伴PCSK9功能获得性突变的常染色体显性高胆固醇血症的治疗方法与流程
本申请是中国专利申请201480031344.7的分案申请，原申请的申请日是2014年5月29日，发明名称是“伴pcsk9功能获得性突变的常染色体显性高胆固醇血症的治疗方法”。
本发明涉及治疗伴血脂和脂蛋白水平升高的疾病和病症的领域。更具体地说，本发明涉及使用pcsk9抑制剂来治疗有一个或多个pcsk9基因功能获得性突变的常染色体显性高胆固醇血症患者。
背景技术：
常染色体显性高胆固醇血症(adh)的特征是遗传性高血清ldl胆固醇(ldl-c)水平和心血管疾病早期发作。adh的病因包括ldl受体(ldlr)及其配体载脂蛋白b(apob)突变，以及(约1％的患者中)肝细胞ldlr的强效调节因子前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的功能获得性突变(gofm)。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌性枯草杆菌酶家族的蛋白酶k亚族。为降低血清总胆固醇、ldl胆固醇和血清甘油三酯而使用pcsk9抑制剂(抗pcsk9抗体)，在美国第8062640、8357371号专利和第2013/0064834号美国专利申请公开书中已有所说明。
发明概述
本发明提供了用于治疗常染色体显性高胆固醇血症(adh)，例如，由pcsk9功能获得性突变引起或与pcsk9功能获得性突变相关的adh的方法。本发明的方法包括选择pcsk9基因等位基因中有一个或两个功能获得性突变(gofm)的adh患者，并给患者施用含有pcsk9抑制剂的医药组合物。
可按照本发明的方法施用的pcsk9抑制剂包括例如抗pcsk9抗体或其抗原结合片段。可用于实施本发明之方法的具体的典型抗pcsk9抗体，包括如美国第8357371号专利所述和/或本文所公开的任何抗体或抗原结合片段。
所述pcsk9抑制剂可以皮下或静脉注射的方式给受试者注射。此外，所述pcsk9抑制剂也可施予在治疗性干预时正在接受他汀类药物治疗方案的患者。
在审阅随后的详细说明过程中，本发明的其他实施方案将变得明显。
附图的简要说明
图1a显示来自所分析的不同国家有各种pcsk9突变的个体人数(n)及每个相应国家的系谱数目(p)。“最小”表示谱系的最小数目(一些个体没有显示系谱)。
图1b提供了家族性pcsk9功能获得性突变(gofm)患者的临床数据摘要。
图2显示有pcsk9gofm而没有ldlr突变的患者的基线ldl-c分布。p值是指有特定突变时ldl-c的平均水平是否比有遗传变体的群体显著升高(向上箭头)或下降(向下箭头)。
图3显示pcsk9gofm(无ldlr突变，n＝134)、fh(有ldlr突变，n＝2126[受试者与荷兰注册数据库中的患者在年龄和性别上进行了匹配])和fdb(apob突变，n＝470[受试者与荷兰注册数据库中的患者在年龄和性别上进行了匹配])受试者的平均总胆固醇、ldl-c、hdl-c和甘油三酯水平。
图4显示pcsk9-gofm受试者对当前降脂治疗(llt)的反应，依据是用药前后报告的血脂状况。(*)表示p<0.0001；
图5显示pcsk9gofm患者对当前降脂治疗(llt)的反应，依据是有pcsk9gofm、没有ldlr突变、基线和治疗中ldl-c达到ldl-c目标的情况(n＝63)。ldl-c目标是基于ncep-atpiii指南(grundyetal.,circulation2004,110:227-239)。
图6是实施例3中描述的临床试验的示意图。a组患者在第-14、57、85和99天接受安慰剂(pbo)，并在第1、15、29、43和71天接受mab316p(mab)。b组患者在第-14、1、71和99天接受安慰剂(pbo)，并在第15、29、43、57和85天接受mab316p(mab)。两组的单盲安慰剂导入期都是第-14天到第1天；两组的双盲治疗期都是第1天至第99天。随访期是第99天至第155天。
图7显示实施例3中描述的临床试验的所有13名患者在第8周时ldl-c、载脂蛋白b、tg、hdl-c、载脂蛋白a1和lp(a)自基线的百分比变化。
图8显示a组和b组患者在接受沿x轴灰色和白色箭头所示的治疗后，ldl-c测量值(毫克/分升)随时间的变化。
图9显示a组和b组患者在接受沿x轴灰色和白色箭头所示的治疗后，游离pcsk9自基线随时间的变化(％)。
图10显示有各种pcsk9gof突变(d364y、l108r、s127r和r218s)的患者在接受沿x轴灰色和白色箭头所示的治疗后，ldl-c自基线随时间的变化(％)。
图11显示有各种pcsk9gof突变(d364y、l108r、s127r和r218s)的患者在接受沿x轴灰色和白色箭头所示的治疗后，游离pcsk9自基线随时间的变化(％)。
详细说明
在说明本发明之前先要指出，应该理解，本发明并不限于所述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于说明具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义均将与本发明所属技术领域的普通专业人员通常理解的相同。本文中所用的术语“大约”，当用于列出的某一具体数值时，意为该数值可在与所列数值相差不超过1％的范围内变化。例如，本文中所用的表达“约100”包括99和101以及这两者之间所有数值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施，但现在说明的是首选的方法和材料。本文所提及的所有出版物均通过引用而以其整体纳入本文。
治疗常染色体显性高胆固醇血症的方法
本发明提供了治疗常染色体显性高胆固醇血症(adh)的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一些方法，用于治疗由pcsk9的一个或多个功能获得性突变(gofm)引起或与pcsk9的一个或多个功能获得性突变(gofm)有关的adh。如本文所用，“pcsk9gofm”这一表达是指编码pcsk9蛋白的一个或两个等位基因的任何突变，其导致的氨基酸改变可增强人类患者体内pcsk9降低ldl受体水平的能力，或与高胆固醇血症有关或相关。典型的pcsk9gof突变包括v4i、e32k、d35y、e48k、p71l、r96c、l108r、s127r、d129n、r215h、f216l、r218s、r357h、d374h、d374y、s465l和r496w。
本发明的方法包括选择pcsk9基因的一个或两个等位基因有gofm的患者，并给患者施用含有pcsk9抑制剂的医药组合物。gofm可以是任何pcsk9gof突变。根据某些实施方案，所述gofm编码含有氨基酸替换的pcsk9变体蛋白，该氨基酸替换选自由v4i、e32k、d35y、e48k、p71l、r96c、l108r、s127r、d129n、r215h、f216l、r218s、r357h、d374h、d374y、s465l和r496w组成的一组突变。确定患者是否有pcsk9gofm的方法是本领域内众所周知的。例如，在本发明的背景下，可以使用pcsk9基因的dna序列分析来确定携带编码pcsk9gofm的一个或多个等位基因的患者。用于确定pcsk9gof突变的基于蛋白质组学的方法也包括在本发明的方法范围内。
在某些实施方案中，可基于是否显示高胆固醇血症的一个或多个其他特征或风险因素来进一步选择患者。例如，本发明包括以下方法：即在给予含有pcsk9抑制剂的医药组合物之前基于血浆ldl-c水平大于或等于约70毫克/分升这一指标，进一步选择pcsk9gofm患者进行治疗。在其他实施方案中，在给予含有pcsk9抑制剂的医药组合物之前基于身体质量指数(bmi)大于约18.0千克/平方米这一指标，进一步选择pcsk9gofm患者。
根据本发明，在给予含有pcsk9抑制剂的医药组合物之时或之前，患者可正在接受背景降脂治疗。背景降脂治疗的实例包括他汀类药物[例如，西伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等]、依泽替米贝、贝特类、烟酸、ω-3脂肪酸和胆汁酸树脂。
将以本发明之方法治疗的患者可基于由选自下列一组因素的一个或多个因素来选择：年龄(例如40、45、50、55、60、65、70、75或80岁以上)、种族、民族起源、性别(男性或女性)、锻炼习惯(例如经常锻炼、不锻炼)、其他原有疾病(例如ii型糖尿病、高血压等)，以及目前的用药状态(例如目前正在服用他汀类药物[例如西伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等]、β-受体阻断剂、烟酸等)。本发明的方法还可以用于治疗对常规他汀类药物治疗不耐受、无反应或反应不足的adh患者。可能的患者人选可在用本发明之方法治疗之前，在一种或多种前述选择因素的基础上选择/筛选(例如通过问卷、诊断评估等)。
本发明的方法导致了选自由ldl-c、载脂蛋白b100、非hdl-c、总胆固醇、vldl-c、甘油三酯、lp(a)和残余胆固醇组成的一组脂质组分的一种或多种脂质组分的血清水平下降。例如，根据本发明的某些实施方案，给pcsk9gofm受试者施用含有pcsk9抑制剂的医药组合物后，导致血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)自基线平均下降百分比为至少约25％、30％、40％、50％、60％或以上；载脂蛋白b100自基线平均下降百分比为至少约25％、30％、40％、50％、60％或以上；非hdl-c自基线平均下降百分比为至少约25％、30％、40％、50％、60％或以上；总胆固醇自基线平均下降百分比为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％或以上；vldl-c自基线平均下降百分比为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％或以上；甘油三酯自基线平均下降百分比为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或以上；及/或lp(a)自基线平均下降百分比为至少约5％、10％、15％、20％、25％或以上。
pcsk9抑制剂
本发明之方法包括给患者施用含有pcsk9抑制剂的治疗组合物。本文所用的术语“pcsk9抑制剂”是在体外或体内与人pcsk9结合或与其相互作用并抑制pcsk9的正常生物功能的任何药剂。pcsk9抑制剂类别的非限制性实例包括小分子pcsk9拮抗剂、肽基pcsk9拮抗剂(例如“肽抗体”分子)，以及与人pcsk9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段。
本文所用的术语“人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9”或“人pcsk9”或“hpcsk9”是指含有序列754所示核酸序列和序列755所示氨基酸序列或其生物活性片段的pcsk9。
本文所用的术语“抗体”意指由四条多肽链，即两条重(h)链和两条轻(l)链以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如igm)。每条重链均包含一个重链可变区(本文简称为hcvr或vh)和一个重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，ch1、ch2和ch3。每条轻链均包含一个轻链可变区(本文中简称为lcvr或vl)和一个轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个结构域(cl1)。vh和vl区可进一步分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其中散布着较保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本发明另一些实施方案中，抗pcsk9抗体(或其抗原结合部分)的fr可能与人类种系序列相同或可能经过天然或人工修饰。氨基酸共有序列可根据两个或两个以上cdr的并排分析而定义。
本文所用的术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。本文所用的抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等术语，包括与抗原特异性结合而形成复合体的任何天然产生的、可以酶促方式获得的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和(可选)恒定区的dna之操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整抗体分子产生。此类dna是已知的及/或很容易从例如市售来源、dna库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以合成。该dna可以测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成一种适宜的结构，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；及(vii)由模拟该抗体高变区的氨基酸残基(例如一个孤立的互补决定区cdr，如cdr3肽)或fr3-cdr3-fr4结构约束肽组成的最小识别单位。本文所用的“抗原结合片段”这一术语还包括其他工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、cdr嫁接的抗体、双抗体、三聚抗体、四聚抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smip)及鲨鱼可变ignar域。
抗体的抗原结合片段通常会包含至少一个可变区。可变域可以是任何大小或可具有任何氨基酸组成，且通常会包含至少一个邻近于一个或多个框架序列或位于其中的cdr。在含有与vl区相连接之vh区的抗原结合片段中，该vh区和vl区的相对位置可以任何适宜方式排列。例如，该可变区可以是二聚化的且含有vh-vh、vh-vl或vl-vl二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有一个单一的vh区或vl区。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定区共价连接的至少一个可变区。在本发明之抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区的非限制性典型结构包括：(i)vh-ch1；(ii)vh-ch2；(iii)vh-ch3；(iv)vh-ch1-ch2；(v)vh-ch1-ch2-ch3；(vi)vh-ch2-ch3；(vii)vh-cl；(viii)vl-ch1；(ix)vl-ch2；(x)vl-ch3；(xi)vl-ch1-ch2；(xii)vl-ch1-ch2-ch3；(xiii)vl-ch2-ch3；及(xiv)vl-cl。在可变区和恒定区的任何结构中，包括上述任何典型结构中，该可变区和恒定区可直接相互连接或可由一个完全或部分的铰链区或连接区连接。一个铰链区可含有至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或以上)氨基酸序列，其在一个单一肽分子中相邻的可变区和/或恒定区之间形成一种柔性或半柔性连接。此外，本发明之抗体的抗原结合片段可包含上述可变区和恒定区任何结构的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，该可变区和恒定区结构以非共价键相互连接及/或与一个或多个单一vh区或vl区(例如通过二硫键)连接。
如同完整抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性(例如双特异性)。一个抗体的多特异性抗原结合片段通常会包含至少两个不同的可变区，其中每个可变区都能与另一个抗原或同一抗原的不同表位特异性结合。对于任何多特异性抗体形式，包括本文所公开的典型双特异性抗体形式，均可用本领域内现有的惯用技术，使其适应于与本发明之抗体的抗原结合片段相关的用途。
抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是很重要的。因此，可在是否需要由抗体介导细胞毒性的基础上选择同型抗体。
本文所用的术语“人源抗体”意在包括含有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人源抗体仍可包括非由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如可在cdr中尤其是在cdr3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语“人源抗体”并不意图包括衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的cdr序列被嫁接到人类框架序列上的抗体。
本文所用的术语“重组人源抗体”意在包括所有以重组方法制备、表达、产生或分离的人源抗体，例如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(将在下文进一步说明)，从重组的、组合人抗体库分离的抗体(将在下文进一步说明)，从人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参阅例如tayloretal.(1992)nucl.acidsres.20:6287-6295)，或者以其他任何涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人源抗体含有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这类重组人源抗体经受体外诱变(或当使用含有人类ig序列的转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，从而使得该重组抗体的vh区和vl区的氨基酸序列成为这样的序列：它们虽然衍生自人类种系vh序列和vl序列并与其有亲缘关系，但也许并不天然地存在于体内人抗体种系谱中。
人源抗体可以两种与铰链异质性有关的形式存在。在第一种形式中，免疫球蛋白分子包含一个约150-160kda的稳定四链构建物，其中二聚体由一个链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是由链间重链二硫键连接在一起，而是形成了一种由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kda的分子。这些形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。
第二种形式在各种完整igg同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人类igg4铰链的铰链区内单个氨基酸替换可将第二种形式(angaletal.(1993)molecularimmunology30:105)的出现频率显著地降低到利用人类igg1铰链通常观察到的水平。本发明包括在铰链区、ch2区或ch3区中含有一个或多个突变的抗体；所述突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。
本文所用的“分离抗体”意为从其自然环境的至少一个组分识别、分离和/或回收的抗体。例如，从一个生物体的至少一个组成部分或从抗体自然存在或自然产生的一种组织或细胞分离或移除的抗体，就是一种符合本发明目的之“分离抗体”。“分离抗体”也包括重组细胞内的原位抗体。分离抗体是经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。按照某些实施方案，分离抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
“特异性结合”或类似术语意为抗体或抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合体。确定抗体是否与抗原特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振等方法。例如，如本发明之背景下所用的术语与pcsk9“特异性结合”的抗体，包括与pcsk9或其一部分结合的抗体，经表面等离子共振技术测量，其kd小于约1000纳米、小于约500纳米、小于约300纳米、小于约200纳米、小于约100纳米、小于约90纳米、小于约80纳米、小于约70纳米、小于约60纳米、小于约50纳米、小于约40纳米、小于约30纳米、小于约20纳米、小于约10纳米、小于约5纳米、小于约4纳米、小于约3纳米、小于约2纳米、小于约1纳米或小于约0.5纳米。但是，与人源pcsk9特异性结合的分离抗体对于其他抗原，如源自其他(非人类)物种的pcsk9分子，可具有交叉反应性。
与衍生抗体的相应种系序列相比，可用于本发明之方法的抗pcsk9抗体在重链和轻链可变域的框架区和/或cdr区可包含一个或多个氨基酸替换、插入和/或删除。通过将本文所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可获得的种系序列相比，可以轻易地证实这类突变。本发明包括涉及使用某些抗体及其抗原结合片段的方法，该抗体及其抗原结合片段衍生自本文所公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架区和/或cdr区内的一个或多个氨基酸被突变为衍生该抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个人类种系序列的相应残基，或突变为相应种系序列残基的保守氨基酸替换(这类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本发明所属技术领域的普通专业人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可很容易产生许多包含一个或多个单个种系突变或其组合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，上述vh和/或vl区内的所有框架和/或cdr残基均回复突变为在衍生该抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，只有某些残基才回复突变为原始种系序列，例如，只有fr1的前8个氨基酸序列或fr4的最后8个氨基酸序列中发现的突变残基，或只有cdr1、cdr2或cdr3中发现的突变残基，才能回复突变为原始种系序列。在某些实施方案中，一个或多个框架和/或cdr残基回复突变为一个不同种系序列(即不同于最初衍生该抗体的种系序列的种系序列)的相应残基。此外，本发明之抗体可在框架区和/或cdr区内含有两个或多个种系突变的任何组合，例如，其中某些残基分别突变为一个特定种系序列的相应残基，而某些其他不同于原始种系序列的残基则保持不变或突变为一个不同种系序列的相应残基。获得了含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段之后，就很容易测试其一种或多种所需的特性，例如结合特异性改善、结合亲和力提高、拮抗或激动生物学特性改善或增强(视情况而定)、免疫原性降低等。以此一般方式所获的抗体和抗原结合片段的使用均包括在本发明的范围内。
本发明还包括一些方法，其涉及使用含有本文所公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列之变体的抗pcsk9抗体，该变体含有一个或多个保守氨基酸替换。例如，本发明包括使用含有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗pcsk9抗体，相对于本文所公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列，该氨基酸序列含有例如10个或以下、8个或以下、6个或以下、4个或以下等保守氨基酸替换。
本文所用的术语“表面等离子共振”是指一种光学现象，基于该光学现象可利用例如biacoretm系统(biacorelifesciencesdivisionofgehealthcare,piscataway,nj)来检测生物感测器基质中蛋白浓度的变化，从而实时分析交互作用。
本文所用的术语“kd”意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”是指抗原决定位，其与抗体分子可变区中称为抗原互补位的特异性抗原结合位点相互作用。单个抗原可能有一个以上的表位。因此，不同抗体可与抗原的不同区域结合并可产生不同的生物学效应。表位可为构象性的，也可为线性的。构象性表位是从线性多肽链不同片段空间并列的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链上邻近的氨基酸残基产生的。在某些情况下，表位可包括抗原的糖类、磷酰基或磺酰基基团。
依照某些实施例，用于本发明之方法的抗pcsk9抗体是一种具有ph依赖性结合特征的抗体。本文所用的表达“ph依赖性结合”，意为该抗体或其抗原结合片段展现了“在酸性ph条件下与pcsk9的结合力比在中性条件下为低”的特征(出于本公开书之目的，两种表达可以互换使用)。例如，具有“ph依赖性结合特征”的抗体包括在中性条件下与pcsk9的结合亲和力比在酸性ph条件下要高的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明之抗体及其抗原片段在中性ph值条件下与pcsk9结合的亲和力，比在酸性ph值条件下至少要高3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍或以上。
依照本发明之这一方面，相对于亲本抗pcsk9抗体，具有ph依赖性结合特征的抗pcsk9抗体可以具有一种或多种氨基酸变异。例如，具有ph依赖性结合特征的抗pcsk9抗体可能包含一个或多个组氨酸替换或插入，例如，在亲本抗pcsk9抗体的一个或多个cdr中。因此，依照本发明之某些实施例，提供了一些包括施用含cdr氨基酸序列(例如重链和轻链cdr)的抗pcsk9抗体的方法，除了亲本抗体的一个或多个cdr中一个或多个氨基酸被组氨酸残基替换外，该cdr氨基酸序列与亲本抗pcsk9抗体的cdr氨基酸序列是相同的。具有ph依赖性结合特征的抗pcsk9抗体可具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9个或以上组氨酸替换，这些组氨酸替换可存在于亲本抗体的单一cdr中，或分散在亲本抗pcsk9抗体的多个(例如2、3、4、5或6个)cdr中。例如，本发明包括使用呈ph依赖性结合之抗pcsk9抗体，其在亲本抗pcsk9抗体之hcdr1内包含一个或多个组氨酸替换、hcdr2内包含一个或多个组氨酸替换、hcdr3内包含一个或多个组氨酸替换、lcdr1内包含一个或多个组氨酸替换、lcdr2内包含一个或多个组氨酸替换及/或lcdr3内包含一个或多个组氨酸替换。
本文所用的表达“酸性ph”，意为6.0或更低(例如，低于约6.0、低于约5.5、低于约5.0等)的ph值。“酸性ph”这一表达包括约6.0、5.95、5.90、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0，或更低的ph值。本文所用的表达“中性ph”，意为约7.0至约7.4的ph值。“中性ph”这一表达包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35以及7.4的ph值。
人源抗体的制备
在转基因小鼠体内产生人源抗体的方法是本领域内已知的。任何这类已知的方法均可在本发明的背景下用于产生与人pcsk9特异性结合的人源抗体。
采用velocimmunetm技术(参阅例如regeneronpharmaceuticals公司的美国第6596541号专利)或其他任何产生单克隆抗体的已知技术，初步分离出对pcsk9具有高亲和力的含有一个人类可变区和一个小鼠恒定区的嵌合抗体。
通常，用所研究的抗原刺激
首先，分离包含一个人源可变区和一个小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。该抗体是根据所需的特性，包括亲和力、选择性、表位等，使用本领域内普通技术人员熟知的标准程序予以鉴定和选择的。用合乎需要的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明的完全人源抗体，例如野生型或经修饰的igg1或igg4。所选择的恒定区可根据特定用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特征则留存于可变区中。
一般而言，当以与固定在固相或液相的抗原结合的方式测定时，可用于本发明之方法的抗体具有如上所述的高亲和力。用合乎需要的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明之完全人源抗体。所选择的恒定区可根据特定用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特征则留存于可变区中。
与可用于本发明的方法之背景下的与pcsk9特异性结合的人源抗体或抗体的抗原结合片段的具体实例，包括在一个含有氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内包含三个重链cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3)的任何抗体或抗原结合片段，该氨基酸序列选自下列一组序列：2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742，或一种与其基本相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。该抗体或抗原结合片段可在一个含有氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内包含三个轻链cdr(lcvr1、lcvr2、lcvr3)，该氨基酸序列选自下列一组序列：10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740和744，或一种与其基本相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在本发明的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括源自重链和轻链可变区氨基酸序列对(hcvr/lcvr)的6个cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3)，该氨基酸序列对选自下列一组序列对：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740和742/744。
在本发明的某些实施方案中，可用于本发明之方法的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包括含有选自下列一组序列的hcdr1/hcdr2/hcdr3/lcdr1/lcdr2/lcdr3氨基酸序列：76/78/80/84/86/88(mab316p)和220/222/224/228/230/232(mab300n)(参阅美国专利申请公开书2010/0166768)。
在本发明的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下列一组序列对的hcvr/lcvr氨基酸序列对：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740和742/744。
医药组合物和给药方法
本发明包括给患者施用pcsk9抑制剂的方法，其中将该pcsk9抑制剂加入一种医药组合物。本发明之医药组合物是与适宜的载体、辅料以及赋予药物各种适宜特性如转移、递送、耐受性等的其他试剂一起配制的。在这本药剂化学师众所周知的处方集里可以找到许多适宜的配方：雷氏药学大全(remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easton,pa)。这些配方包括，例如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂质(阳离子或阴离子)的泡囊(如lipofectintm)、dna偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有碳蜡的半固体状混合物。还可参阅powelletal.“compendiumofexcipientsforparenteralformulations”,pda(1998)jpharmscitechnol52:238-311。
已知有各种药物递送系统可用于本发明之医药组合物的给药，例如脂质体封装、微颗粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅如wuetal.，1987,j.biol.chem.262:4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及口服。该组合物可经由任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其他生物活性剂一起给药。
本发明之医药组合物可用标准的针头和注射器经皮下或静脉注射。此外，对于皮下给药，笔型给药装置可方便地用于本发明之医药组合物的给药。这种笔型给药装置可以是重复使用型或一次性使用型。可重复使用的笔型给药装置一般采用一种可更换的含医药组合物药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出、药筒变空，即可方便地弃置空药筒，并用含有医药组合物的新药筒更换。然后，该笔型给药装置即可重复使用。在一次性使用的笔型给药装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型给药装置内有一个预先灌注了医药组合物的贮液器。一旦该贮液器内医药组合物用完，整个装置即被弃置。
许多可重复使用的笔型和自动注射给药装置已用于本发明之医药组合物的皮下给药。其实例包括但不限于autopentm(owenmumford,inc.,woodstock,uk)、disetronictm笔(disetronicmedicalsystems,bergdorf，switzerland)、humalogmix75/25tm笔、humalogtm笔、humalin70/30tm笔(elilillyandco.，indianapolis,in)、novopentmi、ii和iii型(novonordisk,copenhagen,denmark)、novopenjuniortm(novonordisk，copenhagen,denmark)、bdtm笔(bectondickinson，franklinlakes,nj)、optipentm、optipenprotm、optipenstarlettm及opticliktm(sanofi-aventis，frankfurt,germany)，此处仅举几例。用于皮下注射本发明之医药组合物的一次性使用笔型给药装置的实例包括但不限于solostartm笔(sanofi-aventis)、flexpentm(novonordisk)、kwikpentm(elililly)、sureclicktm自动注射器(amgen,thousandoaks,ca)、penlettm(haselmeier,stuttgart，germany)、epipen(dey,l.p.)及humiratm笔(abbottlabs,abbottparkil)，此处仅举几例。
在某些情况下，该医药组合物可用一种控释系统给药。在一个实施方案中，可使用一种泵(参阅langer，出处同上；sefton，1987，crccrit.ref.biomed.eng.14:201)。在另一个实施方案中，可采用聚合材料；参阅medicalapplicationsofcontrolledrelease,langerandwise(eds.),1974，crcpres.,bocaraton,florida。在另一个实施方案中，可将一种控释系统置于该组合物靶标附近，从而只需要使用全身性剂量的一小部分(参阅例如，goodson,1984,inmedicalapplicationsofcontrolledrelease,supra,vol.2,pp.115-138)。在langer，1990，science249:1527-1533的综述中也讨论了其他控释系统。
注射型制剂可包括静脉、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些注射型制剂可以已知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质中，或通常用于注射的油性介质中，以此方式制备该注射型制剂。作为注射用的水性介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯[50摩尔]加合物)]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓿瓶中。
有利的是，上述口服或肠外使用的医药组合物是制备成单位剂量的剂型，以容纳一次剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。
剂量
依照本发明之方法给受试者施用的pcsk9抑制剂(例如抗pcsk9抗体)的量一般都是治疗有效量。本文所用的短语“治疗有效量”意为可使选自由ldl-c、载脂蛋白b100、非hdl-c、总胆固醇、vldl-c、甘油三酯、lp(a)和残余胆固醇组成的一组指标的一种或多种指标的下降程度可被检测出的pcsk9抑制剂的剂量(自基线下降至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或以上)。
对于抗pcsk9抗体，治疗有效量可以是从约0.05毫克至约600毫克，例如约0.05毫克、约0.1毫克、约1.0毫克、约1.5毫克、约2.0毫克、约10毫克、约20毫克、约30毫克、约40毫克、约50毫克、约60毫克、约70毫克、约75毫克、约80毫克、约90毫克、约100毫克、约110毫克、约120毫克、约130毫克、约140毫克、约150毫克、约160毫克、约170毫克、约180毫克、约190毫克、约200毫克、约210毫克、约220毫克、约230毫克、约240毫克、约250毫克、约260毫克、约270毫克、约280毫克、约290毫克、约300毫克、约310毫克、约320毫克、约330毫克、约340毫克、约350毫克、约360毫克、约370毫克、约380毫克、约390毫克、约400毫克、约410毫克、约420毫克、约430毫克、约440毫克、约450毫克、约460毫克、约470毫克、约480毫克、约490毫克、约500毫克、约510毫克、约520毫克、约530毫克、约540毫克、约550毫克、约560毫克、约570毫克、约580毫克、约590毫克或约600毫克。
各剂量中所含抗pcsk9抗体的量可以毫克抗体/每千克患者体重(即毫克/千克)表示。例如，可以约0.0001至约10毫克/千克患者体重的剂量将抗pcsk9抗体施予患者。
联合治疗
依照某些实施方案，本发明之方法可包括给患者施用一种含有抗pcsk9抗体的医药组合物，该患者在本发明之医药组合物施用之时或在即将施用之前，正在接受高胆固醇血症治疗。例如，先前被确诊患有高胆固醇血症的患者可能在接受含有抗pcsk9抗体的医药组合物之前和/或同时，正在接受另一种处方药的稳定治疗方案。上述先前或并用治疗方案可包括，例如(1)通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶a(hmg-coa)还原酶，诱导细胞胆固醇合成耗竭的药剂，例如他汀类药物(例如，西伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等)；(2)抑制胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收的抑制剂；(3)促进脂蛋白分解代谢的药剂(如烟酸)；及/或(4)激活在胆固醇如22-羟基胆固醇的排泄过程中起作用的lxr转录因子的药剂。在某些实施方案中，在抗pcsk9抗体施用之前或同时，患者正在接受固定的治疗剂组合，如依泽替米贝加辛伐他汀；一种他汀类药物加一种胆汁树脂(例如考来烯胺、考来替泊、考来维仑)；烟酸加一种他汀类药物(例如烟酸加洛伐他汀)；或与其他降脂质药剂如ω-3脂肪酸乙酯(例如omacor)的组合。
给药方案
依照本发明的某些实施方案，可在一个规定的时程内给受试者施用多剂pcsk9抑制剂(即包含pcsk9抑制剂的医药组合物)。依照本发明这一方面的方法包括序贯给予受试者多剂pcsk9抑制剂。本文所用的“序贯给药”是指每剂pcsk9抑制剂是在例如不同日子的不同时间点，按照预定的时间间隔(例如数小时、数天、数周或数月)施予受试者。本发明包括一些方法，其包括序贯给予患者单剂初始剂量pcsk9抑制剂，之后施予一剂或多剂第二种剂量pcsk9抑制剂，然后再可选地施予一剂或多剂第三种剂量pcsk9抑制剂。
术语“初始剂量”、“第二种剂量”和“第三种剂量”是指包含pcsk9抑制剂的医药组合物各剂量给药的时间顺序。因此，“初始剂量”是指在治疗方案开始时给予的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二种剂量”是指初始剂量之后的给药剂量；“第三种剂量”是指第二种剂量之后的给药剂量。所述初始、第二和第三种剂量都可含有相同量的pcsk9抑制剂，但给药频率通常可能互不相同。但在某些实施方案中，在治疗过程中，初始、第二和/或第三种剂量所含pcsk9抑制剂的量互不相同(例如可酌情上调或下调)。在某些实施方案中，作为“负荷剂量”，在治疗方案开始时给予两个或更多个剂量(例如，2、3、4或5个剂量)，随后以较低的给药频率给予后续剂量(例如，“维持剂量“)。
依照本发明的典型实施方案，每剂第二种剂量和/或第三种剂量于其前一剂量给药后1至26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2周或以上)给药。本文所用的术语“前一剂量”是指在一系列多次给药过程中在下一剂给药之前施予患者的一剂抗原结合分子，两剂之间无其他剂量。
依照本发明这一方面的方法可以包括给患者施用任何次数的第二种剂量和/或第三种剂量pcsk9抑制剂。例如，在某些实施方案中，只施予患者一剂第二种剂量。在其他一些实施方案中，施予患者两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二种剂量。同样，在某些实施方案中，只施予患者单剂第三种剂量。在其他一些实施方案中，施予患者两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三种剂量。
在一些涉及多个第二种剂量的实施方案中，每个第二种剂量都可以与其他第二种剂量相同的频率给药。例如，每个第二种剂量可在其前一剂量给药后1至2、4、6、8周或以上施予患者。同样，在一些涉及多个第三种剂量的实施方案中，每个第三种剂量都可以与其他第三种剂量相同的频率给药。例如，每个第三种剂量可在其前一剂量给药后1至2、4、6、8周或以上施予患者。或者，施予患者第二种剂量和/或第三种剂量的给药频率可在治疗方案疗程中改变。在治疗过程中，也可以由医生在临床检查后根据个体患者的需要调整给药频率。
本发明包括包含上调滴定选项(本发明中也称为“剂量调整”)的施用方案。本文所用的“上调滴定选项”是指在接受了一定数量的pcsk9抑制剂剂量后，如果患者在一个或多个指定治疗指标方面仍未达到特定下降程度的目标，就将增加pcsk9抑制剂的剂量。例如，在每两周一次给患者施用75毫克剂量抗pcsk9抗体的治疗方案中，如果8周后(即在第0周、第2周、第4周、第6周和第8周总计施用了5个剂量)，患者仍未达到血清ldl-c水平小于70毫克/分升的目标，则将抗pcsk9抗体的剂量增加至例如之后每两周一次施用150毫克(例如，从第10周或第12周或之后开始)。
级联筛选方法
本发明还包括一些级联筛选方法，以识别患有或具有罹患常染色体显性高胆固醇血症(adh)风险的受试者。本文所用的术语“级联筛选”意为籍由追溯某种特定遗传突变的系统性家族追溯过程，识别患有或具有罹患某种遗传病症风险的个体。(参阅nedandsijbrands,ploscurr.2011,3:rrn1238)。依照本发明这一方面的方法包括：(a)识别携带某种特定pcsk9-gofm的第一例adh患者(即“源头患者”)；及(b)筛选与该源头患者有血缘关系的家族成员是否也有pcsk9-gofm。此pcsk9-gofm可以是与adh相关的任何pcsk9功能获得性突变，例如v4i、e32k、d35y、e48k、p71l、r96c、l108r、s127r、d129n、r215h、f216l、r218s、r357h、d374h、d374y、s465l或r496w。
本文所用的术语“有血缘关系的家族成员”包括与第一例患者有同一个祖先的任何人，例如一级亲属、二级亲属、三级亲属、四级亲属等。本发明之方法可包括其他筛选步骤，包括例如测量血清ldl-c、hdl-c、非hdl-c、vldl-c、载脂蛋白b100、载脂蛋白a1、甘油三酯、lp(a)及其组合的水平，以识别具有罹患adh风险的个体。标准基因测试和dna测序方法可用于筛选pcsk9-gofm。
依照本发明这一方面的方法，如果一位家庭成员有最初在源头患者身上发现的pcsk9-gofm，即可得出结论，该家族成员患有或具有罹患adh的风险。
实施例
举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的普通技术人员就如何利用和使用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非是为了限制本发明人视为其发明的范围。业已作出努力以确保所用数据(例如量、温度等)的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是指重量份数，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压强是指大气压或接近大气压。
实施例1：抗人pcsk9的人源抗体的产生
抗pcsk9的人源抗体是按照美国第8062640号专利所述而产生的。以下实施例中所用的典型pcsk9抑制剂是称为mab316p(也称为alirocumab)的人源抗pcsk9抗体。mab316p具有下列氨基酸序列的特点：含有90号序列的重链可变区(hcvr)；含有92号序列的轻链可变区(lcvr)；含有76号序列的重链互补决定区1(hcdr1)；含有78号序列的hcdr2；含有80序列的hcdr3；含有84号序列的轻链互补决定区1(lcdr1)；含有86号序列的lcdr2；及含有88号序列的lcdr3。
实施例2：确定和表征患有由前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)功能获得性突变引起的常染色体显性高胆固醇血症的患者，并与患有家族性高胆固醇血症(fh)和家族性载脂蛋白b缺陷症(fdb)的患者作比较
常染色体显性高胆固醇血症(adh)是一种常见的脂质代谢紊乱，特点为高血清ldl胆固醇(ldl-c)水平和心血管疾病的早期发作。(robinson,j.manag.carepharm.2013,19:139-149)。引起adh的最常见突变是ldl受体(ldlr；家族性高胆固醇症[fh])或其配体载脂蛋白b(apob；家族性载脂蛋白b缺陷症[fdb])突变。adh也可以由pcsk9功能获得性突变(pcsk9-gofm)引起。(seidahetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2003,100:928-933)。pcsk9gofm出现在约1％的adh患者中。目前仅报告了少数pcsk9gofm患者，而且其临床综合征的表述并不完整。
为了更好地理解pcsk9gofm的地理和家族分布及其临床表现，并与fh和fdb作比较，开展了一项回顾性横断面平行组观察队列研究。研究中对潜在研究中心进行了一项全球性调查，共联系了200家研究中心，其中180家研究中心回应，有16家研究中心做出积极回应。共有12家来自八个国家(法国、日本、挪威、葡萄牙、南非、荷兰、英国和美国)的研究中心积极参与。收集的数据包括患者的人口统计学资料、基因型(pcsk9、ldlr、载脂蛋白b、载脂蛋白e)、基线和治疗中的血脂状况、降脂治疗(llt)、是否患有黄色瘤、睑黄瘤和角膜环，以及cvd患病率和发病年龄。通过分子学测试(dna测序)确诊的pcsk9gofm患者与来自荷兰注册数据库的经分子学测试确诊的fh(n＝2126)及fdb(n＝470)患者在年龄和性别上进行了匹配。ldlr基因突变被定性为“缺陷突变”(错义、小框内插入/缺失、附加剪接位点的同义突变)或“缺失突变”(大或移框插入/缺失、无义、剪接位点、启动子突变)，并比较了相应的血脂状况。
本研究联系了世界各地200家脂质专科中心，其中法国、日本、挪威、葡萄牙、南非、荷兰、英国和美国的12家研究中心确定了164例(男83例，女81例)pcsk9gof突变患者。这些患者有16种不同的错义突变，其中6种以前未报告过，这6种以前未报告过的gofm分别是v4i、e48k、p71l、r96c、d129n和s465l。个别pcsk9gof突变一般地理分布都很局限，并仅见于少数谱系(图1a和1b)。实例包括在挪威仅见于2个谱系的22例r215h患者，以及仅见于日本的12例v4i患者和30例e32k患者(图1)。pcsk9gofm患者的汇总分析表明，未经治疗的总胆固醇和ldl胆固醇平均水平分别为359毫克/分升和272毫克/分升。11例患者有pcsk9和ldlr基因双重杂合子突变，这些患者中未经治疗的血脂水平往往比仅有相同gof突变的患者要高，这与先前报告的3位e32k双重杂合子突变患者的情况一致。
gof突变见于所有蛋白结构域及9个编码外显子中的5个(图2)，并且与不同程度的血脂异常有关(图1b)。一般而言，pcsk9gofm患者的血脂异常要比fh或fdb患者更严重，未经治疗的平均ldl-c水平在pcsk9gofm患者中最高，在fdb患者中最低(图3)。每种突变相关的未经治疗的血脂水平与全部gofm患者的血脂水平进行了比较：虽然相同基因突变的携带者之间存在显著差异，但d374y和s127r携带者血脂异常较严重，而e32k、r215h和s465l携带者的血脂异常相对较轻。
对于有可用数据的pcsk9患者，53％有黄色瘤的证据，15％有睑黄瘤的证据，22％有角膜环的证据；33％有冠状动脉疾病史；平均发病年龄为49.4(13.8)岁。pcsk9gofm患者的临床表现与cvd负担在表1a中概述。
表1a：pcsk9gofm患者的临床表现与cvd负担
ajansenetal.,arteriosclerthrombvascbiol.2005,25:1475-1481.
bfouchieretal.,seminvascmed.2004,4:259-264.
cdesauvagenoltingetal.,jinternmed.2003,253:161-168.
dhansonetal.,arteriosclerthrombvascbiol.1997,17:741-747.
与先前报告一致，pcsk9gofm患者中常见与胆固醇升高有关的物理斑(图2)，发生率与fh和fdb(家族性载脂蛋白b缺陷症)患者类似(表1a)。此外，44％的pcsk9gofm患者有心血管疾病史，这也与fh和fdb患者类似。冠状动脉疾病(cad)是最常见的表现(33％)，平均发病年龄为49.4±13.8岁(图2和表1a)。
将pcsk9gofm患者与来自荷兰高胆固醇血症注册数据库的fh和fdb患者比较，未经治疗的平均ldl胆固醇水平在pcsk9gofm患者中最高，在fdb患者中最低(表1b)。fh患者中，定性为有“缺失突变”的患者的未经治疗的ldl胆固醇水平比定性为有“缺陷突变”的患者的ldl胆固醇水平要高(表1b)。虽然降脂治疗(主要是他汀类药物)改善了pcsk9gofm患者的血脂状况，但有相当比例的患者未能达到指南规定的ldl胆固醇水平。
表1b：家族性pcsk9功能获得性突变(fgp)、家族性载脂蛋白b缺陷症(fdb)，以及定性为有ldlr“缺陷突变”或“缺失突变”的家族性高胆固醇血症(fh)患者的未经治疗的血脂状况(平均±sd)比较。
与pcsk9gof突变携带者相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。11例有pcsk9和ldlr双重杂合子突变的患者被排除在分析之外。
fh和fdb源头患者都比其家庭成员有较高的基线ldlc水平，有ldlr“缺失突变”的患者比有“缺陷突变”的患者有较高的基线ldlc水平。
虽然现有ltt(例如，他汀类药物、依泽替米贝)可以改善pcsk9gofm患者的脂质状况(图4)，但超过70％的患者没有达到ldl-c<100毫克/分升的目标，仅不到2％的患者达到<70毫克/分升的目标(图5)。
结论
pcsk9gofm导致严重的adh，并且大部分患者都未能在接受当前治疗后达到ldl-c的治疗目标。本观察研究表明pcsk9gof变体大多地理分布很有限，仅见于少数谱系，并且表现出显著的疾病严重程度相关表型变异。虽然gof突变见于整个pcsk9编码序列，但本研究证实，d374y或s127r突变携带者的未经治疗的平均ldl胆固醇水平显著高于其他所有pcsk9gof突变的携带者。gof变体的地理隔离表明其很可能来自不同人群的区域性突变。在本研究中，研究者开展了大量工作来确定荷兰和日本adh患者的遗传结构，没有发现变体重叠，支持pcsk9gof突变的地理隔离结论。
尽管各种突变引起的疾病严重程度有变异，汇总分析显示，pcsk9gofm患者的ldl胆固醇水平显著高于fh和fdb患者。fh患者遍布世界各地，导致fh的ldlr变体分布于整个基因(已报告超过1600例)，且有些突变导致的疾病严重程度更高。与此相反，fdb患者也遍布世界各地，但主要见于北欧的载脂蛋白b变体r3527q是目前最常见的原因(>95％)。在本研究中，将pcsk9gofm患者与来自荷兰家族性高胆固醇血症注册数据库(世界最大的fh资源)的fh和fdb患者进行了匹配。基于本研究的结果，可以得出结论，鉴于pcsk9gofm表型的严重程度，需要对pcsk9gofm患者进行积极的降脂治疗。
最后，本文中展示的结果表明，级联筛选是在识别了源头患者(即有特定pcsk9gofm的adh患者)后，确定其他受影响的家庭成员的有效方法。
实施例3：使用抗pcsk9单克隆抗体治疗常染色体显性遗传性高胆固醇血症伴pcsk9功能获得性突变的患者的临床试验
引言
在常染色体显性高胆固醇血症(adh)伴一个或两个pcsk9基因等位基因功能获得性突变(pcsk9-gofm)的患者中进行了一项2期临床试验，以评估抗pcsk9抗体的药效动力学和安全性。本研究使用的抗pcsk9抗体是本文称为mab316p(也称为alirocumab)的完全人源单克隆抗体。本研究的主要目的是在给adh伴pcsk9-gofm患者皮下(sc)注射mab316p的14周期间，评估mab316p对血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平的影响。研究的次要目的是评估pcsk9-gofm患者：(a)sc注射mab316p的安全性和耐受性；(b)mab316p对其他血清脂质/载脂蛋白(apo)的药效动力学效应，包括总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、非hdl-c、极低密度脂蛋白胆固醇(vldl-c)、甘油三酯(tg)、载脂蛋白100、载脂蛋白a1及载脂蛋白(a)(lp[a])；(c)多次sc注射mab316p的药代动力学(pk)特征；及(d)患者每两周一次(q2w)接受mab316p之后的免疫原性特征。
患者选择
本研究的目标人群是adh伴pcsk9gofm的男性和女性患者，年龄为18岁至70岁(包括18岁和70岁)，在筛选时已接受稳定的降脂治疗达至少28天，其血清ldl-c水平≥70毫克/分升(x0.0259毫摩尔/升)，且研究者认为未达到治疗目标。gof突变患者的定义是先前dna分析显示有一个或多个pcsk9基因突变的患者，这些突变基因编码d374y、s127r、f216l、r357h或r218spcsk9蛋白变体。也考虑将认为有可能导致某种gof表型的其他pcsk9等位基因的患者纳入本研究。共13名患者参加本研究并接受药物。
本研究的入选标准如下：(1)18岁至70岁(包括18岁和70岁)的男性和女性；(2)具有经分子学测试确诊的pcsk9gofm病史；(3)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时已接受稳定的降脂治疗达至少28天，血清ldl-c水平≥70毫克/分升(x0.0259毫摩尔/升)；研究者认为其ldl-c水平未达治疗目标。可能的降脂治疗方案包括但不限于：(i)他汀类药物，(ii)依泽替米贝，(iii)贝特类，(iv)烟酸，(v)ω-3脂肪酸及(vi)胆汁酸树脂；(4)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，身体质量指数≥18.0且≤40.0千克/平方米；(5)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，收缩压≤150毫米汞柱且舒张压≤95毫米汞柱；(6)愿意在研究期间任何连续24小时内节制饮酒不超过2杯标准酒精饮料。认为一杯标准酒精饮料相当于：12盎司啤酒、5盎司葡萄酒或1.5盎司烈酒；(7)愿意在每次研究访视前24小时内避免饮酒；(8)愿意在整个研究期间内，保持自己平时稳定的饮食和运动习惯；(9)愿意并能够遵循门诊访视及研究相关程序；及(10)提供签署的知情同意书。
本研究的排除标准如下：(1)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，禁食8至12小时后测得血清甘油三酯>350毫克/分升(x0.01129毫摩尔/升)；(2)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])前12个月内有心脏衰竭史(纽约心脏协会ii-iv级)；(3)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])前6个月内，有心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、不稳定型心绞痛、中风、外周血管疾病、短暂性脑缺血发作或心肌血运重建等病史；(4)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])前6个月内，有控制不佳、有临床意义的心脏节律异常，或有临床意义的近期心电图变化；(5)已知有活动期视神经疾病史；(6)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])前3个月内，有接受ldl血浆析离术的病史；(7)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，有控制不佳的糖尿病，糖化血红蛋白(hba1c)>8.5％；(8)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，促甲状腺激素(tsh)>1.5×正常值上限(uln)；(9)在全面筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，丙氨酸转氨酶(alt)或天冬氨酸转氨酶(ast)>2×正常值上限(uln)(允许重复1次实验室测试)；(10)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，肌酸磷酸激酶(cpk)>3×正常值上限(uln)(允许重复1次实验室测试)；(11)已知对单克隆抗体治疗过敏；(12)在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])前30天内或研究药物至少5个半衰期内(以较长者为准)，参加评估某种研究药物的临床研究；(13)已知对人类免疫缺陷病毒(hiv)、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒呈阳性；(14)在过去5年内，任何器官系统(局限性基底细胞皮肤癌除外)的恶性肿瘤史，无论是否接受了治疗或是否有局部复发或转移的证据；(15)怀孕或哺乳期妇女；(16)具有生育能力且性生活活跃，但不愿在研究期间采取充分避孕措施的男性或女性(充分避孕措施包括在筛选前2个或更多个月经周期内，坚持使用口服避孕药或其他处方避孕药；宫内节育器；双侧输卵管结扎；输精管切除；避孕套加避孕海绵、泡沫或凝胶；或阴道隔膜加避孕海绵、泡沫或凝胶)；及(17)研究者认为有可能使患者处于危险之中、干扰患者参加研究或干扰研究结果解读的任何医疗或精神状况。
研究药物与给药
本研究中使用的研究药物是mab316p，其在单次使用、1毫升预填充玻璃注射器内提供，浓度为150毫克/毫升，注射介质为10毫摩尔组氨酸(ph6.0)、0.2％(重量/体积)聚山梨醇酯20及10％(重量/体积)蔗糖。为了确保从注射器输出的剂量至少为150毫克mab316p，预填充注射器除目标剂量外还含有平均7％的溢装量(1+0.07毫升)。对照治疗使用与mab316p匹配的安慰剂，采用与mab316p同样的配方配制，但不添加抗体蛋白。
双盲治疗期间所有研究药物均于腹部皮下(sc)注射。开放标签治疗期间(见下文)所有研究药物均于腹部、大腿或上臂外侧皮下(sc)注射。
研究设计
研究设计示意图如图6所示。本研究设计包括单盲安慰剂导入期、双盲治疗期和随访期。本研究包括单盲安慰剂导入期(第-14天至第1天)的目的是确保患者在接受研究药物前已经接受稳定的每日降脂治疗。如下文详细讨论，参加研究的所有患者均接受5剂150毫克mab316psc和4剂匹配的安慰剂(图6)。参加研究的所有患者均接受4剂mab316p，每两周1次，一个月后再接受另一剂mab316p。在双盲治疗期顺利结束之后，患者获准进入开放标签治疗期，以评估sc注射mab316p降低ldl-c的长期安全性及持久性。参加研究开放标签治疗期的患者将每2周接受一剂(q2w)150毫克mab316psc，为期3年。
在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])时，评估患者是否符合参加研究的条件。在纳入研究前接受降脂治疗的患者须在筛选前接受稳定治疗达至少28天，并须继续接受降脂治疗，直至访视15(第155天)。访视15(第155天)后，研究者可根据需要改变患者的降脂治疗。
在第-14天，符合条件的所有患者均进入为期2周的单盲安慰剂导入期；并接受一剂sc注射的安慰剂。在研究第1天(基线)，所有患者均以约1:1的比率随机分入a组(6名患者)或b组(7名患者)。在研究第1天，所有患者均进入双盲治疗期并接受研究药物(mab316p或安慰剂)。随后，患者每2周回门诊一次，共22周直至第155天，以评估疗效、安全性和实验室测试。
所有患者均于第15、29、43、57、71、85及99天接受研究药物(mab316p或安慰剂)。患者于第113、127、141和155天回门诊接受随访评估。要求患者在整个研究期间保持稳定的运动水平，并在每次研究访视前48小时避免剧烈运动。在筛选时，询问患者降脂治疗的持续时间和剂量，并自访视2/第-14天开始，每次访视时询问患者降脂治疗的依从性。
在双盲治疗期，所有患者均接受总共5剂mab316p(150毫克sc)和4剂安慰剂(sc)(图1)：(i)所有患者均于第-14天接受sc安慰剂注射；(ii)在研究第1天(基线)，a组患者接受一剂mab316p，而b组患者接受一剂安慰剂；(iii)在第15、29和43天，两组(a组和b组)患者均接受mab316p；(iv)在第57天，a组患者接受安慰剂，而b组患者接受mab316p；(v)在第71天，a组患者接受mab316p，而b组患者接受安慰剂；(vi)在第85天，a组患者接受安慰剂，而b组患者接受mab316p；(vii)在第99天，a组和b组的患者均接受安慰剂；及(viii)所有患者均在第113、127、141及155天返回进行随访访视。
在第1天(基线)及自第15天起每次门诊访视时，均采集血液样本进行pk分析。在预定的时间点，还采集血液样本进行抗药物抗体水平分析。
开放标签扩展期
所有顺利完成访视15(第155天)评估的患者均有资格进入自访视16(第211天)起直至访视37(研究结束)的开放标签治疗期。在开放标签治疗期间，自访视17(第32周)起直至访视36(研究结束)，所有患者均将接受sc注射mab316p150毫克，每2周一次(±3天)。患者将于访视16(第211天)、访视17(第32周)、访视18(第34周)、访视19(第36周)、访视20(第40周)、访视21(第44周)、访视22(第48周)时来门诊，然后自访视23(第56周)起直至访视36(治疗结束)每12周回门诊一次。患者将在接受最后一剂研究药物后70天后回门诊进行研究结束访视(访视37)。在开放标签治疗期间，患者将接受自行注射mab316p的培训。
在开放标签治疗期间，在研究期间连续2次实验室评估都达到ldl-c水平计算值<25毫克/分升(0.65毫摩尔/l)的患者将按照预定方案进行监测和管理。若连续2次ldl-c计算值<25毫克/分升(0.65毫摩尔/l)，将通知研究者。这一患者人群中mab316p的疗效将通过临床实验室脂质水平测试进行评估。这一患者人群中mab316p的安全性将通过评估治疗前后发生的不良事件(ae)，基于详细病史、全面体检、生命体征、体重、心电图(ecg)及临床实验室测试来评定。盲化的安全性数据将由安全性监控团队(smt)进行持续评估。将从患者签署知情同意书(icf)起至访视37(研究结束)期间收集伴随用药信息。
样本分析和患者程序
从筛选访视(访视1[第-28至-15天])起，在每次门诊访视时均采集禁食后血液样本(禁食8至12小时后)。实验室血脂全项测试包括测量hdl-c、非hdl-c、ldl-c(以超速离心法测量，以freidwald方程估算)、vldl-c、总胆固醇、甘油三酯、载脂蛋白a1、载脂蛋白b100、载脂蛋白b100/a1比率及lp(a)。在抽取实验室血液样本的各访视日，抽血后注射研究药物。
此外，在筛选访视(访视1[第-28至-15天])、访视2(第-14天)、第1天(基线)、第15、29、43、57、71、85、99、113、155天、访视16(第211天)、访视17(第32周)、访视18(第34周)、访视19(第36周)、访视21(第44周)、从访视23(第56周)直至访视35(第200周)的研究访视、访视36(治疗结束)、访视37(研究结束)或提前终止研究时，采集血清样本进行全套血液生化测试。血液生化测试包括：钠、氯化钾、碳酸氢钙、葡萄糖、肌酐、白蛋白、总蛋白、血尿素氮、ast、alt、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、总胆红素、总胆固醇、尿酸、肌酸磷酸激酶及γ-谷氨酰转肽酶。
在筛选访视(访视1[第-28至-15天])、第1天(基线)、第15、29、43、57、71、85、99、113、155天、访视16(第211天)、访视17(第32周)、访视18(第34周)、访视19(第36周)、访视21(第44周)、从访视23(第56周)直至访视36(治疗结束)的研究访视，以及访视37(研究结束)或提前终止研究时，采集血液样本进行血液学测试。血液学测试包括血红蛋白、血细胞比容、红细胞、白细胞、红细胞指数、血小板计数，以及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞血细胞分类计数。
除了访视2(第-14天)以外，在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])起直至第155天的所有访视时，还采集血液样本进行肌钙蛋白i水平评估。此外，在筛选访视(访视1[第-28天至第-15天])、第15天、第155天、从访视21(第44周)直至访视36(治疗结束)的所有研究访视，以及访视37(研究结束)或提前终止访视时，还采集尿液样本进行尿液分析。尿液分析项目包括：颜色、透明度、ph值、比重、酮类、蛋白质、葡萄糖、血细胞、胆红素、白细胞酯酶、硝酸盐、白细胞、红细胞、透明管型及其他管型、细菌、上皮细胞、晶体及酵母菌。
在研究过程中进行的其他实验室测试包括妊娠测试(针对所有具有生育能力的女性)、hs-crp水平(在第-14、1、15、43、71、99、127、155天、访视16[第211天]、从访视22[第48周]起直至访视36[治疗结束]每隔一次访视、访视37[研究结束]或提前终止访视时采集)和pcsk9水平(从筛选访视[访视1{第-28至-15天}]起直至访视15[第155天]期间，所有门诊访视时采集)。
结果
共有13名患者参加了本研究。6名患者被分配至a组(在第1、15、29、43和71天接受mab316p，在第-14、57、85和99天接受安慰剂)，7名患者被分配至b组(在第15、29、43、57和85天接受mab316p，在第-14、1、71和99天接受安慰剂)(见图1)。所有患者均完成了双盲治疗期(至第99天)。有7名患者完成了随访期(至第155天)，其中a组3名，b组4名。6名患者同意参加开放标签治疗期，a组2名，b组4名。参加研究的患者的人口统计学和基线特征如表2所示。
表2：人口统计学和基线特征概要
基线疾病特征的概要如表3所示。
表3：基线疾病特征的概要
表4-17概括了研究过程中两个治疗组胆固醇水平和其他实验指标的变化。
表4：第15天时以常规单位表示的ldl-c测量值：协方差分析
表5：达到ldl-c测量值自基线下降30％的患者比例
表6：第15天时以常规单位表示的载脂蛋白b100：协方差分析
表7：第15天时以常规单位表示的非hdl-c：协方差分析
表8：第15天时以常规单位表示的总胆固醇：协方差分析
表9：第15天时载脂蛋白b100/载脂蛋白a1比率：协方差分析
表10：第15天时以常规单位表示的ldl-c计算值：协方差分析
表11：第15天时以常规单位表示的hdl-c：协方差分析
表12：第15天时以常规单位表示的vldl-c：协方差分析
表13：第15天时以常规单位表示的载脂蛋白a1：协方差分析
表14：第15天时以常规单位表示的tg：基于秩的协方差分析
表15：第15天时以常规单位表示的lp(a)：基于秩的协方差分析
在上述各表中(表3-14)，[1]表示p值是通过单样本t检验得到的。*、**及***p值分别在0.05、0.01和0.001水平具有统计学意义。
研究过程中ldl-c水平的变化概括在表16中。
表16：在各时间点ldl-c水平自基线的变化[数值表达为平均ldl-c毫克/毫升(sd)]
表17：mab316p治疗8周后a、b组患者合并的血脂指标
所有13名患者第8周时血脂水平(ldl-c、载脂蛋白b、tg、hdl-c、载脂蛋白a1和lp(a))自基线的百分比变化概括在图7中。不同治疗组和各种gofm人群ldl-c和游离pcsk9水平的变化显示在图8-11中。
总结/结论
参加本研究的患者(平均年龄44.6岁，基线时平均ldl-c为127.9毫克/分升)携带四种不同的pcsk9gof突变(l108r、s127r、r218s和d374y)。所有患者均完成了本研究的双盲期(至第14周)和安全性随访期(至第22周)。
本研究显示，施用mab316p后显著降低了所有参加研究的pcsk9gofm患者的ldl胆固醇水平，而且此结果与游离pcsk9的降低有时间相关性。通过采用新的包括随机安慰剂导入期的设计，可以收集每名患者的安全性和疗效数据，同时仍然可以比较mab316p和安慰剂。在试验为期2周的安慰剂对照部分，施用mab316p后也显著降低了载脂蛋白b和甘油三酯的水平。特别是，在第2周，ls自基线的平均下降(mab316p对比安慰剂)为：ldl-c53.7％、载脂蛋白b49.6％、非hdl-c49.4％、总胆固醇30.7％、载脂蛋白b/载脂蛋白a1比率0.30(p值均≤0.002)。alirocumab治疗8周后，针对所有受试者的事后汇总分析也显示了有统计学意义的lp(a)和极低密度胆固醇水平下降。此外，治疗一般具有很好的耐受性。
虽然所有突变携带者都对治疗有反应，但我们的研究结果表明，携带不同gof突变的患者中ldl胆固醇降低的速度可有所差异，这可能与alirocumab给药后游离pcsk9水平降低的速率相关。
本研究证实mab316p有望成为由pcsk9功能获得性突变引起常染色体显性高胆固醇血症的患者的治疗选项。
本发明之范围将不受本文所述特定实施方案的限制。实际上，除了本文所述的实施方案外，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，基于上述说明和附图，本发明之各种修改形式也将变得明显。这些修改形式也属于所附的权利要求范围。
本发明的技术方案：
1.治疗常染色体显性高胆固醇血症(adh)的方法，其中该方法包括选择在pcsk9基因的一个或两个等位基因中携带功能获得性突变(gofm)的患者，并给患者施用含有pcsk9抑制剂的医药组合物。
2.如技术方案第1项所述之方法，其中所述gofm编码含有氨基酸替换的pcsk9变体蛋白，该氨基酸替换选自由v4i、e32k、d35y、e48k、p71l、r96c、l108r、s127r、d129n、r215h、f216l、r218s、r357h、d374h、d374y、s465l及r496w组成的一组突变。
3.如技术方案第1项所述之方法，其中所述gofm编码含有氨基酸替换的pcsk9变体蛋白，该氨基酸替换选自由s127r、f216l、r218s、r357h及d374y组成的一组突变。
4.如技术方案第1至3项中任何一项所述之方法，其中在所述含有pcsk9抑制剂的医药组合物施用之前，根据血浆ldl-c水平高于或等于约70毫克/分升而进一步选择患者。
5.如技术方案第1至4项中任何一项所述之方法，其中所述患者在所述含有pcsk9抑制剂的医药组合物施用之时和/或之前，正在接受背景降脂治疗。
6.如技术方案第5项所述之方法，其中所述背景降脂治疗选自由他汀类药物、依泽替米贝、贝特类、烟酸、ω-3脂肪酸以及胆汁酸树脂治疗组成的一组降脂治疗。
7.如技术方案第1至6项中任何一项所述之方法，其中在所述含有pcsk9抑制剂的医药组合物施用之前，根据身体质量指数(bmi)大于18.0千克/平方米而进一步选择患者。
8.如技术方案第1至7项中任何一项所述之方法，其中所述pcsk9抑制剂是与pcsk9特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
9.如技术方案第8项所述之方法，其中所述医药组合物包含20毫克至200毫克所述pcsk9抑制剂。
10.如技术方案第9项所述之方法，其中所述医药组合物包含50毫克至150毫克所述pcsk9抑制剂。
11.如技术方案第10项所述之方法，其中所述医药组合物包含50毫克所述pcsk9抑制剂。
12.如技术方案第10项所述之方法，其中所述医药组合物包含75毫克所述pcsk9抑制剂。
13.如技术方案第10项所述之方法，其中所述医药组合物包含100毫克所述pcsk9抑制剂。
14.如技术方案第10项所述之方法，其中所述医药组合物包含150毫克所述pcsk9抑制剂。
15.如技术方案第8至14项中任何一项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含hcvr/lcvr氨基酸序列对的重链和轻链cdr，该hcvr/lcvr氨基酸序列对选自序列对90/92和218/226。
16.如技术方案第15项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有序列号220、222、224、228、230和232的重链和轻链cdr氨基酸序列。
17.如技术方案第16项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有序列号为218的氨基酸序列的hcvr及含有序列号为226的氨基酸序列的lcvr。
18.如技术方案第15项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含序列号为76、78、80、84、86和88的重链和轻链cdr氨基酸序列。
19.如技术方案第18项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有序列号为90的氨基酸序列的hcvr及含有序列号为92的氨基酸序列的lcvr。
20.如技术方案第8项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段和包含重链和轻链cdr氨基酸序列的抗体与pcsk9上的同一表位结合，该重链和轻链cdr氨基酸序列的具有序列号220、222、224、228、230和232；或76、78、80、84、86和88。
21.如技术方案第8项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在与pcsk9结合时，与包含重链和轻链cdr氨基酸序列的抗体竞争，该重链和轻链cdr氨基酸序列具有序列号220、222、224、228、230和232；或76、78、80、84、86和88。
22.如技术方案第8项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在与pcsk9结合时显示ph依赖性特征。
23.如技术方案第22项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在中性ph条件下与pcsk9的结合亲和力比在酸性ph条件下为高。
24.治疗常染色体显性高胆固醇血症(adh)的治疗方案，其中所述治疗方案包括选择在pcsk9基因的一个或两个等位基因中携带功能获得性突变(gofm)的患者，并给患者施用多剂含有pcsk9抑制剂的医药组合物，其中所述药剂以选自以下一组频率的给药频率施予患者：每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每六周一次、每八周一次、每十周一次及每十二周一次。
25.如技术方案第24项所述之方法，其中所述gofm编码含有氨基酸替换的pcsk9变体蛋白，该氨基酸替换选自由v4i、e32k、d35y、e48k、p71l、r96c、l108r、s127r、d129n、r215h、f216l、r218s、r357h、d374h、d374y、s465l及r496w组成的一组突变。
26.如技术方案第24项所述之方法，其中所述gofm编码含有氨基酸替换的pcsk9变体蛋白，该氨基酸替换选自由s127r、f216l、r218s、r357h及d374y组成的一组突变。
27.如技术方案第24至26项中任何一项所述之方法，其中在所述含有pcsk9抑制剂的医药组合物施用之前，根据血浆ldl-c水平高于或等于约70毫克/分升而进一步选择患者。
28.如技术方案第24至27项中任何一项所述之方法，其中所述患者在所述含有pcsk9抑制剂的医药组合物第一次施用之时和/或之前，正在接受背景降脂治疗。
29.如技术方案第28项所述之方法，其中所述背景降脂治疗选自由他汀类药物、依泽替米贝、贝特类、烟酸、ω-3脂肪酸以及胆汁酸树脂治疗组成的一组降脂治疗。
30.如技术方案第24至29项中任何一项所述之方法，其中在所述含pcsk9抑制剂的医药组合物第一次施用之前，根据身体质量指数(bmi)大于18.0千克/平方米而进一步选择患者。
31.如技术方案第24至30项中任何一项所述之方法，其中所述pcsk9抑制剂是与pcsk9特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
32.如技术方案第31项所述之方法，其中所述医药组合物包含20毫克至200毫克所述pcsk9抑制剂。
33.如技术方案第32项所述之方法，其中所述医药组合物包含50毫克至150毫克所述pcsk9抑制剂。
34.如技术方案第33项所述之方法，其中所述医药组合物包含50毫克所述pcsk9抑制剂。
35.如技术方案第33项所述之方法，其中所述医药组合物包含75毫克所述pcsk9抑制剂。
36.如技术方案第33项所述之方法，其中所述医药组合物包含100毫克所述pcsk9抑制剂。
37.如技术方案第33项所述之方法，其中所述医药组合物包含150毫克所述pcsk9抑制剂。
38.如技术方案第31至37项中任何一项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含hcvr/lcvr氨基酸序列对的重链和轻链cdr，该hcvr/lcvr氨基酸序列对选自序列对90/92和218/226。
39.如技术方案第38项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有序列号220、222、224、228、230和232的重链和轻链cdr氨基酸序列。
40.如技术方案第39项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有序列号为218的氨基酸序列的hcvr及含有序列号为226的氨基酸序列的lcvr。
41.如技术方案第38项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有序列号76、78、80、84、86和88的重链和轻链cdr氨基酸序列。
42.如技术方案第41项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有序列号为90的氨基酸序列的hcvr及含有序列号为92的氨基酸序列的lcvr。
43.如技术方案第31项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段和包含重链和轻链cdr氨基酸序列的抗体与pcsk9上的同一表位结合，该重链和轻链cdr氨基酸序列具有序列号220、222、224、228、230和232；或76、78、80、84、86和88。
44.如技术方案第31项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在与pcsk9结合时，与包含重链和轻链cdr氨基酸序列的抗体竞争，该重链和轻链cdr氨基酸序列具有序列号220、222、224、228、230和232；或76、78、80、84、86和88。
45.如技术方案第31项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在与pcsk9结合时显示ph依赖性特征。
46.如技术方案第45项所述之方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在中性ph条件下与pcsk9的结合亲和力比在酸性ph条件下为高。
47.级联筛选方法，用于识别患有常染色体显性高胆固醇血症(adh)或有罹患adh风险的受试者，该方法包括：(a)识别携带某种特定pcsk9功能获得性突变(pcsk9-gofm)的第一例adh患者；及(b)筛选与该第一例患者有血缘关系的家族成员是否也有pcsk9-gofm；其中根据一名或多名有血缘关系的家族成员中存在pcsk9-gofm而确定这些家族成员患有adh或有罹患adh的风险。
48.如技术方案第47项所述之方法，其中所述pcsk9-gofm选自由v4i、e32k、d35y、e48k、p71l、r96c、l108r、s127r、d129n、r215h、f216l、r218s、r357h、d374h、d374y、s465l及r496w组成的一组突变。
序列表
<110>瑞泽恩制药公司
<120>伴pcsk9功能获得性突变的常染色体显性高胆固醇血症的治疗方法
<130>7007a-wo
<140>待指定
<141>随同申请
<150>61/828,730
<151>2013-05-30
<150>61/889,553
<151>2013-10-11
<150>61/901,212
<151>2013-11-07
<160>765
<170>用于windows4.0版的fastseq软件
<210>1
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151015
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202530
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serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr
202530
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202530
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202530
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serser
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151015
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202530
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151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr
202530
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151015
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151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr
202530
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354045
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151015
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lys
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151015
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65707580
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serser
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151015
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lys
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202530
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ileserglyserglyglythrthr
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aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly
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202530
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505560
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65707580
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gluargalathrleusercysargalaserglnservalasnasnlys
202530
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gluargalathrleusercysargalaserglnservalasnasnlys
202530
pheleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu
354045
iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser
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151015
servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr
202530
alailesertrpvalargglnvalproglyglnglyleuglutrpmet
354045
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15
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151015
gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisile
202530
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505560
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15
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202530
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202530
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151015
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202530
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354045
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15
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<220>
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151015
xaaxaaxaaxaa
20
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>变体
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xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa
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1
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alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
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leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
115120125
lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys
130135140
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp
145150155160
tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu
165170175
gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu
180185190
hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn
195200205
lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly
210215220
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspglu
225230235240
leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
245250255
proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn
260265270
asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe
275280285
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330
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<211>327
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<220>
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<400>752
alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg
151015
serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
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leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrlysthr
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tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys
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argvalgluserlystyrglyproprocysprosercysproalapro
100105110
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