磷酸萘酚喹在制备治疗病毒引起的疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，具体的涉及磷酸萘酚喹在用于制备治疗病毒引起的疾病的药物中的应用。
背景技术：
：磷酸萘酚喹由国家军事科学院微生物流行病研究所研发，是继青蒿素类药物之后的一种抗疟药物。1993年，磷酸萘酚喹片在我国注册，获得中国卫生部颁发的一类新药证书。临床研究表明磷酸萘酚喹对各种疟原虫红细胞期内无性体均有较强的杀灭作用，是治疗恶性疟疾和间日疟的首选药物，而且具有很好的防治作用。冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜、基因组为线性单股正链的rna病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。2019新型冠状病毒(2019-ncov)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov(引发重症急性呼吸综合征)和mers-cov(引发中东呼吸综合征)。目前尚无针对2019-ncov病原体的有效抗病毒药物，以隔离治疗、对症支持治疗为主。因此临床上急需抗2019-ncov的药物上市。截至目前为止，未见磷酸萘酚喹用于制备治疗病毒引起的疾病的药物中应用的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种磷酸萘酚喹的制药新用途。进一步的，本发明的目的是提供磷酸萘酚喹在制备治疗病毒引起的疾病的药物中的用途。进一步的，其中所述的病毒为冠状病毒。具体的来说，所述的冠状病毒包括sas-cov、mers-cov、hcov-229、hcov-oc43和2019-ncov。磷酸萘酚喹为在我国已经获得批准上市的药物，其产品可以在市场中购得。本发明人在体外进行的病毒抑制试验结果表明，磷酸萘酚喹对2019-ncov、hcov-229和hcov-oc43有很好的抑制作用，效果明显优于磷酸氯喹。以下通过实施例的的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1、磷酸萘酚喹对vero细胞的细胞毒性的mts测定结果。图2、磷酸氯喹对vero细胞的细胞毒性的mts测定结果。图3、磷酸萘酚喹在vero细胞上抑制病毒感染的定量rt-pcr检测结果。图4、磷酸氯喹在vero细胞上抑制病毒感染的定量rt-pcr检测结果。图5、药物在vero细胞与病毒共处理后抑制病毒感染的定量rt-pcr检测结果。图6、药物在病毒进入vero细胞前后抑制病毒感染的定量rt-pcr检测结果。具体实施方式实验例1磷酸萘酚喹体外抗2019-ncov活性研究一建立2019-ncov感染的veroe6细胞(atcc-1586)模型，分为磷酸萘酚喹组和磷酸氯喹组，采用rt-pcr法通过检测细胞上清液中病毒复制数量来判断药物对2019-ncov的抑制活性(ec50)，结果见表1。表1磷酸萘酚喹对2019-ncov病毒复制的抑制活性药物ec50磷酸萘酚喹组0.89μm磷酸氯喹组1.2μm表1结果表明，在2019-ncov感染的veroe6细胞模型上，磷酸氯喹对2019-ncov的半数有效浓度ec50为1.2μm，；磷酸萘酚喹的ec50为0.89μm，说明磷酸萘酚喹对2019-ncov的抑制活性明显优于磷酸氯喹，具有显著的统计学意义(p<0.05)。实验例2磷酸萘酚喹体外抗2019-ncov活性研究二1实验目的研究磷酸萘酚喹在vero细胞内对新型冠状病毒(2019-ncovbetacov/beijing/amms01/2020)的抑制作用，采用mts法(promega)测定磷酸萘酚喹药物的cc50；采取核酸定量法测定药物对新型冠状病毒(2019-ncovbetacov/beijing/amms01/2020)的抑制作用(ec50)。并以磷酸氯喹作为参考。2实验材料磷酸萘酚喹，四川自豪时代药业有限公司生产，批号170401；磷酸氯喹：sigma公司产品，批号bcbj1498v。vero细胞购自美国标准生物品收藏中心(atcc)，由军事医学研究院微生物流行病研究所病毒学研究室保存。新型冠状病毒北京分离株(2019-ncovbetacov/beijing/amms01/2020)由军事医学研究院微生物流行病研究所病毒学研究室分离并保存。其余实验耗材和仪器均可由市场自由购得。3实验方法(1)采用mts法测定药物的cc50a、vero细胞培养：在75cm2培养瓶中加入dmem完全培养基12ml，于5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中37℃培养，3天传代一次。传代时移除旧培养基，用pbs洗细胞1次，加入2ml0.25％胰酶-edta在培养箱中消化3min。光学显微镜下观察到细胞变圆，弃去胰酶，然后加入9ml培养基终止消化，用移液管将细胞吹吸成单细胞，按1：3的比例取出细胞液加入新的培养瓶，再在新的培养瓶中补加新的培养基至12ml，混匀，于37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。b、病毒扩大培养：实验前一天，将vero细胞按1：3的比例接种至t75的培养瓶中，待细胞密度长至90％以上时供实验用。向t75培养瓶中加入moi＝0.1的新型冠状病毒液，在37℃、5％co2的培养箱中孵育1hr。向培养瓶中加入15ml2％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中培养3天。将病毒液收集至50ml离心管，在4℃离心机6000rpm离心10min，收集上清，分装并保存于-80℃。c、病毒tcid50测定：提前一天将vero细胞以10000/孔浓度接种96孔板。用含2％fbs的dmem培养基10倍梯度稀释病毒液(10-2～10-9)。将96孔板中的原细胞培养基吸弃，向96孔板中加入200μl/孔的病毒液，设4个复孔。于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育。每天观察细胞病变(cpe)，持续观察4天。用reed-muench法计算病毒半数感染剂量(tcid50)。d、药物细胞毒性试验：提前一天将vero细胞以10000/孔浓度接种96孔板。待细胞长满单层，96孔板弃去培养液，加入含不同浓度药物，以3倍为稀释梯度将待测药物进行倍比稀释，共8个浓度)的2％fbsdmem维持液100μl/孔，每个浓度测3个复孔。并设立培养液对照和正常细胞对照组。继续培养，每天观察细胞状态。加药后72小时，加入20μlmts溶液，37℃，5％co2条件孵育1小时，测定od490值。采用公式计算药物对细胞毒性：最后，利用graphpadprism7软件对数据进行s拟合分析，计算出药物的cc50。(2)采取核酸定量法测定药物的ec50全时段感染：提前一天将vero细胞以40000/孔浓度接种48孔板。吸弃细胞培养上液，加入不同浓度的磷酸萘酚喹(20μl/孔)，每个药物3复孔，37℃预处理1小时，然后每空补加100tcid50病毒液，并设立阳性药物对照(磷酸氯喹)、病毒对照和正常细胞对照组，放置37℃，5％co2孵箱培养。吸弃病毒液，加入含不同浓度药物的2％fbsdmem维持液200μl/孔，放置37℃，5％co2孵箱培养。每天观察细胞病变(cpe)。在感染2天后，每孔取50μl细胞上清提取核酸，用定量rt-pcr检测病毒载量。利用graphpadprism7软件，通过拟合剂量-反应曲线计算50％有效浓度(ec50)。药物与病毒共感染：提前一天将vero细胞以10000/孔浓度接种96孔板。用2％fbs的dmem维持液将药物配制成8个浓度。弃细胞培养上清，加入不同浓度的磷酸萘酚喹(100μl/孔)，每个药物4复孔，然后每孔补加100tcid50病毒液，并设立阳性药物对照(磷酸氯喹)、病毒对照和正常细胞对照组，放置37℃5％co2孵箱培养。在感染后2天，每孔取50μl细胞上清提取核酸，使用定量rt-pcr检测病毒载量，利用graphpadprism7软件，通过拟合剂量-反应曲线计算50％有效浓度(ec50)。磷酸萘酚喹抑制新型冠状病毒作用时间点研究：为了研究磷酸萘酚喹是在病毒感染的哪个阶段发挥抗病毒作用，采用不同时段给药的方式进行研究，采取核酸定量法测定药物的有效性。①全时段给药(预防+治疗)：vero细胞用10μm的药物预处理1h，然后每孔补加100tcid50病毒，放置37℃5％co2孵箱感染2h，吸弃病毒液，用pbs洗3次，加入含10μm药物的2％fbsdmem维持液(200μl/孔)，放置37℃5％co2孵箱继续培养2天，每孔取50μl细胞上清提取核酸，用定量rt-pcr检测病毒载量。②病毒感染前给药(预防作用)：vero细胞用10μm的药物预处理1h，然后每孔补加100tcid50病毒，放置37℃5％co2孵箱感染2h，吸弃病毒液，用pbs洗3次，加入不含药物的2％fbsdmem维持液(200μl/孔)，放置37℃5％co2孵箱继续培养2天，每孔取50μl细胞上清提取核酸，用定量rt-pcr检测病毒载量。③感染后给药(治疗作用)：vero细胞加入100tcid50病毒，放置37℃5％co2孵箱感染2h，吸弃病毒液，用pbs洗3次，加入含10μm药物的2％fbsdmem维持液(200μl/孔)，放置37℃5％co2孵箱继续培养2天，每孔取50μl细胞上清提取核酸，用定量rt-pcr检测病毒载量。病毒核酸提取：采用qiagen公司的qiaampviralrnaminikit提取细胞上清中的病毒核酸。生物安全柜内吸取560μl包含载体rna的avl缓冲液(核酸提取裂解液)至1.5ml的离心管中，然后吸取100μl不同浓度药物处理的细胞培养上清(枪头弃于含75％乙醇消毒液收集器中)，加入上述的avl缓冲液中，脉冲涡旋式混匀15秒，室温孵育10分钟，简单离心使离心管顶端液体落到底部；在样品中加入490μl无水乙醇，混匀15秒，简单离心；小心将630μl液体加入未浸湿的qiaamp小柱中，盖好盖，离心8000rpm/min、1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上；打开qiaamp小柱的盖子，重复步骤4，直至样品全部离心；打开盖子，向柱中加入500μlaw1缓冲液，盖好盖，离心8000rpm/min、1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上；打开盖子，加入500μlaw2缓冲液，盖好盖，离心14000rpm/min、3min；将柱子置于一新的2ml收集管上，空离1min；将柱子置于一新的1.5ml离心管上，加入60μlave洗脱缓冲液，室温静置1min，离心8000rpm/min、1min。离心液即为病毒rna，立即检测或-80℃以下保存。荧光定量rt-pcr检测病毒核酸载量：采用takara公司的onesteprt-pcrkit(rr064a)进行定量rt-pcr检测。20μl反应体系如下表2：表2荧光定量rt-pcr检测体系将20μl反应液加入罗氏适配器96孔板(lightcycler480multiwellplate96，04729692001)中，3000rpm/min，低速离心30s后放入roche公司的lightcycler480ⅱ定量pcr仪中进行扩增，反应条件：42℃反转录5min，95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火20s，扩增40个循环，每个循环反应结束时收集荧光信号。依据病毒rna拷贝数和ct值的换算公式：rnacopies/ml＝ct*(-0.3)+13.17，计算病毒rna载量。利用graphpadprism7软件，通过拟合剂量-反应曲线计算50％有效浓度(ec50)。(3)计算选择指数si＝cc50/ec50。4实验结果(1)病毒tcid50滴定用倒置显微镜观察新型冠状病毒对vero细胞的致细胞病变(cpe)作用，采用reed-muench法计算病毒半数感染剂量(tcid50)。结果显示，该病毒在vero细胞上的tcid50滴度为log105.4/ml(表3)。表3、新型冠状病毒在vero细胞上的tcid50滴度(2)药物对细胞毒性试验(mts法)①磷酸萘酚喹采用mts法测定了不同浓度的磷酸萘酚喹对vero细胞的细胞毒性，并计算药物的半数毒性浓度(cc50)。结果如图1所示，磷酸萘酚喹对vero细胞的cc50＝13.50μm。②磷酸氯喹采用mts法测定了不同浓度的磷酸氯喹对vero细胞的细胞毒性，并计算药物的半数毒性浓度(cc50)。结果如图2所示，磷酸氯喹对vero细胞的cc50＝76.58μm。(3)药物对新型冠状病毒的抑制作用(ec50)①全时段感染磷酸萘酚喹对新型冠状病毒的抑制作用(ec50)：采用核酸定量法测定磷酸萘酚喹在细胞水平抑制新型冠状病毒(2019-ncovbetacov/beijing/amms01/2020)效果，并计算药物的ec50，两次重复的结果都显示，磷酸萘酚喹在细胞水平对2019-ncov新型冠状病毒具有抑制作用，其ec50为2.01μm(图3)。磷酸氯喹对新型冠状病毒的抑制作用(ec50)：采用核酸定量法测定磷酸氯喹在细胞水平抑制新型冠状病毒(2019-ncovbetacov/beijing/amms01/2020)效果，并计算药物的ec50。结果显示，磷酸氯喹在细胞水平对2019-ncov新型冠状病毒具有抑制作用，其ec50为5.85μm(图4)。②药物和病毒共感染将药物和病毒同时加入vero细胞，感染2天后采用核酸定量法测定药物在细胞水平抑制新型冠状病毒效果，并计算药物的ec50。结果显示，磷酸萘酚喹和磷酸氯喹在细胞水平对新型冠状病毒都具有抑制作用，，磷酸萘酚喹ec50为0.39μm；磷酸氯喹为0.68μm(图5)。③磷酸萘酚喹抑制新型冠状病毒作用时间点研究为了研究磷酸萘酚喹是在病毒感染的哪个阶段发挥抗病毒作用，采用不同时段给药的方式进行处理，采取核酸定量法测定药物抑制作用。结果显示，与磷酸氯喹的作用时间点相似，磷酸萘酚喹也能在病毒进入vero细胞前后均效抑制病毒感染。且在相同摩尔浓度下，磷酸萘酚喹的抑制效果也优于磷酸氯喹(图6)。(4)计算选择指数si根据cc50和ec50值，计算选择指数si(cc50/ec50)。结果显示，磷酸萘酚喹在细胞水平对2019-ncov新型冠状病毒的选择指数为6.72(全时段感染)和34.61(共感染)，阳性对照磷酸氯喹在细胞水平对2019-ncov新型冠状病毒的选择指数为13.09(全时段感染)和112.61(共感染)，见表4。表4磷酸萘酚喹和磷酸氯喹对vero细胞的细胞毒性以及病毒抑制结果5结论在本实验条件下，磷酸萘酚喹在vero细胞中对2019-ncov新型冠状病毒具有明显的抑制作用，ec50为2.01μm(全时段感染)和0.39μm(共感染)，cc50为13.5μm，si为6.72(全时段感染)和34.61(共感染)。磷酸萘酚喹在vero细胞中对2019-ncov新型冠状病毒的抑制作用明显优于对照药物磷酸氯喹(ec50全时段感染时为5.85μm，共感染时为0.68μm)。药物在病毒进入vero细胞前后抑制病毒感染的定量rt-pcr检测结果显示，与磷酸氯喹的作用时间点相似，磷酸萘酚喹也能在病毒进入vero细胞前后均效抑制病毒感染。且在相同摩尔浓度下，磷酸萘酚喹的抑制效果也优于磷酸氯喹。实验例3磷酸萘酚喹抗hcov-229e冠状病毒活性研究1实验目的评价磷酸萘酚喹在细胞水平对hcov-229e冠状病毒的抑制效果。2实验材料磷酸萘酚喹(批号：170301-1)，由四川自豪时代药业有限公司提供，含量或纯度：99.0％；利巴韦林注射液：购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，批号为31712252，规格为100mg/ml，用时稀释至所需浓度，4℃冰箱保存。磷酸氯喹(批号：bcbj1498v)，sigma公司；传代人肝癌细胞huh7细胞：由军事医学科学院微生物流行病研究所保存；hcov-229e于huh7.5细胞中传代，保存于-80℃冰箱。3实验方法(1)cpe法测定毒性：实验在传代huh7细胞中进行，正常培养细胞加不同浓度待测药物48小时，用cpe法测定药物对细胞的半数有毒浓度(tc50)，实验重复2批。(2)cpe法测定抗病毒药效：实验在传代huh7细胞中进行，细胞1.5×104个/孔接种于96孔板中，过夜培养后以100tcid50的冠状病毒液感染细胞，待测药物用培养液稀释，于感染同时给药进行测定，待测药物以三倍稀释8个剂量的样品进行实验，每个计量设2个平行孔，待病毒对照组病变达4+号时观察结果，记录并用reed-muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(ic50)，并计算选择指数si＝tc50/ic50。(3)cpe评价标准：以细胞死亡比例分别标记为4+(细胞死亡比例75％～100％)、3+(50％～75％)、2+(25％～50％)、1+(0％～25％)、0+(细胞全部存活)。4结果在huh7细胞中，cpe法测定磷酸萘酚喹对hcov-229e的ic50为1.24±0.87μg/ml，选择指数si为5.6；阳性对照利巴韦林对对hcov-229e的ic50为3.77±1.36μg/ml，选择指数si为26.5；磷酸氯喹对hcov-229e的ic50为4.51±3.75μg/ml，选择指数si为8.2。5结论在本实验条件下，磷酸萘酚喹对hcov-229e感染所致的细胞病变cpe有抑制作用。实施例4磷酸萘酚喹抗hcov-oc43冠状病毒体外活性研究1实验目的评价磷酸萘酚喹在细胞水平对hcov-oc43冠状病毒的抑制效果。2实验材料磷酸萘酚喹(批号：170301-1)，由四川自豪时代药业有限公司提供；利巴韦林注射液：购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，批号为31712252，规格为100mg/ml，用时稀释至所需浓度，4℃冰箱保存。磷酸氯喹(批号：bcbj1498v)，sigma公司；传代人肺癌细胞h460细胞：由军事医学科学院微生物流行病研究所保存；hcov-oc43于hct-8细胞中传代，保存于-80℃冰箱。3实验方法(1)cpe法测定毒性：实验在传代h460细胞中进行，正常培养细胞加不同浓度待测药物72小时，用cpe法测定药物对细胞的半数有毒浓度(tc50)，实验重复2批。(2)cpe法测定抗病毒药效：实验在传代h460细胞中进行，细胞1.5×104个/孔接种于96孔板中，过夜培养后以100tcid50的冠状病毒液感染细胞，待测药物用培养液稀释，于感染同时给药进行测定，待测药物以三倍稀释8个剂量的样品进行实验，每个计量设2个平行孔，待病毒对照组病变达4+号时观察结果，记录并用reed-muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(ic50)，并计算选择指数si＝tc50/ic50。(3)cpe评价标准：以细胞死亡比例分别标记为4+(细胞死亡比例75％～100％)、3+(50％～75％)、2+(25％～50％)、1+(0％～25％)、0+(细胞全部存活)。4结果在h460细胞中，cpe法测定磷酸萘酚喹对hcov-oe43的ic50为3.53±0.45μg/ml，选择指数si为>14.2；阳性对照利巴韦林对对hcov-oe43的ic50为5.06±1.92μg/ml，选择指数si为15.3；磷酸氯喹对hcov-oe43的ic50为1.63±0.31μg/ml，选择指数si为>30.7。5结论在本实验条件下，磷酸萘酚喹对hcov-oe43感染所致的细胞病变cpe有抑制作用。以上实验结果表明：磷酸萘酚喹在vero细胞中对2019-ncov新型冠状病毒具有明显的抑制作用，ec50为2.01μm，cc50为13.5μm，si为6.72；磷酸萘酚喹在vero细胞中对2019-ncov新型冠状病毒的抑制作用明显优于对照药物磷酸氯喹(ec50＝5.8μm)。在huh7细胞中，cpe法测定磷酸萘酚喹对hcov-229e的ic50为1.24±0.87μg/ml，选择指数si为5.6；在h460细胞中，cpe法测定磷酸萘酚喹对hcov-oe43的ic50为3.53±0.45μg/ml，选择指数si为>14.2。表明磷酸萘酚喹在huh7细胞中对hcov-229e冠状病毒具有明显的抑制作用；在h460细胞中，对hcov-oe43冠状病毒具有明显的抑制作用。当前第1页12