一种促腱骨愈合的复合电纺膜及其制备方法与应用

本发明涉及生物医学材料领域，特别是涉及一种促腱骨愈合的复合电纺膜及其制备方法与应用。

背景技术：

常见的肌腱、韧带损伤包括前交叉韧带(anteriorcruciateligament，acl)、跟腱(achillestendon，at)、肩袖(rotatorcuff，rc)等损伤。acl是膝关节重要的前向稳定结构，断裂后可以产生明显的膝关节不稳，严重影响膝关节功能，如果不及时治疗，关节出现反复扭伤，容易引起关节软骨、半月板等重要结构的损害，导致关节过早老化和骨关节病的发生。

肌腱、韧带的损伤通常会涉及腱骨连接点，而腱骨连接点的愈合时间和愈合效果是影响肌腱、韧带手术修复重建的关键因素。

美国每年大约有10～15万例需接受acl重建手术以恢复正常结构和功能。重建手术虽然恢复了acl的解剖结构，但术后仍有0.7％～10％的病人会出现关节不稳定乃至接受二次手术。随着国民生活水平的不断提高，运动损伤、交通事故等导致的前交叉韧带损伤呈快速增长且年轻化趋势。前交叉韧带受伤以后，一般是采用自体，异体或人工移植物重建修复。

然而，目前临床重建前交叉韧带过程中还是缺乏可有效地促进移植物与骨隧道之间的融合的植入材料和技术手段。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是提供一种促腱骨愈合的复合电纺膜及其制备方法与应用，能够用于前交叉韧带等肌腱、韧带损伤的重建修复。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

提供一种复合电纺膜，包括可降解高分子材料和钙磷陶瓷颗粒，所述钙磷陶瓷颗粒均匀分散或呈浓度梯度分散在可降解高分子材料中。

本发明复合电纺膜以可降解高分子材料为基质，通过静电纺丝法制备，使得基质结构与细胞外基质的形态结构相似，具有极大的比表面积和高孔隙率，适于构建良好的细胞微环境。基质中的钙磷陶瓷颗粒含量可调节，可根据需求制备钙磷陶瓷均匀分散或呈浓度梯度分散的电纺膜，使其具有不同程度的骨诱导能力，进行针对性治疗。

进一步地，所述复合电纺膜中，包括如下重量百分比组分：钙磷陶瓷颗粒1％～65％，可降解高分子材料35％～99％。

进一步地，包括如下重量百分比组分：钙磷陶瓷颗粒10％～65％，可降解高分子材料35％～90％。

进一步地，包括如下重量百分比组分：钙磷陶瓷颗粒10％～55％，可降解高分子材料45～90％。

更进一步地，包括如下重量百分比组分：钙磷陶瓷颗粒10％～45％，可降解高分子材料55％～90％。

在本发明的一个具体实施方式中，所述钙磷陶瓷颗粒在复合电纺膜厚度方向的浓度呈梯度式变化。

进一步地，所述钙磷陶瓷颗粒的含量在复合电纺膜厚度方向呈2～5个以梯度式变化的浓度。

在本发明的一个具体实施方式中，所述钙磷陶瓷颗粒的含量在复合电纺膜厚度方向呈3个以梯度式变化的浓度。

进一步地，第一层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为0％～45％，第二层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为10％～50％，第三层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为30％～55％；优选为第一层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为0％～20％，第二层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为10％～30％，第三层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为30％～50％。

在本发明的具体实施方式中，第一层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为0％，第二层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为20％，第三层中钙磷陶瓷颗粒的质量含量为40％。

在本发明的具体实施方式中，所述钙磷陶瓷选自羟基磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙中的一种或几种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述钙磷陶瓷为羟基磷灰石。

进一步地，所述钙磷陶瓷颗粒的粒径为50nm～100μm。

进一步地，所述钙磷陶瓷颗粒的粒径为100nm～50μm。

在本发明的具体实施方式中，所述钙磷陶瓷颗粒的粒径为100nm～10μm。

在本发明的一个具体实施方式中，所述钙磷陶瓷颗粒的粒径为2μm～10μm。

进一步地，所述可降解高分子材料选自聚乳酸pla、丙交酯-己内酯共聚物plcl、聚羟基乙酸pga、聚丁二酸丁二醇酯pbs、聚β-羟基丁酸酯phb中的一种或几种。

在本发明的具体实施方式中，所述可降解高分子材料选自pla和/或plcl。

本发明还提供了上述复合电纺膜的制备方法，包括如下内容：将可降解高分子材料、有机溶剂、钙磷陶瓷颗粒混合得纺丝液，用纺丝液进行静电纺丝。

本发明将钙磷陶瓷颗粒均匀分散在可降解高分子溶液中，形成稳定且具有可纺性的复合纺丝液，通过静电纺丝即可得到本发明优异的促腱骨愈合的复合电纺膜材料，制备方法简单，利于大规模工业化生产。

进一步地，包括如下内容：

(1)将可降解高分子材料与有机溶剂混合，得溶液a；

(2)将钙磷陶瓷颗粒与步骤(1)的溶液a混合，得纺丝液；

(3)用步骤(2)得到的纺丝液进行静电纺丝。

进一步地，所述有机溶剂选自六氟异丙醇、二氯甲烷、丙酮、二甲基甲酰胺中的一种或几种，优选六氟异丙醇和/或二氯甲烷。

进一步地，静电纺丝参数为：滚筒转速300～800r/min，注射泵推进速度1～4ml/h，温度10～35℃，湿度30～80％，接收距离5～25cm，电压10～20kv。

进一步地，静电纺丝参数为：滚筒转速500～600r/min，注射泵推进速度2～3ml/h，温度20～30℃，湿度60～70％，接收距离10～20cm，电压10～15kv。

更进一步地，静电纺丝参数为：滚筒转速500～600r/min，注射泵推进速度2.4～3ml/h，温度25℃，湿度60～65％，接收距离13～15cm，电压12～14kv。

本发明还提供了上述复合电纺膜在制备组织修复材料中的应用。

所述组织修复材料，是指用以修复和/或替代机体中发生病变或者损伤的组织，恢复或部分恢复原有组织形态和功能的材料，例如可以是组织工程支架等材料。

进一步地，所述组织修复材料为刺激或诱导肌腱、韧带与骨组织界面形成新生组织的材料。

进一步地，所述组织修复材料为促进腱骨愈合的材料。

本发明还提供了一种韧带移植物，包括韧带和本发明复合电纺膜，所述复合电纺膜包覆在韧带表面；所述韧带选自自体韧带、异体韧带或人工韧带。

所述复合电纺膜包覆在韧带表面，其中，复合电纺膜可以是韧带局部位置的外表面。

进一步地，所述复合电纺膜包覆在韧带的骨道段或固定在韧带与骨组织之间。

将复合电纺膜包覆在韧带的骨道段，使韧带移植物形成了在骨道和关节腔不同区段具有不同特性的移植物，用于前交叉韧带等肌腱、韧带损伤的重建修复，可缩短腱骨愈合时间、增强腱骨愈合程度，提高临床治疗效果。

本发明的有益效果是：

(1)本发明复合电纺膜在可降解高分子中负载钙磷陶瓷，钙磷陶瓷含量均匀或含量梯度分布，可以根据韧带移植物和韧带修复重建手术的具体情况选择适宜的材料体系和负载浓度，可满足韧带修复重建中腱骨愈合应用的不同需求。

(2)本发明复合电纺膜可根据患者的关节腔和骨道尺寸进行修剪，包覆于自体或人工韧带移植物表面，并经适当编织后构建具有骨道和关节腔不同区段性特征的韧带移植物，可实现个性化精准治疗。

(3)本发明复合电纺膜中的钙磷陶瓷颗粒浓度呈梯度分布时，治疗效果优于均一浓度的材料，说明本发明浓度梯度分布的电纺膜具有更好的骨诱导能力，针对性更强，更有利于促进腱骨愈合、提高腱骨愈合效果。

附图说明

图1是本发明复合电纺膜的sem图；

图2是本发明复合电纺膜应用于韧带单束重建的示意图；

图3是本发明复合电纺膜应用于韧带双束重建的示意图；

图4是本发明复合电纺膜修复髌韧带撕裂腱骨损伤术后1个月韧带力学拉伸测试图，(a)、(b)、(c)分别为空白对照组、plcl电纺膜，负载梯度ha的plcl复合电纺膜的应力-应变曲线图像；

图5是本发明复合电纺膜细胞实验培养1天后激光共聚焦测试图，(a)、(b)、(c)分别为20％ha复合电纺膜，40％ha复合电纺膜，三层梯度浓度复合电纺膜培养1天后的激光共聚焦图像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1本发明具有均匀陶瓷含量的可降解高分子复合电纺膜

(1)称取适量聚乳酸(pla)加入六氟异丙醇溶液，然后在37℃条件下均匀搅拌1h，形成浓度为18％的均匀溶液；

(2)在上述高分子溶液中加入粒径100nm的羟基磷灰石粉体，添加量为使最终得到的电纺膜中羟基磷灰石质量分数为10％，在37℃条件下搅拌1h。

(3)将步骤(2)得到的羟基磷灰石/pla纺丝液放进纺丝机的推进泵中，滚筒转速500r/min，注射泵推进速度2.4ml/h，温度25℃，湿度65％，接收距离15cm，电压12kv的条件下开始纺丝。纺丝完成后，在滚筒锡箔纸上接收到具有一定宽度的负载羟基磷灰石的电纺膜初品。

(4)将步骤(3)中得到的电纺膜初品放到37℃真空干燥箱中烘干24h得到羟基磷灰石含量均匀的pla电纺膜。

实施例2本发明具有均匀陶瓷含量的可降解高分子复合电纺膜

(1)称取适量聚乳酸(pla)加入六氟异丙醇溶液，然后在37℃条件下均匀搅拌1h，形成浓度为22％的均匀溶液；

(2)在上述高分子溶液中加入粒径100nm的羟基磷灰石粉体，添加量为使最终得到的电纺膜中羟基磷灰石质量分数为45％，在37℃条件下搅拌1h。

(3)将步骤(2)得到的羟基磷灰石/pla纺丝液放进纺丝机的推进泵中，滚筒转速600r/min，注射泵推进速度3ml/h，温度25℃，湿度60％，接收距离13cm，电压14kv的条件下开始纺丝。纺丝完成后，在滚筒锡箔纸上接收到具有一定宽度的负载羟基磷灰石的电纺膜初品。

(4)将步骤(3)中得到的电纺膜初品放到37℃真空干燥箱中烘干24h得到羟基磷灰石含量均匀的pla电纺膜。

实施例3本发明具有可降解高分子电纺膜

(1)称取适量plcl加入六氟异丙醇溶液，然后在37℃条件下均匀搅拌1h，形成浓度为26％的均匀溶液；

(2)将步骤(1)得到的plcl纺丝液放进纺丝机的推进泵中，滚筒转速500r/min，注射泵推进速度2.4ml/h，温度25℃，湿度65％，接收距离15cm，电压12kv的条件下开始纺丝。纺丝完成后，在滚筒锡箔纸上接收到具有一定宽度的电纺膜初品。

(3)将步骤(2)中得到的电纺膜初品放到37℃真空干燥箱中烘干24h得到plcl电纺膜。

(4)步骤(3)得到的plcl电纺膜的sem图如图1(a)所示。

实施例4本发明具有均匀陶瓷含量的可降解高分子复合电纺膜

(1)称取适量plcl加入六氟异丙醇溶液，然后在37℃条件下均匀搅拌1h，形成浓度为26％的均匀溶液；

(2)在上述高分子溶液中加入粒径100nm的羟基磷灰石粉体，添加量为使最终得到的电纺膜中羟基磷灰石质量分数为20％，在37℃条件下搅拌1h。

(3)将步骤(2)得到的羟基磷灰石/plcl纺丝液放进纺丝机的推进泵中，滚筒转速500r/min，注射泵推进速度2.4ml/h，温度25℃，湿度65％，接收距离15cm，电压12kv的条件下开始纺丝。纺丝完成后，在滚筒锡箔纸上接收到具有一定宽度的负载羟基磷灰石的电纺膜初品。

(4)将步骤(3)中得到的电纺膜初品放到37℃真空干燥箱中烘干24h得到羟基磷灰石含量均匀的plcl电纺膜。

(5)步骤(4)中得到的羟基磷灰石含量均匀的plcl电纺膜的sem图如图1(c)所示。

实施例5本发明具有均匀陶瓷含量的可降解高分子复合电纺膜

(1)称取适量plcl加入六氟异丙醇溶液，然后在37℃条件下均匀搅拌1h，形成浓度为26％的均匀溶液；

(2)在上述高分子溶液中加入粒径100nm的羟基磷灰石粉体，添加量为使最终得到的电纺膜中羟基磷灰石质量分数为40％，在37℃条件下搅拌1h。

(3)将步骤(2)得到的羟基磷灰石/plcl纺丝液放进纺丝机的推进泵中，滚筒转速500r/min，注射泵推进速度2.4ml/h，温度25℃，湿度65％，接收距离15cm，电压12kv的条件下开始纺丝。纺丝完成后，在滚筒锡箔纸上接收到具有一定宽度的负载羟基磷灰石的电纺膜初品。

(4)将步骤(3)中得到的电纺膜初品放到37℃真空干燥箱中烘干24h得到羟基磷灰石含量均匀的plcl电纺膜。

(5)步骤(4)中得到的羟基磷灰石含量均匀的plcl电纺膜的sem图如图1(b)所示。

实施例6本发明具有陶瓷含量梯度的可降解高分子复合电纺膜

(1)准确称取适量plcl加入六氟异丙醇，在37℃水浴锅中均匀搅拌1h，配制成浓度为26％的均匀溶液，标记为纺丝液1；

(2)准确称取适量plcl加入六氟异丙醇，在37℃水浴锅中均匀搅拌1h，配制成浓度为26％的均匀溶液；称取并加入适量粒径2μm的羟基磷灰石颗粒(添加量为使最终得到的电纺膜层中羟基磷灰石质量分数为20％)，在37℃水浴锅中搅拌1h获得纺丝液2；

(3)准确称取适量plcl加入六氟异丙醇，在37℃水浴锅中均匀搅拌1h，配制成浓度为26％的均匀溶液；称取并加入适量粒径10μm的羟基磷灰石颗粒(添加量为使最终得到的电纺膜层中羟基磷灰石质量分数为40％)，在37℃水浴锅中搅拌1h获得纺丝液3；

(5)将步骤(1)中得到的plcl纺丝液1放进纺丝机的推进泵中，滚筒转速600r/min，注射泵推进速度2.4ml/h，温度25℃，湿度65％，接收距离14cm，电压13kv的条件下开始纺丝；纺丝机推进泵中的纺丝液1即将消耗完时，将步骤(2)中得到的纺丝液2补充至推进泵中，纺丝参数不变；纺丝机推进泵中的纺丝液2即将消耗完时，将步骤(3)中得到的纺丝液3补充至推进泵中，纺丝参数不变；纺丝完成后，在滚筒锡箔纸上接收到具有一定宽度的并负载梯度ha含量的复合电纺膜。

(6)将步骤(5)中得到的电纺膜放到37℃真空干燥机中烘干24h。

(7)步骤(6)中得到的负载梯度ha含量的复合电纺膜的sem图如图(1)(d)所示。

实施例7本发明复合电纺膜在韧带单束重建中的应用

(1)针对采用自体韧带或人工韧带等韧带移植物进行前交叉韧带单束重建；

(2)根据临床实际情况，按照关节腔和骨道的长度将本发明复合电纺膜裁剪成一定尺寸大小；

(3)将裁剪好的复合电纺膜包覆在韧带移植物(如lars韧带)的骨道段，并进行适当的编织固定，形成具有骨道和关节腔不同区段特性的复合韧带移植物，如图2所示；

(4)按照常规前交叉韧带重建修复方式植入上述移植物，即可。

实施例8本发明复合电纺膜在韧带双束重建中的应用

(1)针对采用自体韧带或人工韧带等韧带移植物进行前交叉韧带双束重建；

(2)根据临床实际情况，按照关节腔和骨道的长度将本发明复合纺膜裁剪成一定尺寸大小；

(3)将裁剪好的复合电纺膜包覆在韧带移植物(如plcl人工韧带)的中段以及两端，并进行适当的编织，形成具有骨道和关节腔不同区段特性的韧带移植物，如图3所示；

(4)按照常规前交叉韧带重建修复方式植入上述移植物，即可。

以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：

实验例1本发明复合电纺膜用于髌韧带撕裂腱骨损伤

1、实验方法

取实施例6制备的复合电纺膜，以新西兰大白兔为实验动物建立膝关节髌韧带撕裂腱骨损伤模型，其中对照组在腱骨界面加入plcl电纺膜，实验组在腱骨界面加入负载梯度ha含量的复合电纺膜，空白对照组不植入任何材料，其余操作保持一致。膝关节髌韧带撕裂腱骨损伤模型：沿胫骨粗隆往上做一个约5mm*2.5mm的韧带损伤创口，暴露皮质骨后用锉刀打磨造成腱骨损伤模型，随后在腱骨损伤部位植入电纺膜，再将其与髌韧带共同缝合固定于骨膜上。冲洗手术区后逐层闭合切口，术后常规抗炎，自由活动，单笼饲养。在整个观察期内植入部位无明显炎症反应，兔子活动度良好。进一步处死动物取材，进行生物力学分析，考察复合电纺膜促进腱骨愈合的作用。

2、实验结果

实验结果如图4所示，空白组、对照组和实验组的断裂伸长率分别为22.2％、25.4％和29.8％，最大力学强度分别为63mpa、92mpa和110mpa；与空白组和对照组相比，实验组分别高出47mpa和18mpa，有显著性差异，说明实验组的腱骨愈合程度高于对照组和空白组，在腱骨愈合初期具有一定的促进作用。

实验结果说明，采用本发明方法制备的复合电纺膜植入体内后，天然高分子或其衍生物在体内逐渐降解吸收，羟基磷灰石颗粒与新生骨组织及自体骨组织融为一体，腱与骨之间是由腱组织、非钙化纤维软骨层、钙化纤维软骨层和骨组织四层结构紧密连接，不同羟基磷灰石含量梯度逐层过渡，促进了腱骨早期愈合从而实现早期固定，有效的促进了腱骨愈合的时间和程度，实验效果良好。

实验例2本发明复合电纺膜的细胞效果实验

将实施例4制备的20％ha复合电纺膜、实施例5制备的40％ha复合电纺膜以及实施例6制备的三层梯度浓度复合电纺膜分别用如下方法进行细胞实验，比较效果：

(1)将本发明复合电纺膜进行伽马射线照射灭菌处理；

(2)将每种复合电纺膜分为1，2，3组，每组3个平行样，放置在细胞孔板中；

(3)将mc3t3-e1细胞按5×10⁴/cm²的密度加入到上述每个平行样表面，每孔200μl，加完细胞后将1，2，3组样品放入37℃培养箱内分别静置孵育1，4，7天、每隔48h换一次液。

(4)将步骤(3)内达到孵育时间的孔板拿出，吸掉孔板内的上清液；

(5)将细胞质染色试剂fda和细胞核染色试剂pi按照体积2:1进行混合，并加入1mlpbs缓冲液进行稀释；

(6)将步骤(5)中配好的染色剂按照333μl/孔加入到每个样品表面，静置3min；

(7)将步骤(6)中染好的样品进行激光共聚焦的拍摄分析，可以考察细胞在可降解高分子电纺膜上面的粘附与增殖情况。

实验结果如图5所示，三层陶瓷含量梯度分布的复合电纺膜的细胞粘附好，增殖情况最好(c)，优于均一浓度的复合电纺膜的细胞实验效果，说明细胞在陶瓷含量梯度分布的可降解高分子电纺膜上能够很好的粘附与增殖，同时也可以反应出本发明具有梯度浓度的复合电纺膜的生物相容性良好。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。