子、sirna、适配体或者治疗性肽或蛋白质。[0036]有利地，作为蛋白酶触发的域的关键组分的肽序列的组合提供快速的水基凝胶化和在暴露于多于一种疾病特异性蛋白酶时更好的特异性触发的释放。[0037]在一些实施方案中，所述聚合物构建单元包含多臂peg-乙烯基马来酰亚胺。装载到蛋白酶反应性水凝胶上的药物的量可以由所用的多臂peg聚合物的量或浓度来控制。[0038]在一些实施方案中，所述载药的蛋白酶反应性水凝胶的重量比为约2w/v％至约12w/v％，优选约3w/v％至约10w/v％。优选地，所述水凝胶是多臂peg-乙烯砜或多臂peg-乙烯基马来酰亚胺或多臂peg-炔或多臂peg-叠氮化物。[0039]应当理解，多臂peg聚合物上的臂的数量将影响可以缀合的药物的量以及交联和凝胶形成的程度。[0040]在本发明的任一方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶的一些实施方案中，所述多臂peg聚合物具有3至8个臂。[0041]在本发明的任何方面的载药的蛋白酶响应性水凝胶的一些实施方案中，所述药物是抗炎的。[0042]在本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶的一些实施方案中，所述蛋白酶在炎症期间被上调，并且选自基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。[0043]在本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶的一些实施方案中，所述药物是类固醇抗炎药或非类固醇抗炎药(nsaid)或其衍生物。所述药物可以是类固醇抗炎药，如地塞米松、氟氢可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松或氢化可的松或其衍生物。糖皮质激素可以被氧化以添加羧基官能团，所述羧基官能团允许这些药物与本发明的肽锚缀合。优选地，所述药物是nsaid，如布洛芬、酮洛芬、双氯芬酸、苏林酸、吡罗昔康或塞来昔布或其衍生物。[0044]在本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶的一些实施方案中，所述侧接间隔子序列包含至少一个半胱氨酸和/或赖氨酸残基和/或含叠氮化物或炔烃的非天然氨基酸，它们是与多臂peg的官能部分反应以诱导凝胶化所需的。所述间隔子可以具有1-6个氨基酸。其余残基可以是任何氨基酸，优选具有带电荷的侧基的氨基酸。具体地，在半胱氨酸的硫醇部分附近的正电荷氨基酸(例如，精氨酸，r)增加了交联速率，而负电荷(例如，天冬氨酸，d)减慢了这个反应。所述间隔子可以具有1-6个氨基酸。在一些实施方案中，所述侧接间隔子序列(“间隔子(spacer)”)可以具有式gx1x2x3(seqidno:33)，其中x1、x2和x3各自独立地是甘氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或精氨酸和/或其反向序列。在一些实施方案中，所述侧接间隔子序列选自grcr(seqidno:1)、gcrg(seqidno:2)、grcd(seqidno:3)、gcdr(seqidno:4)、gcdg(seqidno:5)、gdcd(seqidno:6)、gcdd(seqidno:7)、gcrd(seqidno:8)和gcrr(seqidno:9)。[0045]当使用第一间隔子和第二间隔子时，在肽底物的每一端各有一个间隔子，第二间隔子序列可以是第一间隔子序列的反向序列，并且可以具有式x3x2x1g(seqidno:34)。这种反向间隔子序列可以被称为“recaps”，并且例如，可以是选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8和seqidno:9的间隔子的反向序列。[0046]在本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶的一些实施方案中，所述蛋白酶可切割的底物对选自以下的蛋白酶敏感：基质金属蛋白酶，如金属蛋白酶-9(mmp-9)、mmp-2、mmp-7、mmp-12等；组织蛋白酶，如组织蛋白酶k、组织蛋白酶b、组织蛋白酶s等；人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(hne)、胱天蛋白酶和尿激酶。[0047]在一些实施方案中，所述蛋白酶可切割的底物选自包含kgprslsgk(seqidno:30)、gprslsg(seqidno:10)、lgrmglpgk(seqidno:11)、avrwllta(seqidno:12)或gpqgiwgq(seqidno:13)中所示的氨基酸序列的mmp-9底物；包含apeeimdrq(seqidno:14)或pmavvqsvp(seqidno:15)的hne底物；包含grrglg(seqidno:16)或dgflgdd(seqidno:17)的组织蛋白酶b底物；或其组合。[0048]根据本发明的第三方面，提供了一种配制用于注射或局部施用的组合物，其包含本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶。[0049]可以将所述载药的炎症反应性水凝胶结合到聚合物敷料上以形成用于伤口管理的复合敷料。[0050]根据本发明的第四方面，提供了一种敷料，其包含本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶。[0051]根据本发明的第五方面，提供了本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶或本发明的组合物，其作为可注射或局部敷料用于治疗有需要的受试者。[0052]根据本发明的第六方面，提供了一种治疗方法，其包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶或本发明的组合物。在一些实施方案中，所述施用通过注射或局部施用对所述受试者进行。在一些实施方案中，所述治疗针对炎症相关疾病，如慢性伤口、炎性肠病、关节炎和需要炎症管理的潜在感染相关病症。[0053]根据本发明的第七方面，提供了一种试剂盒，其包含：[0054]a)包封在颗粒中的药物；[0055]b)聚合物构建单元，其包含具有官能部分的多臂聚乙二醇(peg)；以及[0056]c)双官能蛋白酶敏感性交联剂，其包含侧接两个含有官能部分的间隔子序列的蛋白酶可切割的底物，[0057]其中a)-c)如前述方面的任一方面中所定义；或[0058]a)与具有官能部分的蛋白酶可切割的肽锚共价缀合的药物；[0059]b)聚合物构建单元，其包含具有至少一个官能部分的多臂peg聚合物；以及[0060]c)双官能交联剂，其包含侧接含有官能部分的间隔子序列的肽底物，[0061]其中a)-c)如前述方面的任一方面中所定义。[0062]在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶或本发明的任何方面的组合物。[0063]根据本发明的第八方面，提供了一种制造载药的蛋白酶反应性水凝胶的方法，其包括以下步骤：[0064]a)将包含具有官能部分的多臂聚乙二醇(peg)的聚合物构建单元与载药的颗粒混合；[0065]b)将双官能蛋白酶敏感性交联剂与载药的聚合物颗粒混合，所述双官能蛋白酶敏感性交联剂包含侧接含有官能部分的间隔子序列的蛋白酶可切割的底物；[0066]c)将a)和b)的混合物混合在一起；[0067]其中a)的所述聚合物构建单元在存在b)的蛋白酶可切割的交联剂的情况下形成凝胶以截留所述载药颗粒。[0068]所述颗粒可以由任何合适的材料构成，所述材料可以携带和释放药物(如小分子、治疗性肽、蛋白质、mrna等)并且被由聚合物构建单元和交联剂形成的凝胶所截留。例如，所述颗粒可以是二氧化硅、脂质体、sirna复合物或聚合物材料。颗粒可以使用熟知的现有技术方法如乳化、电喷雾、静电络合、流动聚焦法等制得[abdelaziza,hadeerm.等人,journalofcontrolledrelease269374–392(2018)]。[0069]在一些实施方案中，所述药物被包封在颗粒中，所述颗粒包含选自聚己内酯、聚(甲基丙烯酸)、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和明胶的聚合物材料。优选地，所述颗粒是微粒和/或纳米颗粒，优选地具有在约10nm至约100μm范围内的直径。[0070]根据本发明的第九方面，提供了一种制造载药的蛋白酶反应性水凝胶的方法，其包括以下步骤：[0071]a)将与具有官能部分的肽锚共价缀合的药物与包含具有至少一个官能部分的多臂peg聚合物的聚合物构建单元混合，其中所述肽锚和多臂peg聚合物的相应官能部分共价键合以将所述药物缀合至所述多臂peg聚合物的臂；[0072]b)将a)的药物-聚合物缀合物与包含侧接含有官能部分的间隔子序列的肽底物的双官能交联剂混合；[0073]其中所述聚合物构建单元的官能部分共价连接至所述双官能交联剂的所述部分以形成凝胶。[0074]在第九方面的一些实施方案中：[0075]a)所述肽锚可被蛋白酶切割，并且所述交联剂不可被蛋白酶切割；或[0076]b)所述肽锚可被蛋白酶切割，并且所述交联剂可被相同或不同的蛋白酶切割；和/或[0077]c)所述载药水凝胶包含多种交联剂，其中的一种或多种可被不同的蛋白酶切割。[0078]在一些实施方案中，所述药物、所述颗粒、所述交联剂、所述可切割的锚和/或所述聚合物构建单元如本发明的任何方面中所定义。[0079]根据本发明的第十方面，提供了一种制造包含本发明的任何方面的载药的蛋白酶反应性水凝胶的复合敷料的方法，其包括以下步骤；[0080]a)制备包封在颗粒中的药物和双官能蛋白酶敏感性交联剂的混合物，所述双官能蛋白酶敏感性交联剂包含侧接两个含有官能部分的间隔子序列的蛋白酶可切割的底物；[0081]b)制备包封在颗粒中的药物和包含具有官能部分的多臂聚乙二醇(peg)的聚合物构建单元的混合物；[0082]c)将a)和b)混合在一起，将所述混合物沉积到敷料上并使其凝胶化。[0083]在一些实施方案中，所述敷料是藻酸盐伤口敷料。[0084]在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤d)，其中将复合敷料在液氮中快速冷冻并冻干至干燥。[0085]在所述制造方法的一些实施方案中，所述药物是nsaid；所述颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)；所述交联剂和/或锚可被选自基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶或其组合的蛋白酶切割；并且所述聚合物构建单元包含4臂或8臂peg-乙烯砜或者4臂或8臂peg-乙烯基马来酰亚胺或者4臂或8臂peg-叠氮化物或者4臂或8臂peg-炔。[0086]有利地，可一般化的设计框架使得能够改变药物的选择和装载能力，同时维持其结构和功能完整性。[0087]有利地，在设计这种递送平台时使用免疫相容材料，以潜在地使在其体内施用时的不利宿主反应最小化。[0088]有利地，这种平台在室温下对于可注射施用和局部施用两者是通用的。附图说明[0089]图1示出了模块化的基于微粒的水凝胶gel-ip的形成和载药颗粒响应于单一蛋白酶活性触发的释放。[0090]图2示出了杂合的基于微粒的水凝胶的例子，其说明了载布洛芬的颗粒(ibu-plga颗粒)的成功的凝胶化和mmp-9触发的释放。添加双半胱氨酸肽作为肽交联剂诱导了凝胶化(小瓶a1)。在不存在这种交联剂的情况下，没有发生凝胶化(小瓶a2)。如在其光学显微镜图像(c1)中观察到的，由于mmp-9活性所致的凝胶溶解(小瓶b1)引起载药颗粒释放到周围介质中。5天后实现了200μl杂合水凝胶的完全消化。在没有mmp-9活性的情况下，凝胶保持完整(小瓶b2)并且在周围介质中没有观察到载药颗粒(c2)。(比例尺：50μm)。[0091]图3示出了mmp-9触发布洛芬从杂合水凝胶gel-ip的体外释放。与对照(‑■‑)相比，将gel-ip暴露于mmp-9(‑●‑)显著地增加了累积药物释放。mmp-9抑制剂的添加抑制了布洛芬的释放(‑▲‑)。从不可切割的杂合水凝胶(scrgel-ip，‑◆‑)观察到较慢的释放动力学。误差棒表示n＝4次重复的s.e.m。[0092]图4a-图4b示出了mmp-9触发的来自杂合水凝胶gel-ip的药物释放对巨噬细胞增殖的影响。a)释放物产生、收集和接种细胞的处理的示意图。b)在存在或不存在mmp-9及其抑制剂的情况下，暴露于从仅培养基、自由溶解的药物、不含布洛芬的杂合水凝胶gel-p、gel-ip或scrgel-ip产生的释放物72小时后，巨噬细胞的相对代谢活性。误差棒表示n＝4次重复的s.e.m。p值通过单因素anova与fisherlsd事后分析确定。(***)、(****)和(ns)分别表示p《0.001、p《0.0001和p≥0.05(不显著)。ibu：布洛芬；空白plga颗粒：不含布洛芬的plga颗粒；ibu-plga颗粒：载布洛芬的plga颗粒；gel-p：通过可切割的肽(1)(图14；gcrr-kgprslsgk-rrcg；seqidno:18)交联并且包埋有空白plga颗粒的peg水凝胶；gel-ip：通过可切割的肽(1)(图14；gcrr-kgprslsgk-rrcg；seqidno:18)交联并且包埋有ibu-plga颗粒的peg水凝胶；scrgel-ip：通过乱序肽(gcrr-kssrggplk-rrcg；seqidno:29)交联并且包埋有ibu-plga颗粒的peg水凝胶。[0093]图5a-图5c示出了在免疫活性skh-1e小鼠中由杂合水凝胶gel-ip及其组成材料诱导的活性氧(ros)活性的体内评价。a)实验设计，其说明在小鼠背侧皮下注射6种材料配制品，随后经由生物发光成像定量ros活性。b)代表性小鼠在第3天的生物发光图像。c)ros活性的定量，表明其在5天后降低至背景水平。误差棒表示n＝6次注射的s.e.m。p值通过单因素anova与fisherlsd事后分析确定。(*)和(ns)分别表示p《0.05和p≥0.05(不显著)。藻酸盐凝胶：通过氯化钙交联的藻酸盐水凝胶；peg凝胶：通过可切割肽交联的peg水凝胶；gel-p：通过可切割肽交联并且包埋有plga颗粒的peg水凝胶；gel-ip：通过可切割肽交联并且包埋有ibu-plga颗粒的peg水凝胶。[0094]图6a-图6c示出了双重蛋白酶触发plga颗粒从多重蛋白酶可切割的水凝胶中释放。a)双重蛋白酶反应性组合水凝胶系统的机制的示意图。b)照片示出h2-m2组合水凝胶在24小时内的可切割性(n＝3)。(i)对照，(ii)用hne蛋白酶；(iii)用mmp-9蛋白酶；以及(iv)用hne蛋白酶和mmp-9蛋白酶两者。c)在存在零种蛋白酶、单一蛋白酶或双重蛋白酶的情况下在24小时内从组合水凝胶中释放的plga颗粒的平均数量的定量(n＝3)。误差棒表示n＝3次重复的s.e.m。p值通过单因素anova与tukey事后分析确定。(***)和(ns)分别表示p≤0.001和p≥0.05(不显著)。[0095]图7a-图7c示出了结合了gel-ip的复合敷料的制造和蛋白酶触发的来自所述复合敷料的布洛芬的体外释放。a)由gel-ip和敷料制造复合敷料的示意图。b)mmp-9触发的从复合敷料中释放布洛芬的示意图。c)响应于mmp-9从复合敷料释放的布洛芬的定量。误差棒表示n＝4次重复的s.e.m。p值通过student'st-检验与welch校正确定。(**)表示p《0.01。[0096]图8a-图8c示出了布洛芬缀合的mmp-9可切割水凝胶的设计。a)通过绘制的ibu-肽缀合的缀合和化学结构的示意图。b)ibu-gpqgiwgq-drcg(seqidno:19)的ms谱。c)布洛芬缀合的mmp-9可切割水凝胶的凝胶化的示意图和典型例子。[0097]图9a-图9b示出了布洛芬缀合的mmp-9触发的peg水凝胶的可切割性。a)mmp-9诱导的水凝胶系统的消化。b)mmp-9引起的释放的布洛芬的示意图和ms谱。[0098]图10a-图10b示出了针对炎性蛋白酶刺激的反应性释放。a)布洛芬的累积释放(libu)对应于mmp-9浓度的增加而增加。在不存在mmp9蛋白酶的情况下不存在扩散驱动的基础释放(底线)。b)与针对组织蛋白酶b和hne相比，gprslsgrrcg(seqidno:20)针对mmp-9的敏感性的特异性。误差棒表示n＝4次重复的平均值的标准误差。[0099]图11a-图11c示出了可调的药物载量和释放速率。释放速率可以通过改变以下来调节：(a)交联剂(即，使用相同的锚h，同时将交联剂从xh变为xm和对照乱序xm(即，xm(scr)：gcrr-ssrggpl-rrcg，seqidno:39)或(b)锚(即，使用相同的交联剂xh，同时将锚从h变为m和对照乱序m(m(scr)：ssrggpl-rrcg，seqidno:40)。c)通过改变peg臂的数量或pegwt％，可以改善药物载量。箭头指示mmp-9急升，模拟突然的爆发。误差棒表示n＝4次重复的平均值的标准误差。图例标记遵循ibu-锚_交联剂的格式，即ibu-h_xh表示具有锚h和交联剂xh的布洛芬缀合的水凝胶。[0100]图12a-图12b示出了在皮下空间具有不同炎症严重程度的小鼠模型。a)时间线的示意图。照片b)和荧光图像c)示出了一组代表性的具有3个严重程度等级的小鼠。d)示出了表明mmp活性上调的荧光信号的定量，而e)示出了使用elisa对mmp-9分泌的定量。[0101]图13a-图13c示出了skh1-e小鼠的皮下空间中炎症触发的药物释放。a)实验设计，其说明皮下炎症的产生，随后在小鼠背侧皮下注射药物缀合的水凝胶，并且随后在水凝胶注射后12小时提取(retrieval)凝胶团。b)在第3天，具有对应于3个严重程度等级的凝胶团的三个代表性小鼠皮肤组织的照片。c)药物释放百分比的评价。误差棒代表n＝8只小鼠的s.e.m。[0102]图14a-图14b示出了多种肽交联剂的定性筛选，每种肽交联剂包含底物和两个类似的间隔子，以间隔子-底物-间隔子的形式列于表3中。a)当peg-vs、肽交联剂和载布洛芬的颗粒的混合物尽管在重力作用下但停止流动而在小瓶底部形成白色杂合水凝胶时，证实了凝胶化。b)通过比较液体混合物停止流动所花费的持续时间来评价相对凝胶化速率。5分钟内的凝胶化被认为是快的，而需要超过30分钟的凝胶化被认为是慢的。c)通过在mmp-9暴露后在光学显微镜下观察释放到周围介质中的载药颗粒的量，检查每种杂合水凝胶的可切割性。(是)表明在存在mmp-9的情况下释放的颗粒数量显著更高，证实了水凝胶的可切割性，而(否)表明其他情况。(n.e)表示没有进行评价的情况。[0103]图15a-图15e示出了不同直径的载布洛芬的plga颗粒的扫描电子显微术图像。不同的均质化速度导致颗粒具有46μm(a)、14μm(b)、11μm(c)、6μm(d)和4μm(e)的近似平均直径。(所有比例尺都表示20μm)。[0104]图16示出了来自具有不同大小的载布洛芬的plga颗粒的累积药物释放。较大的粒径导致较慢的药物释放动力学。所有误差棒都表示n＝4次重复的s.e.m。[0105]图17a-图17b示出了通过mmp-9可切割的肽(1)(图14；gcrr-kgprslsgk-rrcg；seqidno:18)交联的peg凝胶的原位形成。a)具有2个由皮下注射peg凝胶的前体溶液产生的肿块的小鼠的背侧的图像。b)注射后15分钟在两个注射部位具有交联的peg凝胶的离体皮肤组织的照片，证实了peg凝胶在皮下空间中的原位形成。[0106]图18a-图18b示出了注射的材料在代表性小鼠中的注射后外观。a)就在皮下注射6种材料配制品(藻酸盐凝胶、peg凝胶、ibu-plga颗粒、plga颗粒、gel-p和gel-ip)之后小鼠的图像。b)注射后5天，含有6种材料配制品的离体皮肤的皮下侧的图像。peg凝胶的消失表明其体内可降解性。[0107]图19示出了双重反应性布洛芬缀合的peg水凝胶的蛋白水解功能性。与将凝胶暴露于mmp-9或hne所产生的累积药物释放相比，将凝胶暴露于mmp-9和hne显著地增加了累积药物释放。从浸没在不含蛋白酶的缓冲液中的凝胶观察到最慢的释放动力学。误差棒表示n＝4次重复的s.e.m。[0108]为了方便起见，在本说明书中提到的参考文献在实施例的末尾处列出。将此类参考文献的全部内容通过引用并入本文。具体实施方式[0109]定义[0110]为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。[0111]如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外规定。[0112]如本文所用，范围可以表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解所述特定值形成另一个实施方案。应当进一步理解，每个范围的端点相对于其他端点都是重要的，并且独立于其他端点。还应理解，本文中公开了多个值，并且除了所述值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则也公开“约10”。还应理解，在公开一值时，也公开“小于或等于”所述值、“大于或等于所述值”以及值之间的可能范围，如技术人员适当地理解。例如，如果公开值“10”，则也公开“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，还公开两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开3和10，则也公开4、5、6、7、8和9。[0113]如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中任一项的片段，以及天然存在的或合成的分子。在“氨基酸序列”在本文中叙述为是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列的情况下，“氨基酸序列”和类似术语并不意为将氨基酸序列限制为与所叙述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。[0114]如本文所用，术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”是指一个或多个氨基酸链，其中每个链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或肽可以包含通过肽键非共价和/或共价连接在一起的多个链(所述多个链具有天然蛋白质(即由天然存在的并且特别是非重组的细胞或者由基因工程化细胞或重组细胞产生的蛋白质)的序列)，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或者具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、增加和/或取代的分子。“多肽”、“肽”或“蛋白质”可以包含一个(称为“单体”)或多个(称为“多聚体”)氨基酸链。[0115]术语“颗粒”在本文中用于广泛地描述包封药物的材料，并且可以由任何合适的材料构成，所述材料可以携带和释放药物(如小分子、治疗性肽、蛋白质、mrna等)并且被由聚合物构建单元和交联剂形成的凝胶所截留。例如，所述颗粒可以是二氧化硅、脂质体、sirna复合物或聚合物材料。颗粒可以使用熟知的现有技术方法如乳化、电喷雾、静电络合、流动聚焦法等制得[abdelaziza,hadeerm.等人,journalofcontrolledrelease269374–392(2018)]。聚合物颗粒大体上是球形的，如图15中所示。用于本发明的优选的粒度是具有在nm和μm范围内的直径的微粒和/或纳米颗粒。优选地，颗粒具有在10nm至100μm的范围内的直径。[0116]术语“聚合物”或“生物聚合物”定义为具有重复分子单元以变成聚合的物质。聚合物可以是生物相容性聚合物，选自多糖(例如，琼脂糖、右旋糖酐)、聚磷腈、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(亚烷基氧化酶)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、其衍生物以及其共聚物和共混物。关于包封药物的聚合物颗粒，聚合物可以选自例如聚己内酯、聚(甲基丙烯酸)、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和明胶。聚合物可以是柔性聚合物，其也是机械和结构稳定的并且适合于注射、移植或植入(例如，皮下移植或植入)。聚合物可以是或可以不是可生物降解的。本发明的聚合物构建单元通常包含多个臂，所述臂具有可以与交联剂上的官能部分相互作用形成凝胶的官能部分。优选的多臂构建单元包含多臂peg-乙烯砜、多臂peg-乙烯基马来酰亚胺、多臂peg-叠氮化物以及多臂peg-炔，更特别地具有4或8个臂的那些。[0117]术语“受试者”在本文中定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究的目的，所述受试者可以特别是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。特别地，对于治疗或预防疾病、如炎性疾病，受试者可以是人。[0118]如在本发明的上下文中使用的术语“治疗”是指预防性、改善性、治疗性或治愈性治疗。[0119]如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为具体说明所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由……组成”。单词“包含(comprising)”的变型(诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)以及“包括(including)”的变型(诸如“包括(include)”和“包括(includes)”)具有相应变化的含义。[0120]虽然将结合本文提供的实施方案说明本发明的方面，但是应该理解，它们并不旨在将本发明限制于这些实施方案。相反，本发明旨在涵盖本文所述的实施方案的替代方案、修饰和等价物，其可以包括在如由权利要求限定的本发明的范围内。此外，在以下具体实施方式中，阐述了特定细节以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的普通技术人员(即技术人员)将认识到，本发明可以在没有特定细节的情况下和/或在具有由特定实施方案的方面的组合产生的多个细节的情况下实施。在许多情况下，没有详细描述已知的系统、方法、程序和组件，以免不必要地模糊本发明的实施方案的各方面。[0121]实施例[0122]本领域技术人员将理解，可以根据本文中给出的方法在不进行过度实验的情况下实施本发明。所述方法、技术和化学品正如在给出的参考文献中或在标准生物技术和分子生物学教科书中的方案中所述。本领域中已知并且未明确描述的标准分子生物学技术大体上遵循如sambrook和russel,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratory,纽约(2001)中所述。[0123]实施例1：用于制造蛋白酶反应性的基于微粒的包封药物的杂合水凝胶的材料和方法[0124]1.1plga颗粒的制造和表征[0125]经由水包油乳化方法用来自lactel(佩勒姆，阿拉巴马州)的聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)50/50(比浓对数黏度为0.95dl/g-1.20dl/g)制造含有或不含布洛芬的颗粒[dang,t.t.等人biomaterials34(23),5792-5801(2013)]。典型地，将分别以浓度40mg/ml和6mg/ml溶解在二氯甲烷中的plga和布洛芬的5ml溶液迅速添加到1％(w/v)聚乙烯醇(sigmaaldrich，美国密苏里州圣路易斯)的25ml溶液中，并且以不同的速度均质化60秒(l5m-a，silverson)。将所得悬浮液迅速倾析到75ml去离子水中，并搅拌60秒，然后旋转蒸发15分钟。通过以3000rpm离心30秒将悬浮液洗涤三次。将颗粒收集，在液氮中快速冷冻，并冻干至干燥。在扫描电子显微镜(jsm6390la，jeol)下检查粒度分布和形态。通过将2mg颗粒溶解于1ml乙腈中，并将240nm处的所得uv吸光度与在乙腈中已知浓度的布洛芬的标准曲线进行比较，确定每种微粒配制品的载布洛芬能力。通过改变ibu-plga颗粒的大小独立地研究载药子域的释放动力学(表1和图15和图16)。最终选择平均直径为14μm且实验药物载量为大约6wt％的颗粒用于制造gel-ip以减弱载药颗粒的突释。[0126]表1：具有不同大小的plga颗粒的制造和表征。平均直径从sem图像测量。通过hplc分析确定载药能力。[0127]均质化速度(rpm)平均直径(μm)装载能力(wt％)100046±30.49.0250014±5.46.9340011±3.26.450006±1.55.365004±0.56.5[0128]1.2基于微粒的包封药物的杂合水凝胶的制造[0129]我们开发了一种模块化药物递送平台，其由包埋在蛋白酶可切割的水凝胶内部的载药聚合物颗粒组成(图1)。在暴露于蛋白酶活性时，水凝胶基质可以被蛋白水解性降解以释放包埋的颗粒，并因此递送期望的治疗有效载荷。由于这种平台的模块化设计，可以独立地优化载药的子域和蛋白酶可切割的子域以实现期望的有效载荷释放。具体地，分别选择聚乙二醇(peg)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)作为蛋白酶可切割的子域和载药的子域的主要聚合物组分，这归因于这些聚合物在临床上可接受的医药产品中的现有用途。plga由于其生物可降解性和细胞相容性而是广泛用于包封治疗剂如药物和蛋白质的合成聚合物[han,f.y.等人frontiersinpharmacology7,185-185(2016)]。类似地，peg已经用作胰岛免疫保护的保形涂层[tomei,a.a.等人proceedingsofthenationalacademyofsciences111(29),10514(2014)]，或用作外科密封剂的组分[zoia,c.等人journalofappliedbiomaterials&functionalmaterials13(4),372-375(2015)]。此外，由于peg是可以宽范围分子量获得且具有各种多臂构型和官能团的合成聚合物，其已经用于从全身应用、局部应用到可注射应用的范围的各种药物递送平台[li,j.和mooney,d.j.naturereviewsmaterials1,16071(2016)]。最近，基于peg的水凝胶作为细胞相容平台用于多种药物和基于细胞的治疗剂的刺激反应性递送的通用性也已被证明[badeau,b.a.naturechemistry10,251(2018)]。[0130]肽交联的水凝胶通过使4臂聚(乙二醇)-乙烯砜(peg-vs)(20kda，sigmaaldrich，美国密苏里州圣路易斯)与双半胱氨酸肽(genscript，香港)以化学计量比反应来制备。将每种前体溶解在三乙醇胺(teoa)缓冲液(0.3m)或pbs/naoh缓冲液(ph＝10)中。典型地，为了制备117μlpeg含量为4.2％(w/v)的肽交联的水凝胶，将5mgpeg-vs溶解于玻璃小瓶中的100μl缓冲溶液中，并与溶解于17μl相同缓冲溶液中的化学计量量的肽交联剂混合。在肽交联剂的初步筛选中评价具有4.2％(w/v)peg含量的水凝胶。在所有随后的体外和体内实验中使用具有1.7％(w/v)peg含量的水凝胶。为了形成由包埋在肽交联的水凝胶中的plga颗粒(含有或不含布洛芬)组成的杂合水凝胶，将上述前体单独地溶解于含有浓度为5％(w/v)的悬浮plga颗粒的缓冲溶液中。通过定期倒置含有peg-vs、肽交联剂和plga颗粒的液体混合物的玻璃小瓶，当这种液体混合物尽管在重力作用下但不向下流动时证实凝胶化。肽间隔子序列、肽底物序列和蛋白酶敏感性的例子示于表2中。[0131]表2：潜在间隔子和底物。呈间隔子-底物-recaps形式的间隔子和底物的组合可以在我们平台中用作交联剂。目的蛋白酶的切割位点用“↓”符号指示。[0132][0133]1.3用于最佳凝胶化和蛋白水解切割的肽交联剂的筛选[0134]在本研究中，设计肽交联剂的最终目的是与peg-vs形成水凝胶并在暴露于mmp-9活性时保持其可切割性。由于杂合水凝胶的模块化设计，可以独立地设计肽交联剂，其是决定mmp-9可切割性的子域的关键组分。典型地，期望的肽交联剂由侧接两个含半胱氨酸的间隔子序列的mmp-9可切割的底物序列组成，每个间隔子序列包含4个氨基酸。底物选自报道的肽序列，其已被用作用于mmp-9检测的生物传感器中的mmp-9敏感性组分或用作用于化疗的载药纳米载体中的mmp-9可切割的接头[biela,a.等人biosensorsandbioelectronics68,660-667(2015)；samuelson,l.e.等人molecularpharmaceutics10(8),3164-3174(2013)]。可以使每个末端间隔子的半胱氨酸上的硫醇部分脱质子化以形成硫醇盐[friedman,m.等人journaloftheamericanchemicalsociety87(16),3672-3682(1965)]，所述硫醇盐经由迈克尔加成反应与peg-vs的乙烯砜部分反应以诱导凝胶化[lutolf,m.p.和hubbell.,j.a.biomacromolecules4(3),713-722(2003)]。[0135]为了鉴定gel-ip的最佳肽交联剂，我们通过评价底物和间隔子选择对杂合水凝胶的凝胶化和可切割性的影响，对8种肽序列进行了定性筛选(表3和图14)。此外，还研究了在其中发生凝胶化的缓冲液，因为它们的环境ph可能影响硫醇的去质子化，且随后影响交联过程。对于底物、间隔子和缓冲液的每种组合，经由管倒置法目测检查凝胶化的可行性。将化学计量量的肽交联剂添加到含有peg-vs溶液和悬浮的ibu-plga颗粒的混合物的玻璃小瓶中。在平行实验中，使用具有相同混合物组成但没有目的肽交联剂的另一小瓶作为对照。定期倒置这两个小瓶，直到一个小瓶中的混合物尽管在重力作用下但停止流动，表明成功的凝胶化。在玻璃小瓶a1和a2的照片中捕获到典型的杂合水凝胶成功凝胶化的例子(图2)。在存在肽交联剂的情况下，在玻璃小瓶a1的底部形成白色杂合水凝胶，并且其尽管在重力作用下但不向下流动，证实成功的交联。这种固体白色外观由白色ibu-plga颗粒产生。在不存在任何肽交联剂的情况下，对照小瓶a2中的前体混合物保持自由流动，表明没有凝胶化。[0136]表3：交联剂和间隔子的例子。切割位点用“↓”符号指示。交联剂呈间隔子-底物-recaps的形式。[0137][0138][0139]将500μleppendorf管中的20μl体积的每种杂合水凝胶在37℃下与pbs缓冲液(dpbs/修饰的，不含钙和镁，hyclonettm)中的3μg/mlmmp-9(83kda，merck)一起孵育。在对照实验中，将具有相同组成的另一种杂合水凝胶浸没在不含mmp-9的pbs缓冲液中。孵育20小时后，将杂合水凝胶周围的介质取样到盖玻片上，并在光学显微镜(olympusckx53sf，日本)下观察以检查释放的颗粒的存在。[0140]mmp-9的选定浓度在患有类风湿性关节炎和骨关节炎的患者的临床伤口渗出液和滑液中mmp-9表达的范围内[ladwig,g.p.等人woundrepairandregeneration10(1)26-37(2002)；li,z.等人journalofdiabetesanditscomplications27(4)380-382(2013)]。在通过mmp-9的典型成功切割中，图2中的小瓶b1和b2的照片示出了分别在延长暴露于含有和不含mmp-9的缓冲液后，具有与小瓶a1中相同的组成的杂合水凝胶的外观。在存在mmp-9的情况下，先前在小瓶a1中看到的白色交联的杂合水凝胶消失，并且在小瓶b1中仅观察到均匀的浑浊悬浮液。光学显微镜图像c1验证了在小瓶b1的所得液体混合物中存在ibu-plga颗粒，证实这种杂合水凝胶被mmp-9成功消化。相比之下，在小瓶b2中观察到凝胶化后添加的不含mmp-9的pbs缓冲液为澄清液相。光学显微镜图像c2还证实了在小瓶b2中不存在任何释放的ibu-plga颗粒。[0141]图14汇总了来自候选交联剂的定性筛选的结果。图14的(a)和(b)列中的筛选数据表明，肽交联剂中氨基酸的组合决定了肽序列的特征，因此影响凝胶化动力学。大多数筛选的底物在5分钟至30分钟内导致成功凝胶化。令人惊讶地，仅底物avrwllta(seqidno:12)(基于其设计了肽(3；seqidno:24)和(8；seqidno:28))不能提供其对应肽交联剂与peg-vs的期望的反应性。具体地，肽(3)可以通过在pbs/naoh中而不是在toea缓冲液中与peg-vs交联而诱导凝胶化。我们推测toea可能已作为表面活性剂改变肽(3)在水溶液中的构象或排列[jones,b.h.等人softmatter11(18),3572-3580(2015)]，因此阻碍凝胶化。有趣地，在添加peg-vs之前，肽(8)在溶解于pbs/naoh缓冲液中时自组装成凝胶状相，或在teoa缓冲液中形成可能指示肽自组装的乳状溶液[zhou,q.等人progressinnaturalscience19(11),1529-1536(2009)]。这种行为可能阻碍这种肽上的半胱氨酸的硫醇与peg-vs的乙烯砜之间的后续反应，因此防止凝胶化。[0142]除了底物选择之外，间隔子设计(gcrr(seqidno:9)或gcrd(seqidno:8))也在交联过程中起重要作用。例如，在两种缓冲液中，间隔子gcrr(seqidno:9)帮助肽(2)比肽(6)明显更快地与peg-vs交联，肽(6)是用相同的底物和不同的间隔子gcrd(seqidno:8)设计的。类似地，在pbs/naoh中，含有间隔子gcrr(seqidno:9)的肽(4)比含有间隔子gcrd(seqidno:8)的肽(5)更快地与乙烯砜反应。我们的数据与公开的文献一致，所述文献报道了在半胱氨酸的硫醇部分附近的正电荷(例如，精氨酸，r)增加了交联速率，而负电荷(例如，天冬氨酸，d)减慢了这个反应[lutolf,m.p.等人bioconjugatechemistry12(6),1051-1056(2001)]，这可能是因为前者稳定了中间体硫醇盐所致[roos,g.等人antioxidants&redoxsignaling18(1),94-127(2012)]。[0143]缓冲液的选择也可以影响交联速率，因为它们的环境ph影响硫醇的去质子化，导致中间体硫醇盐的浓度改变[lutolf,m.p.和hubbell,j.a.biomacromolecules4(3),713-722(2003)]。除了teoa缓冲液(其是通常用于迈克尔加成的强碱性缓冲液，但也引起细胞毒性问题)之外，我们还研究了pbs/naoh缓冲液作为潜在的细胞相容替代物。如图14中所示，除了含有底物avrwllta(seqidno:12)的序列外，所有其他肽都可以在两种缓冲液中与peg-vs交联，尽管具有不同的动力学。有趣地，在肽(5)的情况下，pbs/naoh缓冲液导致比在teoa缓冲液中更慢的交联动力学。我们推测碱性较弱的缓冲液pbs/naoh在使硫醇去质子化方面不如toea缓冲液有效，因此降低了凝胶化速率。我们关于凝胶化动力学的数据表明，即使对于相同的交联剂设计，反应缓冲液的适当选择对于确保成功的水凝胶形成也是关键的。[0144]接下来，图14的(c)列的结果汇总了每种成功交联的杂合水凝胶在mmp-9的溶液中的可切割性。具体地，与肽(1)、(4)、(5)和(7)交联的杂合水凝胶可以被mmp-9消化，如通过当将水凝胶浸没在含有mmp-9的缓冲液中时在周围介质中存在释放的plga颗粒所证明。有趣地，用肽(2)、(3)和(6)形成的水凝胶在暴露于mmp-9时未被切割，如通过在存在和不存在mmp-9的两种情况下从杂合水凝胶中释放的颗粒数量同样微不足道(未显示)来证实。这个发现是令人惊奇的，因为这三个序列的底物据报道是抗肿瘤药物[samuelson,l.e.等人molecularpharmaceutics10(8),3164-3174(2013)]或电化学阻抗传感器[biela,a.等人biosensorsandbioelectronics68,660-667(2015)]中的蛋白酶可激活的纳米载体中的mmp-9敏感性部分。可能的解释是，侧接所述底物两端的间隔子可能已经改变肽序列的构象，产生防止蛋白酶接近底物上的切割位点的空间位阻。[0145]为了设计有效的蛋白酶触发的药物递送平台，最佳的肽交联剂应诱导快速凝胶化并保持其响应于这种蛋白酶的可切割性。在8种筛选的肽中，3个序列(肽(1)、(4)和(7)；图14)导致快速凝胶化和在所研究的两种缓冲液中通过mmp-9的成功水凝胶切割。我们选择了肽(1)(其包含序列gcrr-kgprslsgk-rrcg(seqidno:18)中的17个氨基酸)和pbs/naoh缓冲液的组合，以制备期望的杂合水凝胶gel-ip用于后续研究。[0146]1.4基于微粒的包封药物的杂合水凝胶的药物释放动力学的体外研究[0147]在此体外释放研究中比较了两种类型的杂合水凝胶。gel-ip是用可切割肽(1)gcrr-kgprslsgk-rrcg(seqidno:18)交联的包埋有载布洛芬的plga颗粒(ibu-plga颗粒)的水凝胶。scrgel-ip是包埋有ibu-plga颗粒并用不可切割的乱序肽gcrr-kssrggplk-rrcg(seqidno:29)交联的水凝胶。简短地讲，将40μlgel-ip浸没在1.5ml管中的含有或不含3μg/mlmmp-9的500μlpbs溶液中，而将40μlscrgel-ip仅暴露于含有mmp-9的pbs溶液。在使用gel-ip的对照实验中，将mmp-9抑制剂i(merck)与mmp-9一起添加。将每个管维持在multibiors-24旋转器(biosan)上在37℃的温度和30rpm的振荡速度下。以预定的间隔，从每个管中收集液体混合物的10μl等分试样，并将其添加到90μl乙腈中。使所得样品通过0.22μm注射过滤器并在4℃下储存。将10μl体积的含有或不含3μg/mlmmp-9的新鲜pbs溶液添加到每个管中以替代等分的体积。24小时后，将每种杂合水凝胶与其剩余的液体混合物一起完全溶解于乙腈中。所有收集的样品中布洛芬的浓度通过rp-hplc定量。通过将在每个点收集的药物累积量用每个管中药物的初始量进行归一化来计算在每个时间点的药物释放百分比[dang,t.t.等人biomaterials32(19),4464-4470(2011)]。从一式四份实验的平均值获得对于每种杂合水凝胶所报道的释放动力学。[0148]如图3中所示，将gel-ip暴露于mmp-94小时将累积药物释放显著增加到100％，相比之下，在不存在mmp-9的情况下，所述累积药物释放仅为25％。当mmp-9抑制剂与mmp-9一起添加时，布洛芬的释放量被显著抑制。这是因为mmp-9的蛋白水解活性可以被小分子抑制剂选择性地阻断。因此，mmp-9不能切割肽交联剂以分解水凝胶基质，阻止布洛芬的触发释放。此外，在存在mmp-9的情况下，在最初4小时内gel-ip被完全消化以释放100％的布洛芬，而在相同条件下，仅有40％从通过乱序肽交联的杂合水凝胶(scrgel-ip)中释放。在存在mmp-9的情况下，与从scrgel-ip相比，从gel-ip递送的布洛芬的量更高，证实了可切割肽(1)在使得mmp-9能诱导gel-ip降解以触发增加的药物释放中的作用。总之，图3中的数据证明触发的释放是由于mmp-9对其相关肽底物的切割活性所致。[0149]评价基于微粒的包封药物的杂合水凝胶对巨噬细胞的体外抑制作用[0150]通过研究gel-ip对raw264.7鼠巨噬细胞增殖的体外抑制作用，评价暴露于mmp-9触发物时从gel-ip释放的药物。已公开的研究先前表明局部巨噬细胞增殖而不是单核细胞募集在炎症相关疾病如动脉粥样硬化和肥胖相关脂肪组织炎症中支配着这种细胞类型的病灶积累[amano,s.u.等人(2014)]。因此，巨噬细胞自分裂被假定为对于炎症的治疗调节的潜在靶标。[0151]将raw264.7鼠巨噬细胞在补充有10％fbs(gibcolaboratories)和1％青霉素/链霉素(gibcolaboratories)的高葡萄糖dmem(gibcolaboratories)中在37℃下在5％co2气氛中培养。将传代20-30代的raw264.7巨噬细胞以2×104个细胞/孔的初始接种密度接种在96孔板中并在37℃下孵育24小时。将100μl体积的用1.7％(w/v)peg和5％(w/v)载布洛芬的plga微粒制造的每种杂合水凝胶(gel-ip和scrgel-ip)在500μl无酚红dmem(gibcolaboratories)培养基中在存在和不存在3μg/mlmmp-9的情况下孵育2小时(图4a)。还包括包埋有不含布洛芬的plga颗粒(gel-p)的mmp-9可切割水凝胶作为对照杂合水凝胶。在一组gel-ip样品中，在孵育期间将mmp-9抑制剂i与mmp-9一起添加。孵育后，从每种杂合水凝胶配制品中收集200μl培养基作为释放物，处理接种的raw264.7巨噬细胞72小时。还使用200μl体积的新鲜培养基和0.6mg/ml的自由溶解的布洛芬处理巨噬细胞，分别作为阴性对照和阳性对照。基于装载在每种杂合水凝胶中的药物的量，对自由溶解的布洛芬的此剂量进行归一化。然后，从处理过的巨噬细胞中去除释放物；并且按照制造商的方案使用wst-1细胞增殖测定(abcam)评价处理过的细胞的体外代谢活性。具体地，将200μl以10:1体积比含有wst-1试剂的培养基添加到每个孔中，并在37℃下孵育3小时。然后将100μl体积的这种培养基转移到新的96孔板中；并且使用酶标仪(spectramaxm5)记录其在450nm和690nm处的吸光度。为了计算相对代谢活性，将所有450nm处的吸光度值减去690nm参考波长处的值和背景吸光度，以获得校正的吸光度值。然后，如下计算相对代谢活性：[0152]相对代谢活性＝a测试/a对照*100％[0153]其中a测试和a对照分别是从用释放物和新鲜培养基处理的细胞收集的溶液的校正的吸光度值。[0154]如图4b中所示，通过mmp-9消化gel-ip获得的释放物完全抑制了巨噬细胞增殖(约0％)，而在不存在mmp-9的情况下从gel-ip获得的释放物导致处理过的细胞的更高代谢活性(约40％)。此数据表明，当通过浓度为3μg/ml的mmp-9(这模拟了由于慢性疾病中炎症增加引起的上调的蛋白酶表达)触发时，gel-ip释放更高量的布洛芬以进一步减少巨噬细胞增殖[ladwig,g.p.等人woundrepairandregeneration10(1)26-37(2002)；li,z.等人(2013)]。此外，在不存在mmp-9的情况下，用从gel-ip获得的释放物处理的巨噬细胞的代谢活性(约40％)显著高于用等效剂量的自由溶解的药物处理的巨噬细胞的代谢活性(约0％)(这模拟了通过全身施用的不受控制的药物递送)。因此，在不存在mmp-9的情况(这模拟了非炎性生理条件[roomi,m.w.等人(2009)])下，gel-ip能够比自由溶解的药物释放更少的布洛芬，随后使所述药物对巨噬细胞的作用最小化。gel-ip的这种特征表明其通过减少由全身药物施用期间不受控制的释放动力学导致的过量药物剂量而减轻非炎性病症中药物诱导的副作用的潜力[youssef,j.等人rheumaticdiseasesclinicsofnorthamerica42(1)157-176(2016)]。[0155]此外，当mmp-9抑制剂与mmp-9一起添加时，巨噬细胞的代谢活性从在不存在这种抑制剂的情况下观察到的完全抑制(约0％)恢复到20％，证明活性mmp-9对于获得释放物对巨噬细胞的期望的抑制作用是必需的。在存在mmp-9的情况下，虽然从gel-ip释放的布洛芬可以完全抑制巨噬细胞增殖，但当用来自不可切割的scrgel-ip的释放物处理细胞时，这种活性仍保持在55％。来自用mmp-9抑制剂和scrgel-ip的对照实验的发现确立了活性mmp-9及其相关可切割肽两者在触发从gel-ip释放布洛芬以调节巨噬细胞增殖中的关键作用。总之，gel-ip是一种有前景的药物递送平台，其可以由蛋白酶活性触发以释放抗炎药物并潜在地调节免疫细胞的活性。[0156]虽然我们的主要目的是开发一种仅在被蛋白酶活性触发时释放药物而在不存在这种刺激的情况下释放最少的递送平台，但关于在不存在mmp-9的情况下从gel-ip释放基础量的布洛芬，仍然争议性地存在一些问题。这可能是由于药物从ibu-plga微粒表面被动扩散所致，并且导致在不存在mmp-9及其抑制剂的情况下用来自gel-ip的释放物处理的巨噬细胞的部分抑制(约40％)。然而，在需要施用抗炎药物的大多数实际临床应用中，存在一定水平的炎症。因此，这种基础药物释放可用于管理低水平的炎症和相关症状如疼痛和肿胀[steinmeyer,j.(2000)]以使炎症反应的恶化最小化[sutherland,e.r.等人(2003)]。如果炎症突然恶化并导致mmp-9活性增加，如在关节炎爆发或慢性伤口感染的情况下，gel-ip将被触发以释放更多的布洛芬来应对炎症的严重程度增加。[0157]实施例2：蛋白酶反应性的基于微粒的包封药物的杂合水凝胶的体内评价[0158]2.1免疫活性skh-1小鼠的动物护理[0159]为了进一步评价gel-ip作为用于皮下应用的可注射药物递送平台的潜在用途，我们体内评估了gel-ip及其组成材料的免疫相容性。使用免疫活性小鼠模型skh-1e研究这些材料对皮下宿主反应的影响长达5天(图5)。本研究按照新加坡南洋理工大学(ntu)的机构动物管理和使用委员会(iacuc)批准的动物方案(方案号a0343)进行。所有动物实验均遵循pharmacology7,185-185(2016)]，但其疏水性可能导致急性炎症[seong,s.-y.和matzinger,p.(2004)]以及ros活性的相关增加[dang,t.t.等人biomaterials34(23),5792-5801(2013)]。然而，在第1天的这种plga相关的ros活性在第5天最终降低到与对照皮肤相同的背景水平，这表明这种plga诱导的ros活性升高是短暂的。因此，仍然可以认为plga在skh-1e小鼠的皮下空间中是免疫相容的。总之，我们的发现表明gel-ip的组成材料(即peg水凝胶和plga颗粒)是用于设计杂合水凝胶的适合的免疫相容材料。此外，我们的生物正交化学凝胶化策略和缓冲液选择没有诱导ros活性的不利增加。[0166]实施例3：具有多重反应性的基于微粒的蛋白酶可切割水凝胶[0167]我们证明，具有多重反应性的基于微粒的蛋白酶可切割水凝胶在超过一种疾病特异性蛋白酶的共存下被最快地消化，增强了对靶标炎性疾病的特异性。典型地，通过hne肽底物(h2)和mmp-9肽底物(m2)的组合(表4)交联的h2-m2组合水凝胶在仅暴露于单一蛋白酶hne或mmp-9时保持完整。然而，当添加两种蛋白酶时，所述水凝胶被完全降解(图6a)。对上清液中定量的平均数量的plga颗粒进行的单因素anova统计分析也表明，当与具有单一蛋白酶的水凝胶和对照相比较时，在存在两种蛋白酶的情况下释放的颗粒数量显著更大(p≤0.001)(图6b)。另外，结果还表明h2和m2肽底物分别被hne和mmp-9蛋白酶优先切割。[0168]表4：具有蛋白酶可切割性和特异性的肽底物[0169][0170][0171]实施例4：包含蛋白酶反应性的基于微粒的包封药物的杂合水凝胶的复合敷料的制造[0172]3.1复合敷料的药物释放动力学的体外研究[0173]为了说明这种药物递送平台对于局部应用的通用性，我们将杂合水凝胶gel-ip与伤口敷料结合以形成复合敷料(图7a)。这种复合敷料的最终目的是在暴露于慢性伤口渗出物中升高的mmp-9水平时释放布洛芬[ladwig,g.p.等人woundrepairandregeneration10(1)26-37(2002)；li,z.等人journalofdiabetesanditscomplications27(4)380-382(2013)](图7b)，用于炎症和疼痛管理。为了制造复合敷料，将肽(1)(gcrr-kgprslsgk-rrcg；seqidno:18)和peg-vs单独溶解在含有浓度为5％(w/v)的悬浮ibu-plga颗粒的pbs/naoh缓冲液中。将这两种前体混合在一起，之后使20μl前体混合物快速沉积到直径为6mm的藻酸盐伤口敷料的圆形片材上(图7a)。凝胶化后，将复合敷料在液氮中快速冷冻并冻干至干燥。在此体外释放研究中比较了两种复合敷料。简短地讲，将含有20μlgel-ip的复合敷料浸没在1.5ml管中的含有3μg/mlmmp-9的500μlpbs溶液中，而将另一敷料仅暴露于不含mmp-9的pbs溶液。[0174]由于新形成的复合敷料被来自前体混合物的水饱和，我们观察到其进一步吸收液体的能力显著降低。因此，将复合敷料冻干以恢复其吸收能力。然后通过将这种敷料浸没在含有或不含mmp-9的缓冲溶液中24小时，研究这种敷料在暴露于mmp-9时释放布洛芬的能no:20)对于mmp-9显示出良好的特异性。[0182]第三，通过含硫醇肽与4-peg-mal的迈克尔型加成反应完成了多重蛋白酶可切割的水凝胶的制备。通过将5mg4-peg-mal溶解于100μlpbs缓冲液中，并使这种溶液与17μl肽序列的组合(如0.005mggrcr-pmavvqsvp-rcrg(seqidno:31)和0.0045mggrcr-gprslsg-rcrg(seqidno:32))反应，形成117μl体积的含有4.2％(w/v)4-peg-mal的凝胶。[0183]5.2基于缀合物的水凝胶的可调的体外药物释放[0184]如图11a-图11b中所示的从高效液相色谱法(hplc)确定的定量数据表明，通过改变双半胱氨酸交联剂或锚的选择，可以实现药物缀合的水凝胶的可调的药物释放。具体地，在图11a中，当使用相同的锚h时，当交联剂从肽xm(gcrr-gprslsg-rrcg，seqid21)变为肽xh(gcrd-gpqgiwgq-drcg，seqid22)时，累积药物释放减少。此外，在图11b中，当使用相同的交联剂xh(gcrd-gpqgiwgq-drcg，seqid22)时，当锚从肽h(gpqgiwgq-drcg，seqid19)变为肽m(gprslsg-rrcg，seqid20)时，累积药物释放减少。如图11c中所示，将水凝胶的重量比从3w/v％增加到10w/v％增加了装载能力，证实了总装载剂量的可调性。此外，与4臂peg-马来酰亚胺相比，8臂peg-马来酰亚胺可以装载更多的布洛芬。[0185]5.3炎症诱导的基于缀合的水凝胶的体内药物释放[0186]我们还获得了初步数据，表明我们的药物缀合平台的药物释放能够响应于体内炎症的增加而释放更高的药物剂量。我们使用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)作为刺激剂确立了皮肤炎症的小鼠模型(图12a)，所述刺激剂可以诱导由mmpsense探针捕获的mmp的上调。在pma注射部位，在pma注射后24小时，我们观察到红色区域，其范围与所注射的pma量的增加相关(图12b)。具体地，与0.4μgpma诱导的红色区域相比，4ugpma诱导更大的且轮廓更清晰的红色区域，而不含pma的pbs缓冲液没有引起皮肤外观的任何变化。在注射pma24小时后监测mmp活性，并且荧光信号的定量显示，与由0.4μgpma引起的mmp活性相比，由4μgpma诱导的mmp活性显著更高，相差1.9倍(图12c、图12d)。此外，存在基础量的mmp，其在不含pma的pbs缓冲液注射部位产生最低荧光信号。因此，随着皮下注射更多的pma，荧光强度升高；并且更重要地，信号强度的这种增加与小鼠背侧上的红色区域的范围相关。在使用elisa试剂盒提取pma注射部位处的皮肤组织用于mmp-9定量时，还研究了蛋白质表达(图12e)。观察到mmp-9上调的趋势与由注射的pma的不同浓度诱导的炎症严重程度的变化水平相关。具体地，4μgpma诱导的mmp-9分泌量明显高于由0.4μg和0μgpma引起的mmp-9分泌量，分别相差5倍和10倍。总之，增加量的pma皮下注射可以诱导严重程度水平增加的皮下炎症，导致更多的mmp-9分泌。[0187]为了研究体内炎症触发的来自布洛芬缀合的peg水凝胶的药物释放，通过在skh-1e小鼠背侧上的发炎部位的皮下空间中注射ibu-m_xm水凝胶的前体溶液，原位形成ibu-m_xm水凝胶(图13a)。使用提前一天产生的三种炎症水平中的任一种来触发药物释放，然后基于水凝胶注射后12小时凝胶团内部ibu-mf的剩余量来计算药物释放的百分比。图13b示出了在无pma的注射部位水凝胶的无色透明外观，与之相比，在暴露于4ugpma的部位处具有黄色外观且边界不清晰。图13c示出了从暴露于4μgpma的凝胶中释放70％的ibu-mf，相比之下，从暴露于0.4μgpma和不含pma的pbs缓冲液的那些凝胶分别释放60％和45％的药物。因此，观察到ibu-mf释放与炎症严重程度的变化水平正相关，证明其体内蛋白酶触发的释放机制。此外，在不存在pma的情况下释放45％的药物可能是由于pma和水凝胶施用期间的9和hne的混合物中的最大累积药物释放。当将凝胶暴露于不含蛋白酶的hepes缓冲液时，48小时时的最大药物释放量比在mn酶混合物溶液中的最终释放量低9％，因为完整的水凝胶系统对来自水凝胶的扩散事件产生抵抗，并且一些药物分子可能由于扩散不足而保持粘附在水凝胶基质内部。当使水凝胶暴露于酶hne时观察到相同的问题，其中最大累积药物释放达到24％，这显著低于在酶mmp-9溶液中的释放，主要是因为酶hne不能像酶mmp-9那样切割药物缀合物。然而，基于药物释放曲线，少量的药物分子仍然可以被切割并从水凝胶中扩散出来。这主要是由于水凝胶在水性环境中溶胀，从而改变了水凝胶结构并切割肽交联剂而没有溶解。[0194]总结[0195]对于抗炎治疗剂的施用，已经尝试了多种策略来改善药物释放动力学的时空控制，包括物理包封药物或将药物永久性地缀合至聚合物主链[14-17]。然而，这些系统的释放动力学不能适应炎性疾病的严重程度的变化。利用在关节炎爆发期间上调的酶作为生物信号来激活药物释放，joshi等人利用三甘油单硬脂酸酯(tg-18)的自组装以将皮质类固醇物理截留在水凝胶平台中[20]。然而，药物从这种平台的释放依赖于主要通过酯酶对tg-18主链上的酯键的切割。这些酯键在与炎性病症相关的低ph环境中的非酶水解[24-26]也可能导致不期望的非特异性药物释放。[0196]本发明集中于设计性能更好的药物递送平台，其改善对基础释放速率的控制和/或增强对炎症相关病症的选择性和特异性。总之，我们已经证明了这种平台的几个有利特征：(1)由多个整合子域组成的模块化系统设计，所述子域各自具有不同的功能并且可以通过改变组成材料的化学组成单独地产生和替代，以针对特定炎症相关病症/疾病调整载药量和药物释放动力学；(2)通过经由药物/修饰的药物通过蛋白酶可切割的肽与炎症反应性水凝胶的共价缀合显著最小化基础药物释放，或者使用载药的聚合物颗粒作为含药物域维持一定的适度基础释放，来调整基础释放速率的能力；(3)肽序列的组合使得平台能够在暴露于一种或多种疾病特异性蛋白酶时释放装载的负荷，潜在地增强所述平台释放与疾病的炎症严重程度相关的调整的剂量的特异性。这些优点在以下几个实施例中得到证明。[0197]具有单一或多重蛋白酶反应性的模块化的基于微粒的水凝胶[0198]我们开发了一种模块化的杂合水凝胶，其可以在暴露于与炎性疾病相关的升高的蛋白酶活性时被触发以释放抗炎药物。在暴露于蛋白酶活性时，水凝胶基质可以被蛋白水解性降解以释放包埋的颗粒，并因此递送期望的治疗有效载荷。杂合水凝胶的模块化设计使得能够独立优化其蛋白酶可切割的子域和载药的子域以促进水凝胶形成，通过基质金属蛋白酶-9(mmp-9)的可切割性，以最终以可调的释放速率递送期望的有效载荷。体外研究表明，蛋白酶触发的来自杂合水凝胶系统的药物释放的增强有效抑制了促炎性巨噬细胞产生tnf-α，并表明其减轻药物诱导的细胞毒性的潜力。使用非侵入性成像监测活性氧在生物材料诱导的宿主反应中的活性，我们证实了杂合水凝胶及其组成材料在免疫活性小鼠中在其皮下注射后5天后没有诱导不利的免疫应答。随后，我们将这种杂合水凝胶结合到市售的伤口敷料上，其可以在暴露于mmp-9时释放药物。总之，我们的发现表明，这种杂合水凝胶可以是经由可注射或局部应用实现按需药物递送以调节慢性疾病中的炎症的通用平台。[0199]具有单一或多重蛋白酶反应性的模块化的基于缀合物的水凝胶[0200]还开发了与抗炎药缀合的模块化水凝胶系统。我们证明了治疗药物的触发释放可以通过单一或双重蛋白酶刺激来实现。在一些实施方案中，药物缀合的水凝胶系统的载药能力可以通过操纵作为水凝胶主链的聚乙二醇的构型来增加。药物释放速率通过改变蛋白酶可切割的肽锚和交联剂来调节。此外，使用具有不同严重程度水平的化学诱导的皮下炎症的模型，证明了体内蛋白酶触发的药物释放。[0201]参考文献[0202]在本说明书中显然在先公开的文件的任何列表或讨论均不应一定被认为承认这个文件是现有技术的一部分或者是公知常识。[0203]abdelaziza,hadeerm.etal.,inhalableparticulatedrugdeliverysystemsforlungcancertherapy:nanoparticles,microparticles,nanocompositesandnanoaggregates.journalofcontrolledrelease269(2018)374–392.[0204]amano,s.u.；cohen,j.l.；vangala,p.；tencerova,m.；nicoloro,s.m.；yawe,j.c.；shen,y.；czech,m.p.；aouadi,m.,localproliferationo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