从骆驼蓬中提取分离的γ-去氢骆驼蓬碱在制备抑制胃癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种天然产物在制备抗胃癌药物中的应用，属于天然产物化学技术领域。

背景技术：

胃癌(gastriccarcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，死亡率靠前；胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、暧气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，胃癌，由于其早诊率低，大多数患者早期缺乏明显的临床症状，诊断时往往已处于疾病中晚期，失去了手术治疗的机会；胃癌可进行靶向治疗，化疗虽可在一定程度上延长其生存期，但大多数化疗疗效局限且维持时间短，中位生存期与2年生存率都很让人无奈，靶向治疗可针对性地损伤癌细胞，减轻正常细胞损害，但是，目前胃癌靶向治疗药物种类及作用均有限。故胃癌相关治疗药物的开发，尤其靶向治疗迫在眉睫。

咔啉类生物碱是一大类生物碱，按照吡啶环氮原子所在位置不同，可以分为α、β、γ、δ-咔啉。其中β-咔啉类生物碱是在自然界分布最广，数量最多，也是研究最为深入的咔啉类生物碱，呈现非常广谱的的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗炎、抗疟疾、杀藻等，其中抗癌作用研究的最多。然而，与β-咔啉类生物碱相比，γ-咔啉生物碱表达更为显著的抗癌活性目前，天然产物当中报道的γ-咔啉生物碱极少。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种从骆驼蓬中提取分离的γ-去氢骆驼蓬碱在制备抑制胃癌药物中的应用，经研究实验表明：γ-去氢骆驼蓬碱具有较高抗癌活性，特别是对胃癌细胞都有很好的抑制效果,适用于开发成抑制癌细胞生长的新药，具有广阔的应用前景。

本发明所述的一种从骆驼蓬中提取分离的γ-去氢骆驼蓬碱在制备抑制胃癌药物中的应用。

本发明所述的一种从骆驼蓬中提取分离的γ-去氢骆驼蓬碱在制备抑制胃癌药物中的应用，所述的γ-去氢骆驼蓬碱的结构式为：

与现有技术相比，本发明的优点在于：所述的γ-去氢骆驼蓬碱与现有相近结构的化合物去氢骆驼蓬碱相比，具有更为显著的抗胃癌活性。

附图说明

图1为本发明不同剂量去氢骆驼蓬碱、γ--去氢骆驼蓬碱对sgc-7901细胞增殖抑制；

图2为本发明去氢骆驼蓬碱、γ-去氢骆驼蓬碱与胃癌靶点akt1结合分子对接图，其中a为去氢骆驼蓬碱与akt1结合分子对接图；b为γ-去氢骆驼蓬碱与akt1结合分子对接图；

图3为本发明去氢骆驼蓬碱、γ-去氢骆驼蓬碱与胃癌靶点efgr结合分子对接图，其中a为去氢骆驼蓬碱与efgr结合分子对接图；b为γ-去氢骆驼蓬碱与efgr结合分子对接图；

图4为本发明去氢骆驼蓬碱、γ-去氢骆驼蓬碱与胃癌靶点jun结合分子对接图，其中a为去氢骆驼蓬碱与jun结合分子对接图；b为γ-去氢骆驼蓬碱与jun结合分子对接图；

图5为本发明去氢骆驼蓬碱、γ-去氢骆驼蓬碱与胃癌靶点mapk1结合分子对接图，其中a为去氢骆驼蓬碱与mapk1结合分子对接图；b为γ-去氢骆驼蓬碱与mapk1结合分子对接图；

图6为本发明去氢骆驼蓬碱、γ-去氢骆驼蓬碱与胃癌靶点tp53结合分子对接图，其中a为去氢骆驼蓬碱与tp53结合分子对接图；b为γ-去氢骆驼蓬碱与tp53结合分子对接图。

具体实施方式

实施例1

γ-去氢骆驼蓬碱的提取分离：

骆驼蓬总生物碱的制备：

a、取骆驼蓬子药材5kg，加入8、6和6倍体积的浓度为70％乙醇水溶液提取3次，每次1小时，合并提取液，温度60℃浓缩，干燥成干浸膏，共得1375g；

b、取得到的浸膏500g，加10％硫酸溶液300ml，分次溶解浸膏中的生物碱，过滤，合并提取液，加25％氨水溶液至ph值＝9.5，静置24h后过滤，沉淀干燥，即得总生物碱提取物11.696g；

样品溶液的制备：

称取1g总生物碱提取物于试管中，加入5ml添加三乙胺的上相和5ml不加盐酸的下相，超声振荡使之溶解，以备ph区带逆流色谱分离用；

ph-区带逆流色谱溶剂系统的选择：

ph区带逆流色谱的溶剂系统为体积比2:2:3叔丁基甲醚:乙腈:水，配制于分液漏斗中并剧烈振荡，体系分相平衡后分离出上下相，上层有机相加10mmol/l三乙胺作为固定相，下层水相加5mmol/l盐酸作为流动相；

ph-区带逆流色谱分离：

首先将固定相以20ml/min流速泵入逆流色谱螺旋管中，待充满整个螺旋管后，将溶有样品的上下相混合液通过进样器注入色谱柱，然后开启速度控制器，缓慢调节主机转速到850r/min顺时针旋转，再以2.0ml/min的流速泵入流动相，同时开启紫外检测器，在254nm下检测色谱峰，根据记录仪显示出的色谱图来收集馏分，一次进样1.0g，得γ-去氢骆驼蓬碱134mg；

化合物的结构鉴定：

γ-去氢骆驼蓬碱(γ-harmine)，黄色针状结晶，m.p.238-240℃，最大紫外吸收波长(甲醇λmax):240nmand323nm.esi-ms(电喷雾质谱)，m/z(质核比)213[m+h]+.1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:12.70(1h,s)，8.40(1h,d,j＝6.0hz)，8.33(1h,d,j＝6.6hz)，8.31(1h,d,j＝9.0hz)，7.13(1h,d,j＝1.2hz)，7.02(1h,d,j＝9.0hz)，3.93(3h,s)，3.02(3h，s).13c-nmr(dmso-d6,150mhz)δ:162.4，145.1，137.6，133.8，131.6，129.4，124.4，113.8，113.7，112.1，94.3，55.7，16.2，以上数据与文献报道一致,鉴定为γ-去氢骆驼蓬碱。

实施例2

cck-8法检测γ-去氢骆驼蓬碱对胃癌细胞增殖的抑制作用：

1.细胞复苏：

将含有10％fbs(胎牛血清)的rpmi-1640培养基从温度4℃冰箱取出，置于37℃水浴箱中预热20min,回温后用75％的酒精棉球擦拭外侧瓶壁并移入已被紫外灯照射消毒过的超净台内备用；取出存有人胃腺癌细胞sgc-7901的细胞冻存管，立即移入37℃水浴箱中快速解冻，将解冻后的冻存管移入离心机，以800rpm转速离心5min，取出冻存管，轻轻旋开冻存管盖，用1ml移液枪将上层冻存液吸弃，避免吸起管底细胞，加入1mlrpmi-1640完全型培养基，反复吹打直至形成均匀的单细胞悬液(过程要轻柔)，用移液枪将细胞悬液移至100mm的培养皿中，加入5-6ml培养基，轻轻吹打使其分散均匀，倒置显微镜下观察细胞的形态与分布后静置于温度37℃、浓度5％co2、饱和湿度的培养箱中；

2、细胞培养：

细胞接种后，隔日于显微镜下观察细胞生长形态及细胞贴壁状况，若死细胞数量过多则需更换完全培养基。吸弃培养皿中的旧培养基，移入等量的新鲜完全培养基，换液后的细胞继续置于细胞培养箱中培养。当贴壁细胞长至培养皿底面积的80％左右时，可传代或进行相关处理；

3.细胞传代

将含有10％fbs的rpmi-1640新鲜培养基、0.25％的胰蛋白酶及pbs放入温度37℃水浴箱中预热20min，用75％酒精擦拭外侧瓶壁后移入紫外灯照射消毒过的超净台内备用，取出人胃腺癌细胞sgc-7901，于倒置显微镜下观察细胞的生长状态及贴壁情况，汇合度应达到80％，将培养皿移入超净台内，以pbs轻洗细胞表面3次并吸弃，加入适量的0.25％胰酶，轻轻晃动，放置于倒置显微镜下快速观察。继续加入适量新鲜培养基后以移液枪轻轻吹打培养皿底，使贴壁细胞脱落，再轻柔吹打，直至形成均匀的单细胞悬液，将培养皿置于倒置显微镜下观察，若培养皿底无贴壁细胞，细胞均匀分散，按所需比例传代至新的培养皿中，加入新鲜完全培养基至所需量，置于细胞培养箱中培养；

4.cck-8法检测：

选取对数生长期的人胃癌sgc-7901细胞，把细胞悬液浓度调整到1×10⁵个/ml，将细胞接种在96孔板，放置于浓度5％co2、温度37℃细胞培养箱内孵育12小时，在显微镜下，观察细胞贴壁后，立即更换培养液，分别按a组25g/ml，b组50g/ml，c组100g/ml，d组200g/ml，e组为空白对照组，给予去氢骆驼蓬碱、γ-去氢骆驼蓬碱，每组同时设有5个复孔，药物作用24小时后，每一孔可加入50lcck-8溶液，再孵育2-4小时，使用酶标仪检测，测的每孔在450nm处的吸光度值(a)，用公式：细胞生长抑制率＝[(a对照-a加药)/a对照]×100％计算，不同药物剂量去氢骆驼蓬碱、γ--去氢骆驼蓬碱作用于人胃癌sgc-7901细胞24小时后细胞的生长抑制率，结果见附图1。

实施例3

分子对接分析γ-去氢骆驼蓬碱对胃癌相关靶点的结合作用：

本发明首先对民族药骆驼蓬的17个活性成分(包括γ-去氢骆驼蓬碱)进行配体前处理，最终筛选得到14个活性成分，将14个活性成分与akt1、tp53、jun、mapk1和egfr进行分子对接按照能量原则来实现受体与配体的相互作用，查找最佳结合模式；

选取原配体从活性口袋里分离并进行对接，计算对接之后的结合能(score)值，结合能(score)越低，表示配体与受体结合的构象就越稳定，发生的相互作用可能性就越大；结合能(score)≤-4.25kj/mol表示配体与受体具有一定结合活性，14个活性成分均与akt1、tp53、mapk1和egfr对接成功；

γ-去氢骆驼蓬碱和现有技术化合物去氢骆驼蓬碱分别与akt1、tp53、jun、mapk1和egfr等潜在疾病靶点进行分子对接，结果表明：γ-去氢骆驼蓬碱与akt1的氨基酸残基ala230形成稳定氢键，虽然去氢骆驼蓬碱与akt1的score＝-7.5，但没有结合在akt1蛋白的活性位点，没有和活性位点匹配；γ-去氢骆驼蓬碱与egfr的氨基酸残基met793之间形成稳定氢键；虽然去氢骆驼蓬碱与egfr的score＝-7.7，但没有结合在akt1蛋白的活性位点，并没有和活性位点匹配；去氢骆驼蓬碱和γ-去氢骆驼蓬碱均结合在jun蛋白的活性位点，并且有和活性位点有较好的匹配，去氢骆驼蓬碱结合在jun蛋白的活性位点，其碳与gln304之间形成芳香氢键；而γ-去氢骆驼蓬碱结合在jun蛋白的活性位点，其碳与lys309之间形成稳定氢键；两个化合物均结合在mpak1蛋白的活性位点，并且有和活性位点有较好的匹配；去氢骆驼蓬碱结合在mpak1蛋白的活性位点，其碳分别与lys54和gln105之间形成稳定氢键；而γ-去氢骆驼蓬碱结合在mpak1蛋白的活性位点，其碳分别与ser153和lys54形成稳定氢键，还有与asp的氨基酸残基形成芳香氢键；两个化合物均结合在tp53蛋白的活性位点，并且有和活性位点有较好的匹配；去氢骆驼蓬碱结合在tp53蛋白的活性位点，其碳与arg10分别形成pi-pi相互作用和稳定氢键；γ-去氢骆驼蓬碱结合在tp53蛋白的活性位点，其酚羟基与arg10稳定氢键，与asn17形成pi-pi相互作用；从分子对接图中可以看出：这两个活性成分与受体的氨基酸残基形成稳定氢键、芳香氢键和pi-pi相互作用，结合模式中可以看出来，稳定和芳香氢键以及π－π相互作用对小分子与蛋白的识别和稳定性起着关键作用。结果表明，γ-去氢骆驼蓬碱为一种胃癌高靶向结合活性的化合物，γ-去氢骆驼蓬碱作为天然产物中极少见的化合物，虽然分子量与现有技术化合物去氢骆驼蓬碱一致、结构相近，但可以通过与胃癌靶标活性部位形成更加稳定的结合而发挥更加显著的抗癌活性。