甘氨脱氧胆酸在制备治疗肝内胆汁淤积药物中的应用及其药物组合物

1.本发明属于化合物的医药用途技术领域，具体涉及甘氨脱氧胆酸在胆汁淤积疾病领域的用途及其组合物。


背景技术：

2.妊娠期肝内胆汁淤积(intrahepatic cholestasis of pregnancy,icp)是妊娠中晚期特有的一种并发症，临床上以皮肤瘙痒和胆汁酸升高为主要特征，可明显增加围产期不良事件如胎儿窘迫、早产、胎儿突然死亡等风险，对女性的生殖健康造成极大的危害。目前，icp发生的病因及机制仍不清楚。正因为此，对于icp的治疗更多的是对症治疗及经验性治疗。目前，临床一线治疗药物是熊去氧胆酸(udca)，udca由肠道菌群代谢产生，是目前icp治疗的最常用药物，可有效地缓解孕妇瘙痒和保护肝功能障碍，但是有大样本人群研究表明udca在降低血清胆汁酸及减少胎儿围产期不良事件方面的保护作用并不明显，因此udca治疗icp的应用也出现了较大的争议。
3.肠道菌群已成为近年来研究的一大热点，在炎症、代谢综合征、内分泌及生殖等多种生理及病理调控中均发挥重要作用。国内学者的研究发现，女性多囊卵巢综合征患者的肠道菌群明显失调，将多囊卵巢患者的粪菌移植小鼠可导致小鼠卵巢功能失调，进一步发现肠道菌群可通过调控胆汁酸代谢及免疫功能的紊乱而促进女性多囊卵巢综合症的发生；先兆子痫的孕妇肠道菌群失调，可通过扰乱t细胞稳态及破坏肠屏障而增加细菌向胎盘移位，促进子痫的发生，并且先兆子痫孕妇的粪菌移植小鼠可导致小鼠出现子痫前期的表型，提示肠道菌群在女性生殖系统疾病中的调控作用越来越受到关注及重视。
4.饮食、宿主的遗传背景及免疫系统等多种因素与肠道菌群结构重塑及改变密切相关。而在女性妊娠期，机体会经受激素、代谢及免疫调节等系列改变，对肠道菌群的稳态产生巨大影响。正常孕妇在孕期的不同阶段肠道菌群组成有显著的改变，并且正常孕妇与普通女性的肠道菌群组成及结构亦存在明显差异。有研究已证实，若妊娠期肠道菌群发生紊乱，可导致妊娠期糖尿病、妊娠高血压及先兆子痫等妊娠相关疾病的发生。本技术的发明人前期选取年龄、孕周等匹配的正常孕妇及icp患者人群，取粪便分别进行16s rrna 测序分析，结果发现icp患者肠道菌群的α多样性明显降低，并且两组人群肠道菌群的组成亦具有明显差异，icp患者肠道内拟杆菌属(bacteroides)明显增多。进一步深入研究发现，肠道菌群可参与调控特定胆汁酸的代谢进而影响法尼醇x受体(farnesoid x receptor,fxr)功能作用，从而促进icp的发生，而通过研究发现并证实，甘氨脱氧胆酸(gdca)是一种新型的fxr 激动剂，可靶向并激动fxr信号从而有效防治icp，为临床icp的预防及治疗提供了一种新型干预手段。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明目的之一在于提供甘氨脱氧胆酸的用途。
6.其技术方案如下：
7.甘氨脱氧胆酸或其立体异构体或其衍生物在制备用于预防和/或治疗人或哺乳动物肝内胆汁淤积的药物中的应用。
8.作为优选，甘氨脱氧胆酸的衍生物或为其在药学上可接受的盐，或为其在药学上可接受的酯。
9.作为优选，上述肝内胆汁淤积至少部分由人或哺乳动物体内法尼醇x受体(fxr)下游信号抑制引起。
10.作为优选，上述fxr下游信号抑制是由人或哺乳动物肠道内拟杆菌丰度升高引起的。
11.作为优选，上述药物用于预防和/或治疗人或哺乳动物妊娠期肝内胆汁淤积。
12.本发明发明 的目的之二在于提供甘氨脱氧胆酸的另一种用途。其技术方案为：
13.甘氨脱氧胆酸或其立体异构体或其衍生物在制备作为人或哺乳动物体内 fxr激动剂的药物中的应用。
14.本发明发明 的目的之三在于提供一种药物组合物。其技术方案为：
15.一种药物组合物，其关键在于包括甘氨脱氧胆酸，或其在药学上可接受的盐，或其在药学上可接受的酯，或其立体异构体。
16.作为优选，上述药物组合物还包括在药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂，以及不可避免的杂质。
17.作为优选，上述药物为片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。
附图说明
18.图1为icp患者(icp)与正常孕妇人群(control)粪便菌群多样性及组成差异，其中：(a)α多样性；(b)β多样性分析；(c)菌群组成；(d)lefse 分析。
19.图2为icp患者及正常孕妇粪菌移植孕鼠，血清胆汁酸、肝转氨酶及胎儿损害情况，其中：(a)血清胆汁酸；(b～d)肝转氨酶ast、alt、alp 等生化指标；(e)胎儿表现；(f)胎鼠体重；两组分别为icp患者粪菌移植孕鼠组(i-fmt)和正常孕妇粪菌移植孕鼠组(h-fmt)。
20.图3为kegg分析icp患者及正常孕妇粪菌差异的代谢通路；
21.图4为靶向代谢组学分析icp患者(icp)与正常对照孕妇(control)胆汁酸组成差异，其中：(a)粪便胆汁酸水平；(b)血清胆汁酸水平；
**
p《0.01。
22.图5为icp患者肠道拟杆菌属丰度与胆汁酸水平相关性分析。
23.图6为gdca对拟杆菌移植后小鼠胆汁淤积及fxr信号的改变，其中：(a)血清胆汁酸水平；(b、c)肝转氨酶alt、ast等生化指标水平；(d) 胎鼠表现及胎鼠体重；(e～f)qpcr检测fxr及shp的表达；各组分别为灭活拟杆菌移植孕鼠组(control)，拟杆菌移植孕鼠组(b.fragilis)，拟杆菌移植且给予gdca灌胃孕鼠组(b.fragilis+gdca)；
*
p《0.05；
**
p《0.01；ns,nosignificance。
24.图7为gdca与fxr信号的调控研究，其中：(a、b)docking分析预测gdca与fxr的结构关系及结合作用；(c)gdca与caco2细胞孵育后， qpcr检测下游基因shp的表达情况结果，dmso作为空白对照，鹅去氧胆酸(cdca)作为阳性对照激动剂；
**
p《0.01。
25.图8为tr-fret fxr共活化分析检测cdca、gdca、gudca等几种胆汁酸对fxr的激动
作用，以520nm与495nm荧光发射强度比作为检测指标。
26.图9为细胞实验研究gdca对fxr下游基因fgf19和shp的mrna表达的作用，同时研究fxr拮抗剂gudca和t-βmca对上述作用的影响。
27.图10为拟杆菌移植孕鼠以及同时给予gdca灌胃孕鼠的肠道组织fxr 下游基因fgf15和shp的表达情况；各组分别为灭活拟杆菌移植孕鼠组 (control)，拟杆菌移植孕鼠组(b.fragilis)，拟杆菌移植且给予gdca灌胃孕鼠组(bf+gdca)。
28.图11为ee2注射造模icp小鼠以及同时给予gdca灌胃小鼠的胆汁淤积症状对比，其中：(a)实验过程示意图；(b)胆汁酸、alt、ast、alp、 ggt、肝指数水平；(c)肝脏组织切片he染色照片；各组分别为正常小鼠组(control)，ee2注射造模icp小鼠组(ee2)，ee2注射造模且给予gdca 灌胃小鼠组(ee2+gdca)。
29.图12为ee2注射造模icp小鼠以及同时给予gdca灌胃小鼠与胆汁酸代谢相关基因表达情况，其中：(a)肠道内fxr下游基因fgf15、shp基因表达情况；(b)肝脏内fxr下游基因shp、ntcp基因表达情况；(c)cyp7a1、 cyp8b1、cyp27a1等胆汁酸合成基因以及bsep、mrp2等胆汁酸排泌基因表达情况；各组分别为正常小鼠组(control)，ee2注射造模icp小鼠组(ee2)， ee2注射造模且给予gdca灌胃小鼠组(ee2+gdca)。
具体实施方式
30.以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
31.实施例一
32.1.icp患者及正常孕妇肠道菌群特征分析
33.1.1宏基因组分析icp患者与对照人群肠道菌群差异
34.实验材料及方法
35.(1)收集100例icp患者及100例正常对照孕妇粪便、血清样本，扩大样本量并建立完善的样本库及随访数据库，分别取两组人群粪便，溶于甘油溶液，-80℃保存；
36.(2)利用粪便dna提取试剂盒(minkagene stool dna kit)，按试剂盒操作步骤提取粪便：取0.2g左右粪便至2ml离心管，加入裂解缓冲液进行高温裂解，离心悬液，取上清至新的离心管加入蛋白酶k于70℃消化10分钟，加入乙醇溶剂后过dna结合柱，重复洗涤两次后，dna沉淀加入eb缓冲液溶解，-20℃保存备用；
37.(3)dna送北京诺禾致源生物技术公司基于illumina hiseq 2500平台进行测序分析；
38.(4)得到原始测序数据后，首先去除污染和接头序列，根据人类基因组参考序列，去除宿主基因；将去除污染及宿主基因的高质量数据进一步通过 spades组装；组装完成后，用metagene预测orf；将预测出来的orf序列，使用cd-hi t软件，进行聚类，每个类取最长的orf序列作为代表序列，构建非冗余基因序列集合；得到非冗余基因集后，可以将clean reads比对到非冗余基因集上，计算每个基因在各样品中的丰度；得到基因丰度表后，利用 kegg、go、cog等软件对基因进行功能比对注释；利用metaphlan进行物种丰度分析；根据基因丰度分别进行α及β多样性分析；
39.(5)根据测序分析结果，进一步利用最小二乘判别分析(pls-da)分析各菌种丰度在各样本中的得分，并利用变量重要性分析得到哪一种拟杆菌在两组人群差异最为显著。
40.实验结果
41.分别将icp患者及正常孕妇人群粪便dna进行16s rrna测序分析，结果发现icp患者肠道菌群α多样性明显低于对照组(图1a)。β多样性分析提示icp患者肠道菌群结构与正常对照组存在明显差异，两组菌群结构组成差异明显(图1b)。菌群组成(图1c)及lefse分析显示两组人群具有显著差异的的菌属(图1d)，发现拟杆菌属(bacteroides)、lachnoclostridium、韦荣氏球菌属(bacteroides)、罗斯氏菌属(roseburia)、大肠埃希菌-志贺氏菌属 (escherichia_shigella)在icp患者组中明显富集，而布劳特氏菌属(blautia) 明显减少。其中，拟杆菌属(bacteroides)在icp患者肠道明显富集。
42.1.2菌群移植实验
43.实验材料及方法
44.分别将icp患者及正常孕妇来源的粪菌移植无菌孕鼠，检测胆汁酸、肝转氨酶等生化指标、胎儿指标。具体步骤为：
45.(1)粪菌悬液制备：分别取icp患者及正常孕妇来源的新鲜粪便，立即重悬于含甘油的pbs溶液，分装保存于-80℃备用；
46.(2)将上述粪便悬液低速离心，去掉多余粪渣，分别移植给无菌小鼠，每只小鼠灌胃200μl(0.15g/ml)粪便悬液，一周两次，连续灌胃4周；
47.(3)灌胃结束后小按雄鼠：雌鼠1:2比例合笼，观察记录雌鼠体重变化，观察阴道栓出现并记录为e 0.5d；
48.(4)雌鼠怀孕e18d，收集小鼠大便，麻醉并处死小鼠，取小鼠血液、胎盘等组织，观察记录胎儿数量、体重；
49.(5)利用全自动生化仪检测血清中alt、ast、alp、总胆汁酸水平；
50.(6)肝脏及胎盘分别福尔马林固定后，石蜡包埋、切片，he染色检测肝脏及胎盘组织病理变化；
51.实验结果
52.如图2(a～d)，icp患者来源粪菌移植小鼠(i-fmt)胆汁酸、肝转氨酶(ast、alt、alp)等指标明显高于正常孕妇粪菌移植小鼠(h-fmt)。如图2(e、f)，观察胎儿表现和比较胎鼠体重，发现icp患者来源粪菌移植小鼠(i-fmt)的胎儿损害亦明显高于正常孕妇粪菌移植小鼠(h-fmt)。
53.该研究表明，肠道菌群结构改变确实导致孕鼠icp相关症状的发生。
54.1.3icp患者与正常孕妇代谢差异
55.1.3.1kegg分析差异代谢通路
56.实验材料和方法
57.通过宏基因组测序分析正常孕妇与icp患者的肠道菌群组成，通过生物信息学软件进行kegg代谢通路分析。
58.实验结果
59.结果发现，如图3，在icp患者和正常孕妇肠道内差异富集的菌群参与调控的信号通路中，差异最明显的为胆汁酸代谢通路，为后续研究胆汁酸组成及调控提供依据。
60.1.3.2靶向代谢组学检测分析icp患者及正常孕妇粪便、血清中胆汁酸组成及水平
61.实验材料和方法
62.(1)分别取icp患者及正常孕妇的粪便及血清样本，储存于超低温冰箱备用；
63.(2)胆汁酸代谢检测委托上海麦特绘谱生物科技公司完成；
64.(3)试验检测用品准备：胆汁酸标准品购自steraloids公司(newport,ri, usa)和trc chemicals(toronto,on,canada)以及发明人所在实验室合成， 10个同位素标记的胆汁酸内标购自c/d/n isotopes公司(quebec,canada)和 steraloids公司(newport,ri,usa)。精确称取胆汁酸和同位素内标，并溶于甲醇中得到5mm浓度的储存母液。使用时将胆汁酸母液混合，并在无胆汁酸血清基质中逐级稀释成2500、500、250、50、10、2.5和1nm浓度点。另用无胆汁酸血清基质制备1500、150和5nm胆汁酸标液作为高中低三种浓度的质控样本。所有浓度点标液和质控样本中内标浓度皆一致，即为(gca-d4, tca-d4,tcdca-d9,ca-d4,gcdca-d4,cdca-d4,lca-d4和amca-d5均为 150nm)；
65.(4)样本前处理：取粪便或血清样本加入离心管中，加入约25mg预冷的研磨珠，再加入200μl包含10μl内标的乙腈/甲醇(v/v＝8:2)混合溶剂。匀浆后在4℃下以13,500rpm的转速离心20min。取10μl上清，用90μl 1:1 的乙腈/甲醇(80/20)和超纯水混合溶剂稀释，振荡离心后等待进样分析，进样体积为5μl；
66.(5)超高效液相色谱串联质谱仪(uplc-ms/ms，acquity uplc-xevo tq-s,waters corp.,milford,ma,usa)用于定量胆汁酸检测。
67.实验结果
68.icp患者与正常孕妇相比，粪便(图4a)和血清(图4b)中三种胆汁酸水平均显著降低，这三种胆汁酸分别为甘氨胆酸(gca)、甘氨鹅脱氧胆酸 (gcdca)和甘氨脱氧胆酸(gdca)。
69.1.4拟杆菌属与胆汁酸水平的相关性分析
70.实验材料和方法
71.(1)通过宏基因组学分析得到每一例icp患者粪便样本中拟杆菌的相对丰度值；
72.(2)靶向代谢组学测定icp患者粪便中胆汁酸含量，通过相关性分析，分析icp患者拟杆菌丰度与胆汁酸含量的相关性。
73.实验结果
74.将icp患者拟杆菌属丰度与胆汁酸水平进行相关性分析发现，如图5，拟杆菌丰度与gdca水平呈明显的负相关，提示拟杆菌可能参与了gdca的代谢调控。
75.实施例二
76.2.gdca在拟杆菌调控icp发生中的作用
77.fxr分布于肠、肝脏中，参与胆汁酸代谢。已有研究发现，肝脏中fxr 通过诱导下游信号小异二聚体伴侣(shp)抑制胆汁酸合成。人成纤维细胞生长因子19(fgf19)与小鼠成纤维细胞生长因子15(fgf15)为同源的胆汁酸代谢调节因子，为fxr下游信号。在肠道中，fxr通过诱导fgf19/fgf15的信号通路抑制胆汁酸合成。
78.本部分研究gdca对小鼠icp的影响以及作用机制。
79.2.1 gdca对拟杆菌移植引起的小鼠icp症状的影响
80.实验材料和方法
81.(1)菌种制备：拟杆菌平板划线法均匀涂布厌氧培养基平板，于37℃厌氧手套箱培养，待2-3日菌落出现后，挑取单菌落于液体培养基厌氧培养，测量培养基od值计算细菌cfu
值；
82.(2)拟杆菌(2
×
108cfu)溶于200μl无菌水溶液，分别灌胃无菌雌鼠，对照灌胃相同浓度的灭活拟杆菌种，同时分别给予gdca(30mg/kg/d)灌胃，一周两次，连续灌胃4周，雄鼠与雌鼠以1:2比例合笼，观察记录小鼠体重及阴道栓出现时间；
83.(3)雌鼠怀孕e18d，处死前收集小鼠粪便，麻醉并处死小鼠，取小鼠血液、肠道、肝脏、胎盘等组织，观察记录胎儿数量和体重；
84.(4)利用全自动生化仪检测血清中alt、ast、总胆汁酸水平；
85.(5)粪便、血清、肝脏及肠道组织分别利用超高效液相色谱串联质谱仪 (uplc-ms/ms)检测分析，样本处理及检测分析步骤同1.3.2；
86.(6)取小鼠小肠和肝脏组织，分离肠上皮细胞和肝细胞，具体步骤：将小肠移至培养皿，dpbs反复清洗，用含青霉素的无血清培养基清洗数次，将肠组织剪成碎片，无血清培养基清洗后，离心弃上清取沉淀备用。向沉淀加入胶原酶xi和中性蛋白酶i，37℃消化20分钟，移液枪反复吹打，离心沉淀反复清洗后重悬备用。取新鲜肝脏组织，将肝组织剪成小组织块，用无血清培养基反复冲洗吹打，加入胶原酶进行消化，得到肝细胞悬液备用。取上述细胞悬液后，利用trizol试剂盒分别提取rna，qpcr检测fxr、shp等分子的表达。
87.实验结果
88.如6(a～d)所示，拟杆菌移植可明显导致小鼠胆汁酸水平、alt和ast 两种肝转氨酶水平升高，且胎鼠外观表现损害，体重降低，也即表现出胆汁淤积发生及胎鼠损害。而补充gdca后可明显缓解拟杆菌所致的上述表现。
89.如图6(e、f)所示，体内实验检测发现拟杆菌移植并不影响fxr分子的表达，但可明显抑制fxr下游信号shp基因表达，而补充gdca后可回复fxr信号，提示拟杆菌可能通过gdca等胆汁酸的改变而调控了fxr信号的改变。
90.2.2体外实验研究gdca与fxr信号的关系
91.在上述研究的基础上，进一步从胆汁酸代谢调控的信号通路角度出发，研究gdca如何影响机体胆汁酸代谢以及减轻icp相关症状。
92.实验材料和方法
93.(1)docking分析预测上述各胆汁酸与fxr的结合构象关系：在rcsb protein data bank下载fxr受体的晶体结构(pdb id:3dct, https://www.rcsb.org/)，利用sybyl-x 2.0的surflex-dock geomx(sfxc) 进行gdca与fxr结合的docking分析，胆汁酸与fxr结合作用利用pymol 和ligplot进行分析；
94.(2)通过tr-fret fxr共活化分析检测各胆汁酸与fxr信号活化的作用，该实验利用lanthascreen
tm
tr-fret farnesoid x receptor coactivatorassay检测试剂盒(thermo fisher,cat#a15140)进行，具体简要步骤如下：1) 按说明书准备coregulator buffer g，加入终浓度为10mm的dtt；2)用100x 样品稀释液倍比稀释待测胆汁酸样品；3)将稀释好的样品稀释液取10μl加入测量孔板，设置测量复孔；4)用coregulator buffer g缓冲液制备4xfxr-lbd稀释液，加入5μl至上述各对应孔板；5)用coregulator buffer g 缓冲液配制终浓度含2.0μm fluorescein-src2-2(4x)和20nm的tbanti-gst antibody(4x)工作液，取5μl工作液至上述反应体系；6)轻轻震荡混匀反应混合液，室温避光孵育，分别在波长520nm和495nm读板；7)计算tr-fret比值(520nm/495nm)，绘制结合曲线及计算ec50，与
标准激动剂cdca和拮抗剂gudca对照，分析各胆汁酸与fxr结合及功能作用。
95.(3)双荧光素酶报告基因检测各胆汁酸对fxr转录活性的作用：1)常规培养hek293细胞，待生长汇合至85％后，接种6孔板，37℃培养至汇合 85％；2)委托吉凯基因公司构建人fxr表达质粒、pgl4-shp-tk fireflyluciferase报告基因载体以及海肾荧光素酶对照载体(prl-luciferase；promega, madison,wi)，利用转染试剂lipofectamine 3000共转染hek293细胞，转染后细胞继续培养24小时；3)细胞培养液加入终浓度为50-200μm的上述胆汁酸，cdca作为阳性对照；4)利用双荧光素酶检测试剂盒(promega)分别检测荧光素报告基因活性，具体操作按试剂盒说明书进行。
96.(4)各胆汁酸与原代肠上皮细胞或caco2细胞孵育后，检测fxr信号及下游基因表达：1)超净工作台取出小鼠小肠，用预冷的pbs反复冲洗肠内容物，直至澄清，在含青霉素和链霉素的无血清培养基清洗数次，将肠组织剪成小于1mm2的碎片，转移至离心管，无血清培养基反复清洗、吹打，离心去上清，加入胶原酶和中性蛋白酶消化组织块，反复吹打消化，离心后完全培养基重悬、培养；2)常规培养caco2细胞；3)待细胞生长汇合至85％后，饥饿培养4h，分别加入终浓度为50-200μm的gdca，孵育16h；对照组分别加入同等终浓度的gudca或t-βmca；3)待孵育结束后，分别提取rna 和蛋白，qpcr检测shp、fgf19等分子的表达。
97.实验结果
98.如图7(a、b)，docking分析预测gdca可与fxr结合，并且体外实验初步发现gdca可直接促进fxr下游shp基因表达，如图7(c)所示，提示gdca可能作为fxr激动剂发挥调控作用。
99.如图8所示，tr-fret fxr共活化分析发现，gdca可作为fxr的激动剂发挥激动fxr的作用。
100.如图9所示，细胞实验结果发现，gdca可以明显促进fxr下游基因 fgf19和shp的mrna表达，该促进作用可被fxr拮抗剂gudca和 t-βmca所抑制。
101.2.3体内实验研究gdca与fxr信号的关系
102.在体外实验的基础上，进一步通过体内实验研究gdca与fxr信号的关系。
103.实验材料和方法
104.(1)制备拟杆菌种，方法同2.1部分；
105.(2)拟杆菌(2
×
108cfu)溶于200μl无菌水溶液，灌胃无菌雌鼠雌鼠，对照灌胃相同浓度的灭活拟杆菌种，同时分别给予gdca(30mg/kg/d)灌胃，一周两次，连续灌胃4周，雄鼠与雌鼠按1:2比例合笼，观察记录小鼠体重及阴道栓出现时间；
106.(3)雌鼠怀孕e18d，麻醉并处死小鼠，取小鼠肠道及肝脏组织，按2.1 部分所述方法分离肠上皮细胞及肝细胞，提取rna，qpcr分别检测肠及肝脏fxr、shp等下游基因的表达。
107.实验结果
108.如图10所示，拟杆菌移植小鼠后检测肠道组织fxr下游基因表达，发现拟杆菌移植可以明显抑制fxr下游基因fgf15和shp的表达，而gdca 可明显回复拟杆菌所导致的fxr抑制作用。
109.本部分体外体内研究表明，gdca确实作为fxr激动剂发挥作用，能够促进fxr下游基因表达。
110.实施例三
111.3.gdca对小鼠icp的治疗作用
112.实验材料和方法
113.(1)标准的icp小鼠造模，即用ee2雌激素皮下注射后，构建icp小鼠模型；
114.(2)分别在ee2给予前及给予后予以gdca(30mg/kg/d)灌胃，一周两次，连续灌胃4周，雄鼠：雌鼠按1:2比例合笼，观察记录小鼠体重及阴道栓出现时间；
115.(3)待孕18d时，取小鼠肠道及肝脏组织，检测icp小鼠表型变化，并按2.2部分所述方法分离肠上皮细胞，qpcr检测fgf15、shp等的表达，分离肝细胞，qpcr分别检测肝脏shp、ntcp、cyp7a1、cyp8b1、bsep、 mrp2等的表达。
116.实验结果
117.采用如图11a示意过程获得标准ee2造模icp小鼠，发现与icp相关的胆汁酸水平、alt、ast、alp、ggt、肝脏指数(liver index)等生化指标在造模icp小鼠组(ee2)较正常小鼠组(control)显著升高，表明造模成功，而gdca灌胃icp小鼠组(ee2+gdca)的上述生化指标被明显抑制(图11b、 11c)，并且可缓解ee2导致的肝脏病理损伤(图11d)。
118.如图12所示，ee2造模icp小鼠组(ee2)较正常小鼠组(control)的 fxr下游基因fgf15、shp、ntcp的表达被明显抑制，而gdca可回复icp 小鼠fxr信号(图12a、12b)，同时gdca可明显抑制cyp7a1、cyp8b1、 cyp27a1等胆汁酸合成基因表达，并促进bsep、mrp2等胆汁酸排泌基因的表达(图12c)。
119.结合前述体外和体内实验研究gdca与fxr信号关系的结果可知，对 icp小鼠补充gdca能够减轻icp相关指标和症状，且gdca是通过增强小鼠体内肝脏和肠fxr下游信号基因表达的途径来起到预防和治疗icp的作用。
120.与现有技术相比，本发明的有益效果：本研究发现icp患者肠道拟杆菌丰度增高导致肝内胆汁淤积的作用机制，并通过体外实验和动物实验证实， gdca作为fxr的一种新型激动剂，可以通过激动fxr信号发挥预防或/和减轻icp的作用，表明gdca具有用于制备治疗icp药物的潜力。
121.最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。