本发明涉及化妆品制备技术领域，具体为基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法。
背景技术：
水性化妆品(water-basedcosmetic)，例如包括精华液，爽肤水，清面乳，面霜，喷雾，面膜，保湿霜，防晒霜，沐浴液，收敛剂，剃须用品，洗发素，护发素，粉底液，粉底霜和其他护肤品。应用于人的皮肤，头部、面部、颈部、胸部、背部、腹部、会阴部、四肢，干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白(如i、ii、iii、iv型胶原蛋白)以及各种溶菌酶等对机体的作有及修复损伤中都是必不可少的。表皮干细胞是一种单能干细胞，也是皮肤更新的种子细胞。人类表皮每天都有大量的表皮细胞死亡脱落，也会有相应数量的新生表皮细胞加以补充。随着人们年龄的增加，干细胞数量逐渐枯竭，以及干细胞再生能力下降。皮肤出现斑点，折皱也逐渐增多，这就是表皮干细胞再生能力的减退，如何使表皮干细胞保持旺盛的新陈代谢能力，是保持皮肤健康的关键，藏红花，为鸢尾科植物番红花crocussativusl的干燥柱头。味甘，性平。归心、肝经。具有忧郁痞闷，解郁安神，惊悸发狂，温毒发斑，凉血解毒，活血化瘀，产后瘀阻功效。
为此，我们提出基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了具体为基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法，包括以下步骤：
s1：间充质干细胞的组织成分液获取步骤；
s2：向细胞培养工厂中继续加入蛋白培养基p1和含双抗的pbs缓冲液继续进行培养；
s3：纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质的溶液；
s4：间充质干细胞的干细胞分泌因子液获取；
s5：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养；
s6：纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，经再次灭菌处理，获得物为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质，所制得液体也是间充质干细胞分泌素；
s7：藏红花干细胞以及提取内容物的制备。
作为优选，所述s1中，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，然后将收集的间充质干细胞放置与加入不含丙酮，不含酚红，不含二甲基亚砜制剂的细胞培养基细胞培养基(无菌蒸馏水1000ml，60％低糖dmem，40％mcdb201为基础培养源，然后添加(按体积计算)1％～3％胎牛血清、维生素b1(单独灭菌)1μg/ml，维生素b6(单独灭菌)2mg/ml，5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、10～25μg/l血小板生长因子、5～15μg/l内皮细胞生长因子，5～15μg/l表皮细胞生长因子，0.25～0.5g/l胎盘白蛋白，nacl(氯化钠)0.5g，完全培养基和含双抗的pbs缓冲液体积比为1∶3～5，总ph值缓冲至7.2土0.2可由碳酸氢钠或磷酸二氢钠调节，)中的新容器内，此时采用酶溶细胞破壁法，在细胞培养基中加入溶壁酶，所需浓度为1-2％(w/v)，酶解温度为25-35℃，酶解时间为1-2小时，用倒置显微镜观察细胞破碎程度，满意后所制得液体为间充质干细胞的组织成分液。
作为优选，所述s2中，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用无菌蒸馏水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞的组织成分的蛋白加强培养液。
作为优选，所述s4中，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p1(p1：无菌蒸馏水1000ml，甘氨酸0.5g，天冬酰胺0.5g，天冬酰胺0.5g，丝氨酸0.5g，苏氨酸0.5g，半胱氨酸0.5g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞分泌素。
作为优选，所述s5中，用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p2(p2：无菌蒸馏水1000ml，胰蛋白胨5.0g,na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。
作为优选，所述s7中的具体步骤为：第一步，取藏红花未开花花苞，以及茎叶连接处，活性最强，冲洗去除周围的土，从母株上切下，立即避光、避热、在20℃清洗，医用碘伏浸泡0.5min，立即用无菌蒸馏水清洗干净，5～20％的nahco3浸泡3min(7≦ph设定值≦11，10≦最佳ph值≦11)，无菌镊子取出藏红花根，无菌滤纸吸干，4℃保存备用，全过程避光、避热；
第二步，在无菌条件下，在工作台将藏红花花苞、茎叶切成厚度0.5～2mm的薄片，无菌50％葡萄糖注射液高渗处理，使藏红花内正常的分化细胞脱水坏死，仅藏红花的细胞形成层能保留生命力。
作为优选，所述s7中的具体步骤为：第三步，从藏红花形成层中分离细胞，经固体或半固体培养基培养后，获得藏红花形成层来源的藏红花干细胞，培养基采用标准的ms(murashigeandskoog)培养基即可，加入0.5～1％的琼脂固化，利于藏红花干细胞的快速生长，但是本专利不排斥由氨基酸、酰胺、嘌呤，糖类，微量元素，多种无机盐类，维生素、生长素的各种排列组合培养基，甚至也不排斥使用氨基酸缺陷型培养基，藏红花干细胞形成层按每0.1～0.5g/cm2接种密度配置固体或半固体或流体培养基进行接种，培养温度为18～30℃，ph值为7.0～7.9，酸碱平衡用hcl和nahco3缓冲，培养15～25天，藏红花形成层组织表现为均一生长的平铺状表现，其他组织则为不规则的聚集表现，去除不规则表现组织，将生长后的形成层组织再次重新换至新鲜的培养基中二次接种，获得物为聚团的藏红花干细胞形成层；
第五步，将聚团的藏红花干细胞形成层加入缓冲分离液，缓冲分离液配方为基础液去离子水，加入10％hcl和10％nahco3的缓冲平衡，ph在4.5～6.5，加入0.1～0.28％的β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，0.1～0.28％的果胶酶，加入半胱氨酸0.5g/1000ml，(半胱氨酸可以拮抗葡萄糖酸内酯、重金属离子对纤维素酶的抑制，)对藏红花形成层的干细胞团进行生物酶分离10小时，将藏红花干细胞形成层细胞团分离，倒置显微镜观察形态为单个藏红花干细胞大量出现。
作为优选，所述s7中的具体步骤为：第六步，将上述混合液在30℃恒温摇床200rpm震荡，30分钟，所得全部液体500～2000rpm/min离心20分钟，收集底层细胞，和杂质混合物，150～200目无菌滤网过滤杂质，得到单体游离的藏红花干细胞，以上过程可以反复三到五次，细胞混合得到的藏红花干细胞，在干细胞培养液内然后逐步传代扩增至第四代，诱导培养基为无菌去离子水1000ml，甘氨酸0.1g，天冬酰胺0.1g，天冬酰胺0.1g，苏氨酸0.1g，丝氨酸0.1g，半胱氨酸0.1g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)3.0g，nh4cl(氯化铵)0.5g,mgso4(硫酸镁)0.1g,cacl2(氯化钙)0.2g，feso4.7h2o(硫酸亚铁)0.03g，znso4(硫酸锌)0.01g，mnso4(硫酸锰)0.02g；
此外，按质量比添加2,4二氯苯氧乙酸2μg/l(强生长素)，萘乙酸2μg/l(次强生长素)，6-苄基腺嘌呤200mg/l(细胞分裂素)，赤霉素250mg/l(不定胚发育素)，维生素c(单独灭菌)50μg/ml；
第七步，每三天更换培养液，培养第4代，至细胞密度为1×106/ml，得到高浓度藏红花干细胞悬液；
第八步，将藏红花干细胞悬液送入5～200层的细胞培养工厂，进行半自动化的规模培养，快速迭代，产出的藏红花干细胞，一部分液氮储存作为母本，用作化妆品原料的送入离心机，15000～20000rpm/min离心5～10分钟，即得到藏红花干细胞裂解产物，-80℃超低温冰箱保存待用。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了具体为基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法，具备以下有益效果：
该具体为基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法，包含间充质干细胞分泌因子、藏红花干细胞提取物、蚯蚓激酶、透明质酸的组合物。提供了高达100余种活性物质。通过透明质酸良好的构架体使其保持良好的吸收状态。组合物对皮肤、该组合物对皮肤、粘膜无过敏反应，无刺激与反应性皮炎。组合物小分子量，是能够很有效的化妆品的组合物。组合物符合现代标准、不含化学添加剂的发展趋势。组合物操作工艺合理，适合集团化大规模生产。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：基于藏红花干细胞提取物等组合物的水性化妆品制备方法，包括以下步骤：
s1：间充质干细胞的组织成分液获取步骤；
s2：向细胞培养工厂中继续加入蛋白培养基p1和含双抗的pbs缓冲液继续进行培养；
s3：纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质的溶液；
s4：间充质干细胞的干细胞分泌因子液获取；
s5：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养；
s6：纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，经再次灭菌处理，获得物为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质，所制得液体也是间充质干细胞分泌素；
s7：藏红花干细胞以及提取内容物的制备。
所述s1中，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，然后将收集的间充质干细胞放置与加入不含丙酮，不含酚红，不含二甲基亚砜制剂的细胞培养基细胞培养基(无菌蒸馏水1000ml，60％低糖dmem，40％mcdb201为基础培养源，然后添加(按体积计算)1％～3％胎牛血清、维生素b1(单独灭菌)1μg/ml，维生素b6(单独灭菌)2mg/ml，5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、10～25μg/l血小板生长因子、5～15μg/l内皮细胞生长因子，5～15μg/l表皮细胞生长因子，0.25～0.5g/l胎盘白蛋白，nacl(氯化钠)0.5g，完全培养基和含双抗的pbs缓冲液体积比为1∶3～5，总ph值缓冲至7.2土0.2可由碳酸氢钠或磷酸二氢钠调节，)中的新容器内，此时采用酶溶细胞破壁法，在细胞培养基中加入溶壁酶，所需浓度为1-2％(w/v)，酶解温度为25-35℃，酶解时间为1-2小时，用倒置显微镜观察细胞破碎程度，满意后所制得液体为间充质干细胞的组织成分液。
所述s2中，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用无菌蒸馏水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞的组织成分的蛋白加强培养液。
所述s4中，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p1(p1：无菌蒸馏水1000ml，甘氨酸0.5g，天冬酰胺0.5g，天冬酰胺0.5g，丝氨酸0.5g，苏氨酸0.5g，半胱氨酸0.5g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞分泌素。
所述s5中，用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p2(p2：无菌蒸馏水1000ml，胰蛋白胨5.0g,na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。
所述s7中的具体步骤为：第一步，取藏红花未开花花苞，以及茎叶连接处，活性最强，冲洗去除周围的土，从母株上切下，立即避光、避热、在20℃清洗，医用碘伏浸泡0.5min，立即用无菌蒸馏水清洗干净，5～20％的nahco3浸泡3min(7≦ph设定值≦11，10≦最佳ph值≦11)，无菌镊子取出藏红花根，无菌滤纸吸干，4℃保存备用，全过程避光、避热；
第二步，在无菌条件下，在工作台将藏红花花苞、茎叶切成厚度0.5～2mm的薄片，无菌50％葡萄糖注射液高渗处理，使藏红花内正常的分化细胞脱水坏死，仅藏红花的细胞形成层能保留生命力。
所述s7中的具体步骤为：第三步，从藏红花形成层中分离细胞，经固体或半固体培养基培养后，获得藏红花形成层来源的藏红花干细胞，培养基采用标准的ms(murashigeandskoog)培养基即可，加入0.5～1％的琼脂固化，利于藏红花干细胞的快速生长，但是本专利不排斥由氨基酸、酰胺、嘌呤，糖类，微量元素，多种无机盐类，维生素、生长素的各种排列组合培养基，甚至也不排斥使用氨基酸缺陷型培养基，藏红花干细胞形成层按每0.1～0.5g/cm2接种密度配置固体或半固体或流体培养基进行接种，培养温度为18～30℃，ph值为7.0～7.9，酸碱平衡用hcl和nahco3缓冲，培养15～25天，藏红花形成层组织表现为均一生长的平铺状表现，其他组织则为不规则的聚集表现，去除不规则表现组织，将生长后的形成层组织再次重新换至新鲜的培养基中二次接种，获得物为聚团的藏红花干细胞形成层；
第五步，将聚团的藏红花干细胞形成层加入缓冲分离液，缓冲分离液配方为基础液去离子水，加入10％hcl和10％nahco3的缓冲平衡，ph在4.5～6.5，加入0.1～0.28％的β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，0.1～0.28％的果胶酶，加入半胱氨酸0.5g/1000ml，(半胱氨酸可以拮抗葡萄糖酸内酯、重金属离子对纤维素酶的抑制，)对藏红花形成层的干细胞团进行生物酶分离10小时，将藏红花干细胞形成层细胞团分离，倒置显微镜观察形态为单个藏红花干细胞大量出现。
所述s7中的具体步骤为：第六步，将上述混合液在30℃恒温摇床200rpm震荡，30分钟，所得全部液体500～2000rpm/min离心20分钟，收集底层细胞，和杂质混合物，150～200目无菌滤网过滤杂质，得到单体游离的藏红花干细胞，以上过程可以反复三到五次，细胞混合得到的藏红花干细胞，在干细胞培养液内然后逐步传代扩增至第四代，诱导培养基为无菌去离子水1000ml，甘氨酸0.1g，天冬酰胺0.1g，天冬酰胺0.1g，苏氨酸0.1g，丝氨酸0.1g，半胱氨酸0.1g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)3.0g，nh4cl(氯化铵)0.5g,mgso4(硫酸镁)0.1g,cacl2(氯化钙)0.2g，feso4.7h2o(硫酸亚铁)0.03g，znso4(硫酸锌)0.01g，mnso4(硫酸锰)0.02g；
此外，按质量比添加2,4二氯苯氧乙酸2μg/l(强生长素)，萘乙酸2μg/l(次强生长素)，6-苄基腺嘌呤200mg/l(细胞分裂素)，赤霉素250mg/l(不定胚发育素)，维生素c(单独灭菌)50μg/ml；
第七步，每三天更换培养液，培养第4代，至细胞密度为1×106/ml，得到高浓度藏红花干细胞悬液；
第八步，将藏红花干细胞悬液送入5～200层的细胞培养工厂，进行半自动化的规模培养，快速迭代，产出的藏红花干细胞，一部分液氮储存作为母本，用作化妆品原料的送入离心机，15000～20000rpm/min离心5～10分钟，即得到藏红花干细胞裂解产物，-80℃超低温冰箱保存待用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。