一种组合物用于制备基于调控CDKs和SMAD6基因抑制胃癌细胞增殖药物的用途的制作方法

本发明属于药物制剂
技术领域：
，具体涉及一种组合物用于制备基于调控cdk1、cdk6和smad6基因抑制胃癌细胞增殖药物的用途。
背景技术：
：据报道，全球胃癌(gastriccancer，gc)的每年发病率居第4、5位，每年死亡率在所有肿瘤占第2位。近年对于胃癌的诊治虽然有很大进步，但其5年生存率依然很低，作为一种高度恶性的肿瘤，gc具有无限制性细胞增殖、侵袭、转移等特性，属于预后较差的肿瘤病症，关注并重视胃癌治疗及其研究意义重大。目前，诸如胃癌等肿瘤的药物治疗面临两大难题，即非特异性毒副反应和多药耐药性，使得寻找高效、低毒的化疗药物具有非常重要的意义。目前，从中药中提取有效的抗癌药物已成为肿瘤药物治疗研究的一大热点，并取得了较大的发展。研究显示，gc的发生发展是一个复杂的过程，绝大多数胃癌发生过程遵循correa级联反应提出的胃癌发生模式：即正常胃黏膜-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-小肠型肠上皮化生-大肠型肠上皮化生-异型增生(中重度)-胃癌。胃癌的发生是一个多基因、多步骤、多阶段的发展过程，正常情况下，细胞的增殖与凋亡保持着动态平衡，平衡被破坏则会导致多种疾病的发生。有研究报道，gc的发生主要是就是胃粘膜上皮细胞增殖与凋亡的平衡状态被破坏的结果。细胞存活或死亡依靠生存和凋亡信号之间的平衡，这个平衡的维持涉及多种分子和基因。为了探究治疗胃癌药物的具体分子调控机制，研究人员对于细胞中细胞周期、增殖、凋亡、分化以及dna损伤修复等生物学过程进行了靶向研究，研究表明，抑癌基因主要是通过抑制胃癌细胞增殖发挥抗癌作用。研究表明，cdk1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)是g2期-m期过度的重要调节因子，据报道，cdk1可与周期蛋白b协同作用促进细胞进入减数分裂时期，cdk1在crc循环肿瘤细胞中表达上调，cdk1在促进g2-m期转变、调节g1进程以及g1期向s期转变中起到关键作用，研究表明cdk1表达水平上升与癌细胞增殖或癌症不良预后密切相关，而cdk1的高表达率预示着crc患者预后效果较差。因此，包括cdks在内的与细胞周期调控相关的分子已成为研究热点，被认为是多种癌症中潜在的预后和治疗标志物。细胞中cdks表达的改变往往会导致细胞异常增殖，以及相关基因或蛋白的功能障碍。通过上调cdk相关抑制因子，从而使cdk表达下调，进一步诱导细胞周期阻滞在g1期。此外，smad6基因被发现是多种人类癌症的重要调控因子，有报道称，smad6在rb组织和细胞中上调，smad6的下调显著抑制了rb细胞的增殖，smad6下调不仅抑制了细胞的迁移，而且延缓了emt过程。因此，基于cdk1、cdk6和smad6等从抑制胃癌细胞增殖方面调控抑癌功能的相关基因作为治疗胃癌药物直接或间接调控靶基因，进而开发新的治疗胃癌的药物，具有积极的意义。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种组合物用于制备基于调控cdk1、cdk6和smad6基因抑制胃癌细胞增殖药物的用途，进而开发更多潜在治疗胃癌的新的药物制剂。本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种可调控cdk1、cdk6和smad6基因抑制胃癌细胞增殖药物的药物制剂。为解决上述技术问题，本发明所述的一种组合物用于制备基于调控cdks和smad6基因抑制胃癌细胞增殖药物的用途，所述组合物包括芹菜素、白术内酯ⅲ、大黄酚、芦丁、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、小檗碱、人参皂苷f2、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、芍药内酯苷、巴马汀、紫云英苷、氢化松苓酸、肉桂酸、齐墩果酸、γ-松油烯、三七皂苷fe、氯化两面针碱、柚皮素、愈伤酸、科罗索酸或紫花前胡醇中的至少一种。更优的，所述组合物包括摩尔比为40：1：160：25：100的柠檬苦素、香蒲新苷、芦丁、小檗碱和人参皂苷。更优的，所述组合物包括摩尔比为1：250：5：5：5的氯化两面针碱、柚皮素、愈伤酸、科罗索酸和紫花前胡醇。更优的，所述组合物包括摩尔比为75：8：10：20：100的山奈酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、芍药内酯苷、巴马汀和紫云英苷。更优的，所述组合物包括摩尔比为2：2：3：125：100的氢化松苓酸、肉桂酸、齐墩果酸、γ-松油烯和三七皂苷fe。更优的，所述组合物包括摩尔比为4：10：1：3：8的芹菜素、白术内酯ⅲ、大黄酚、鞣花酸和槲皮素。具体的，所述cdks基因包括cdk1和cdk2。本发明还公开了一种基于调控cdks和smad6基因抑制胃癌细胞增殖药物的药物，所述药物的有效成分包括芹菜素、白术内酯ⅲ、大黄酚、芦丁、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、小檗碱、人参皂苷f2、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、芍药内酯苷、巴马汀、紫云英苷、氢化松苓酸、肉桂酸、齐墩果酸、γ-松油烯、三七皂苷fe、氯化两面针碱、柚皮素、愈伤酸、科罗索酸或紫花前胡醇中的至少一种。本发明还公开了一种治疗胃癌的药物，所述药物的有效成分包括芹菜素、白术内酯ⅲ、大黄酚、芦丁、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、小檗碱、人参皂苷f2、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、芍药内酯苷、巴马汀、紫云英苷、氢化松苓酸、肉桂酸、齐墩果酸、γ-松油烯、三七皂苷fe、氯化两面针碱、柚皮素、愈伤酸、科罗索酸或紫花前胡醇中的至少一种。本发明还公开了一种摩罗丹用于制备基于调控cdks和smad6基因抑制胃癌细胞增殖以治疗胃癌的药物制剂的用途。本发明基于中成药摩罗丹的指纹图谱分析，初步确定了摩罗丹中若干药物组分及其可能调控的靶标基因；通过转录组分析数据中表达量发生显著变化的基因中，挑选出cdk1、cdk6和smad6等细胞增殖抑癌相关的基因作为摩罗丹直接或间接调控靶基因，随后进一步通过摩罗丹细胞学实验探究进行高通量转录本分析(rnaseq)，进一步明确了摩罗丹中有效物质的作用靶点，最后通过荧光定量(qrt-pcr)的方法验证了摩罗丹中具有抑胃癌功能的有效物质，筛选出包括芹菜素、白术内酯ⅲ、大黄酚、芦丁、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、小檗碱、人参皂苷f2、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、芍药内酯苷、巴马汀、紫云英苷、氢化松苓酸、肉桂酸、齐墩果酸、γ-松油烯、三七皂苷fe、氯化两面针碱、柚皮素、愈伤酸、科罗索酸或紫花前胡醇在内的有效成分，进一步于胃上皮细胞体系中进行细胞学实验，从成分层面明晰了摩罗丹抑胃癌的有效成分，体外验证实验表明，这组物质能够抑制胃癌细胞的cdk1、cdk6和smad6等细胞增殖相关指标，为开发新的治疗胃癌药物提供理论支持。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因cdk1的定量检测结果；图2为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因cdk6的定量检测结果；图3为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因smad6的定量检测结果；图4为不同有效成分的药物组合对细胞增殖的影响；图5为不同单一有效成分对细胞增殖的影响。具体实施方式实施例1摩罗丹是由百合、茯苓、玄参、乌药、泽泻、麦冬、当归、白术、茵陈、白芍、石斛、九节菖蒲、川芎、三七、地榆、延胡索、蒲黄、鸡内金等18味药材组成的纯中药制剂，具有和胃健脾、通络定痛、健脾消胀的作用，可以显著减低cag患者egf和egfr的表达，临床实际使用效果颇佳。摩罗丹被中华医学会消化病学分会制定的《中国慢性胃炎共识意见》(2017)、中华中医药学会发布的《慢性胃炎中医专家诊疗共识意见》(2017)等推选为治疗慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎的首选推荐用药。针对探究摩罗丹中有效抑胃癌成分的问题，本发明通过文献研究和摩罗丹指纹图谱分析，初步确定了摩罗丹中若干药物组分及其可能调控的靶标基因；随后进一步通过摩罗丹细胞学实验探究进行高通量转录本分析(rnaseq)，进一步明确了摩罗丹中有效物质的作用靶点，最后通过荧光定量(qrt-pcr)的方法验证了摩罗丹中具有抑胃癌功能的有效物质。为探究摩罗丹抑癌的具体分子调控机制，本实施例对经摩罗丹处理的胃上皮细胞进行转录组分析。分析结果显示，摩罗丹主要影响了细胞中细胞周期、增殖、凋亡、分化以及dna损伤修复等生物学过程。本发明进一步从转录组分析数据中表达量发生显著变化的基因中，挑选出cdk1、cdk6和smad6等从抑制细胞增殖方面抑癌的相关基因作为摩罗丹直接或间接调控靶基因，初步筛选出摩罗丹中候选有效成分，通过细胞学以及分子学实验验证，鉴别出摩罗丹中能有效抑癌的药物成分。摩罗丹摩罗丹指纹图谱建立及所含天然药物组分鉴定通过使用代谢组学分析的方法，本发明前期对摩罗丹中所含有效天然药物组分进行了鉴定，通过数据库比对成功识别出220种化合物组分，这与文献挖掘结果较一致，部分化合物组分如下表1所示。表1摩罗丹化合物组分(部分)摩罗丹中药物组分调控生物功能富集分析将摩罗丹施加于胃上皮细胞培养基中，处理细胞24h后收集并进行转录组分析。通过富集分析，甄别出摩罗丹主要影响的生物学功能以及调控的靶基因功能。通过对文献中已报道的相关调控因子的分析，进一步对摩罗丹指纹图谱中药物组分进行识别，进一步精确摩罗丹中调控抑癌的有效组分。结合文献中关于药天然化合物的药效报道，以及综合考虑药品购买、施加等问题。本实施例从摩罗丹指纹图谱库筛选出25种化合物，进行细胞学实验(见下表2)。各种化合物细胞学实验施加浓度参考文献报道或进行ic50测定确立。表2摩罗丹潜在有效组分荧光定量验证摩罗丹中抑癌的有效物质通过对转录组分析结果分析，筛选出摩罗丹中抑癌相关的靶基因。通过设计对应各靶基因的特异性引物，对各摩罗丹中预测有效组分处理后的细胞转录本进行定量检测。在本实施例方案中，将摩罗丹中预测的各种有效组分，通过细胞凋亡检测实验以及文献挖掘，得各预测组分合适处理浓度。将上述预测的各有效组分分别溶于dmso中后，施加于培养于6孔板上的sgc-7901细胞培养基中，以dmso处理细胞作为阴性对照组。sgc-7901细胞在药物处理24小时后收集，并进行rna提取。提取rna的步骤如下：(1)倒掉细胞培养液，用pbs洗一遍，6孔板每孔加入1mltrizol，轻柔摇晃至液体覆盖整个表面，室温静置，每2分钟摇晃一次，然后移入1.5ml无rna酶ep管中；(2)rna分离，加200ul氯仿(总体积1/5)，用手剧烈震荡，室温静置；(3)于4℃、12000rpm，离心10-15min(平衡放入，提前打开离心机预冷)，离心后体系分层，上层：rna(无色)，中层：蛋白质，下层：酚-氯仿相；(4)取上层液相至1.5ml无rna酶ep管中(冰上预冷)，加入500ul异丙醇，轻柔摇晃混匀，室温静置，4℃、12000rpm，离心10-15min，得到rna粗提沉淀；(5)弃上清，加入1ml75％乙醇，用手剧烈震荡悬浮沉淀，2-8℃、7500rpm，离心5-10min，用移液器或者真空泵抽走上清；(6)将ep管倒置空气中5-10分钟(或者用枪头吸走全部上清)，干燥rna沉淀，(不能在真空中离心干燥)，注意不能将rna沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度；(7)用无rnase水重悬rna沉淀，用枪头反复吹打几次，室温静置，测浓度后-20℃保存。测量rna浓度的步骤如下：每个样本取1ul，利用微量紫外分光光度计测量每个rna样品的浓度，根据浓度，计算出需要反转录的rna总量。利用全式金反转录试剂盒，进行反转录。cdna的合成：根据上一步得出的各组浓度计算反转录体系的所需的体积，我们一般定量20ul的反转录体系中含有5mg总rna。配置好反转录体系后，将反转录管放入金属浴中进行反转录，设置程序为42℃，15min，85℃，5s，运行完成后在4℃保存。realtimepcr检测mrna的表达：将反转录好的cdna取出置于冰上，同时配置20μl实时定量pcr体系：2×quantitectsybrgreenpcrmastermix10μl，forwardprimer0.8μl，reverseprimer0.8μl，模版cdna2μl，rnase-freewater6.4μl。各基因序列如下表3所示。配置好反应体系后上机cfx96进行mrna表达检测，反应程序为95℃，15s；60℃，30s；72℃，30s共进行40个这样的循环。运行完毕后分析ct值并查看熔解曲线。qrt-pcr定量检测靶基因源于rnaseq分析结果，这些基因分别参与细胞增殖、细胞凋亡以及分化、免疫反应，炎症反应等生物学过程。表3qrt-pcr的引物序列nameforwardprimer(5’-3’)reverseprimer(5’-3’)p53cgggttgtcgcccttttctaggcagcccccaaccactgf-βatggagagaggactgcggattagtgttccccactggtccccdk1ctttctttcgcgctctagccaatcgggtagcccgtagactcdk6ctgcagggaaagaaaagtgcaatgagcgaagtcctcaacacagac实施例2摩罗丹抑癌功能的物质鉴定本实施例中，从转录组分析数据中表达量发生显著变化的基因中，将cdk1、cdk6和smad6等基因转录本的变化作为从抑制细胞增殖方面调控抑癌的标志基因。采用sgc-7901细胞株(由本室冻存保藏，购买于atcc细胞库细胞库)作为药品处理对象，该细胞具有繁殖迅速，易于培养等特点。将培养的sgc-7901细胞接种于6孔板上(每孔培养50w个细胞)，使用dmem(10％fbs)培养基培养至全部贴壁。将上述筛选的摩罗丹候选有效组分使用dmso溶解后，分别施加于sgc-7901细胞培养液中，孵育24h后收集处理后的细胞。按照前述实施例1中处理步骤提取rna后进行反转录，使用待检测基因特异性引物进行qrt-pcr检测。上述筛选的摩罗丹潜在有效组分分别针对于cdk1、cdk6和smad6抑癌靶基因的定量检测结果分别见表1-3所示。实验结果表明，摩罗丹中含有多种物质对细胞增殖相关的信号分子具有调控作用。例如芹菜素、白术内酯ⅲ、大黄酚、芦丁、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、小檗碱(黄连素)、人参皂苷f2、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异槲皮苷、芍药内酯苷、巴马汀、紫云英苷、氢化松苓酸、肉桂酸、齐墩果酸、γ-松油烯、三七皂苷fe、氯化两面针碱、柚皮素、愈伤酸、科罗索酸、紫花前胡醇等组分处理细胞后可显著地抑制cdk1、cdk6和smad6的表达。可见，摩罗丹中所含有成分可以从抑制胃癌细胞增殖等方面发挥抑癌作用，并为新的潜在治疗胃癌的药物开发提供理论基础。实施例3本实施例中，分别选择不同的有效物质，按照不同的摩尔比例的组合，验证不同组合方式下抑制胃癌细胞增殖的优势。采用cck-8实验检测细胞增殖，将sgc-7901细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板，按照以下的组合方式进行加药处理，具体的加入量如下表4所示：第一组：柠檬苦素：香蒲新苷：芦丁：小檗碱：人参皂苷f2＝40：1：160：25：100；第二组：氯化两面针碱：柚皮素：愈伤酸：科罗索酸：紫花前胡醇＝1：250：5：5：5；第三组：山奈酚-3-o-芸香糖苷：异槲皮苷：芍药内酯苷：巴马汀：紫云英苷＝75：8：10：20：100；第四组：芹菜素：白术内酯ⅲ：大黄酚：鞣花酸：槲皮素＝4：10：1：3：8；第五组：氢化松苓酸：肉桂酸：齐墩果酸：γ-松油烯：三七皂苷fe＝2：2：3：125：100。表4各实验组加入剂量加药处理培养24h时，每孔加入含10％的cck-8反应液的培养液100μl，反应3h后，在450nm处检测实验孔的od值。细胞存活率(％加热)＝[(实验孔od值－空白孔od值)/(对照孔od值－空白孔od值)]×100％。每一组设3个平行孔。实验结果如图4所示，说明上述各组中有效成分的组合下，均可以明显抑制细胞的增殖。实施例4本实施例中，分别选择不同的有效物质，分别以一定的摩尔浓度处理sgc-7901细胞，验证不同有效物质抑制胃癌细胞增殖的情况。采用cck-8实验检测细胞增殖，将sgc-7901细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板，按照下表4中摩尔浓度进行加药处理，加药处理培养24h时，每孔加入含10％的cck-8反应液的培养液100μl，反应3h后，在450nm处检测实验孔的od值。细胞存活率(％加热)＝[(实验孔od值－空白孔od值)/(对照孔od值－空白孔od值)]×100％。每一组设3个平行孔。实验结果如图5所示，实验结果量化之后如下表5所示，说明上述各组中有效成分的组合下，均可以明显抑制细胞的增殖。表5不同有效物质的加药情况可见，本发明筛选的有效物质均具有较好的抑制胃癌细胞增殖的功效，而经选定配比下的组合物则具有更优的效果。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12