黑磷纳米片在制备治疗帕金森病药物中的应用

本发明属于医药材料应用领域，具体涉及黑磷纳米片在制备治疗帕金森病药物中的应用。

背景技术：

帕金森病(pd)是常见的第二大神经退行性疾病，临床表现主要分为震颤、步态不稳等运动性障碍以及失眠、焦虑等非运动性障碍，主要病理特征为路易小体的产生以及多巴胺能神经元的丢失。目前，我国pd患者数量已超140万，而随着人口老龄化的加剧，pd患者的数目将进一步升高。然而，现有的药物仅能缓解其运动性障碍，临床中尚且缺乏对这一疾病的有效治疗策略。

在pd的病理机制中，活性氧(ros)发挥了重要作用。过量的ros会干扰α-突触核蛋白的稳态，致使其异常性聚集，最终形成具有神经毒性的低聚物；另一方面，过量的ros将会诱导氧化应激，破坏线粒体功能，抑制泛素-蛋白酶体系与自噬作用，阻碍细胞对有毒低聚物的清除。因此，清除过量的ros是一种潜在的pd治疗策略。但具有清除过量ros能力的抗氧化剂都不具备跨血脑屏障能力，难以到达pd病灶区域。虽然随着纳米技术的发展，目前可以通过由转运蛋白介导、受体介导等多种方式实现药物的跨血脑屏障递送，但这些方法的脑靶向递药效率有限，难以实现高效的脑靶向递药。近年来的报道表明，将脑部温度在41～43℃下维持5min可以无伤、有效、可逆地增加血脑屏障的渗透性，使药物可以有效地进入脑实质，是一种新兴的脑靶向递药策略。

黑磷纳米片(bpnss)是一种由单层或几层片状黑磷构成的新型二维纳米材料，在过去几年引起了广泛关注。黑磷纳米片的层状结构使其具备快速的电子转移能力，其中磷的元素态也使其具有易于形成p-o键的特点，因此，黑磷纳米片具备很强的ros清除能力。此外，黑磷纳米片还具备优异的光热转换能力，当其处于808nm的近红外光照射下将产生大量的热量，可通过光热作用增加血脑屏障的渗透性。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供黑磷纳米片在制备治疗帕金森病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

黑磷纳米片在制备治疗帕金森病药物中的应用。

优选地，所述的应用为在制备逆转多巴胺能神经元丢失药物中的应用。

所述的多巴胺能神经元丢失是mptp(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导形成的症状。

在上述应用中：

所述黑磷纳米片为表面经聚乙二醇修饰的黑磷纳米片。

所述黑磷纳米片的平均粒径优选为100～200nm；更优选为150～160nm；最优选为158.1nm。

所述聚乙二醇的分子量范围为400～2000，更优选为2000。

优选地，所述黑磷纳米片通过包括如下步骤的方法制备得到：将单端氨基聚乙二醇(peg-nh2)按质量比1～2:1～2，优选为1:1分散于黑磷纳米片溶液中，以700～1000rpm，优选为850rpm的转速避光搅拌8～14h；将所得溶液在8000～12000rpm，优选为10000rpm下离心20～40分钟，优选为30分钟，去除上清，即获得表面经聚乙二醇修饰的黑磷纳米片。

制备好以后，可将最终产物重悬于磷酸盐缓冲液中，备用。在使用过程中，可进一步通过磷酸盐缓冲液对黑磷纳米片进行稀释，以达到所需浓度。所述磷酸盐缓冲液是ph＝7.3～7.5的磷酸盐缓冲液。

所述黑磷纳米片溶液是浓度范围为100～300μg/ml的黑磷纳米片溶液，更优选浓度为200μg/ml的黑磷纳米片溶液。

优选地，所述治疗帕金森病药物的剂型为注射液。可将所述的治疗帕金森病的药物黑磷纳米片通过静脉注射到体内。

优选地，所述治疗帕金森病药物的用量按每kg给药对象施加黑磷纳米片的剂量为3～5mg计，更优选为按4mg计。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)黑磷纳米片的光热效应能安全、无伤、可逆地增加血脑屏障渗透性，改善药物的脑靶向效率。

(2)黑磷纳米片具备抗氧化能力，可清除胞内过多的活性氧，具有治疗帕金森病的纳米生物效应。

附图说明

图1为本发明实例1制备的黑磷纳米片的表征图；其中，a为近红外光谱图，b为扫描透射电镜图，c为能量色散x射线能谱图。

图2为本发明实例1制备的黑磷纳米片的粒径分布与zeta电势图；其中，a为粒径分布图，b为zeta电势图。

图3为本发明实例2对黑磷纳米片的光热行为检测结果图；其中，a为光热稳定性结果图，b为时间-[ln(θ)]曲线图，c为经光照处理前后黑磷纳米片的紫外光谱图。

图4为本发明实例3细胞存活率结果图；其中，a为细胞免疫荧光成像图，b为细胞存活率定量分析图。

图5为本发明实例4小鼠脑部的pet成像图。

图6为本发明实例4小鼠脑部黑质处的th阳性神经元存活率结果图；其中，a为小鼠脑部黑质处的th阳性神经元免疫荧光成像图，b为小鼠脑部黑质处th阳性神经元存活率定量分析图。

图7为本发明实例5对小鼠各脏器的h&e染色成像图。

图8为本发明实例5对小鼠的血常规分析结果图。

图9为本发明实例5对小鼠肝、肾功能的生化指标分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1

本发明黑磷纳米片的一种实施例，本实施例提供一种聚乙二醇修饰的黑磷纳米片的制备方法，其制备方法为：将10mg一端连接氨基的聚乙二醇(分子量＝2000)分散于10mg黑磷纳米片溶液中，所述黑磷纳米片溶液为200μg/ml的黑磷纳米片水溶液，以850rpm转速过夜(8～14h)避光搅拌，随后在10000rpm下离心30分钟，去除未负载的聚乙二醇，将最终产物重悬于pbs(1×、ph＝7.4)中，制备成1mg/ml聚乙二醇修饰的黑磷纳米片。

由图1可见，本发明制得的聚乙二醇修饰的黑磷纳米片，其红外光谱在2900-3000cm^-1处的吸收峰为亚甲基的特征吸收峰，且扫描透射电镜图与能量色散x射线能谱均表明经聚乙二醇修饰后，黑磷纳米片同时含有n、o、p三种元素，表明黑磷纳米片对聚乙二醇的成功负载。

由图2可见，本发明制得的聚乙二醇修饰的黑磷纳米片，其平均粒径为158.1nm，且粒径分布均一，pdi为0.219；此外，其zeta电势为-23.0mv。

实施例2

本发明黑磷纳米片的一种实施例，本实施例提供实施例1中黑磷纳米片的光热行为。为测定实施例1中黑磷纳米片的光热稳定性，将其置于近红外光照下照射(808nm，0.5w/cm²，8min)，使其产生光热作用，随后停止近红外照射，冷却8min，接着再次以同样的近红外光照射，该过程循环五次。如图3a所示，经多次光照-冷却处理后，黑磷纳米片依然具备较高的光热转化能力。

将黑磷纳米片溶液在18000rmp下离心30min，去除上清液，随后将其置于80℃的真空环境下干燥2h，分别称取不同重量的黑磷纳米片重悬于pbs中，制成梯度浓度(1，2，3，4，5μg/ml)的黑磷纳米片溶液。在室温条件下(37℃)，以热电偶测定不同浓度黑磷纳米片溶液在近红外光(808nm，0.5w/cm²)照射下的温度改变，以此计算其光热转化效率，计算公式如下：

η＝(ha△tmax–q)/i(1-10^-aλ)

式中，η为光热转换效率，h是分散的光热的传热系数，a是容器的表面积，△tmax是近红外光照下的最大温度提升，i为光照强度，-aλ为黑磷纳米片在近红外光照射下的吸光度，q是纯分散液体吸收的热量。

如图3b所示，实施例1所述黑磷纳米片的光热转换率η为31.5％。

进一步地，我们发现在经连续近红外光照后，黑磷纳米片在200–1000nm处的吸光度有所降低(图3c)。

实施例3

本发明黑磷纳米片的一种实施例，本实施例提供实施例1所述黑磷纳米片的体外神经保护作用。将神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞(atcc)以5×10³细胞/ml浓度接种于96孔板，孵化24h，再加入黑磷纳米片预处理2h，随后加入2mmmpp+诱导神经毒性。36h后，以cck-8评价细胞存活率，并以am与pi染料对活/死细胞染色，最终结果如图4所示，黑磷纳米片可显著减小由mpp+诱导的神经毒性，增加sh-sy5y细胞的存活率，表面黑磷纳米片在体外具备抗帕金森病作用。

实施例4

本发明黑磷纳米片的一种实施例，本实施例提供实施例1所述黑磷纳米片的体内神经保护作用。本实施例中所述小鼠为鼠龄八周的c57bl/6雄性鼠。将所有小鼠随机分为4组，分别为：对照组(control)、模型组(mptp)、左旋多巴组(l-dopa)、黑磷纳米片组(bpnss)。对除control组外所有小鼠进行帕金森病造模，帕金森病造模方法为：每隔2h腹腔注射18mg/kg的mptp溶液，连续给药4次，给药当天计为第0天。自第1天起，开始给药，其中，左旋多巴组的给药方式为每次腹腔注射25mg/kg的左旋多巴，黑磷纳米片组的给药方式为每次尾静脉注射4mg/kg的黑磷纳米片，对照组与模型组每次注射等体积的生理盐水，连续给药8天。进一步地，黑磷纳米片组每两天近红外光照一次，每次光照使其脑部温度在41-43℃范围内保持10min。

给药完毕后，以18f-fdg造影剂对小鼠脑部进行pet成像，结果如图5所示，黑磷纳米片可缓解由mptp诱导的多巴胺能神经元丢失。进一步地，处死各组小鼠，取出脑、心、肝、脾、肺、肾，固定于4％多聚甲醛中，用以进一步检测。进一步地，采用免疫荧光法对黑质区的th阳性细胞进行检测，方法如下：采用冰冻切片法将脑组织切为厚度为30μm的冠状切片，以th鼠抗(abcam，1:1000)作为一抗，以连接alexafluor594的igg兔抗(cellsignalingtechnology,1:1000)作为二抗，分别用以孵化上述冠状切片。随后，以荧光显微镜(modeldmi8,leica，germany)对th阳性神经元成像。进一步地，以imagej软件对th阳性神经元进行定量分析。如图6所示，相比于mptp组，黑磷纳米片组的th阳性神经元存活率较高，与control组接近，说明黑磷纳米片在体内具备抗帕金森病活性。

实施例5

本发明黑磷纳米片的一种实施例，本实施例提供对实施例1所述黑磷纳米片的生物适应性评价。对实施例4所述对照组与bpnss组小鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾切片处理，随后将各切片进行h&e染色。结果如图7所示，黑磷纳米片组的h&e染色结果与对照组相似，表明黑磷纳米片对小鼠各脏器无显著毒副作用。进一步地，对上述组别小鼠的血液、肝脏、肾脏进行生化指标的检测。如图8和图9所示，黑磷纳米片不会引起这些生化指标的显著改变，说明黑磷纳米片具备良好的生物适应性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。