一种治疗慢性肾炎的中药组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种中药组合物，特别是一种治疗慢性肾炎的中药组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.慢性肾炎可发生于任何年龄，但以青、中年男性为主。起病方式和临床表现多样，多数起病隐袭、缓慢，以血尿、蛋白尿、高血压、水肿为其基本特征，可有不同程度的肾功能减退，渐进性发展为慢性肾衰竭，最终进入尿毒症，危及生命。
3.近些年来，随着现代医学、病理学的不断发展，西医对慢性肾炎的病理学有了进一步的认识，由单纯的临床分类，逐渐过渡到临床、病因、病理等多个角度的分类，从认识学上有较大深入与进步。但相形之下，西医对该病的治疗方法和药物却进展不大，尤其是慢性肾炎后期一长段过程中，缺乏有效的药物和方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种治疗慢性肾炎的中药组合物及其制备方法和应用。本发明的中药组合物具有治疗慢性肾炎的临床效果显著，且安全性较高的特点，其制备工艺具有操作简单、成本低的特点。
5.本发明的技术方案：一种治疗慢性肾炎的中药组合物，包括以下重量份的原料：黄芪2～35份、丹参10～40份、五味子2～30份、青蒿10～55份和土茯苓10～50份。
6.前述的一种治疗慢性肾炎的中药组合物中，包括以下重量份的原料：黄芪5～30份、丹参15～30份、五味子5～25份、青蒿15～50份和土茯苓15～30份。
7.前述的一种治疗慢性肾炎的中药组合物中，包括以下重量份的原料：黄芪17.5份、丹参22.5份、五味子15份、青蒿32.5份和土茯苓22份。
8.前述的一种治疗慢性肾炎的中药组合物中，还包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、增稠剂、增溶剂或其它药学、食品上可接受的辅料。
9.上述的中药组合物的制备方法，包括将各个原料以水、乙醇或二氧化碳为溶媒提取得到。
10.前述的制备方法中，包括将各个原料分别切制成0.02～1cm段，混合，称取60～110g，用8～11倍量水将上述药材浸润25～125min，煎煮2～3次，每次2～3小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为60～70℃、真空度为0.08～0.1mpa的条件下减压干燥，即得。
11.前述的制备方法中，包括将黄芪、丹参、五味子、青蒿、土茯苓分别切制成1cm段，混合，称取80g，用8倍量水将药材浸润30min，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为70℃、真空度为0.1mpa的条件下减压干燥，即得。
12.还包括中药组合物在治疗慢性肾炎上的应用。
13.前述的应用中，所述中药组合物的制剂剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、口服液、分散片或任一药剂学范畴上合理剂型。
14.与现有技术相比，本发明创造性地将黄芪、丹参、五味子、青蒿、土茯苓等五味中药原料制得中药组合物，本发明用于治疗慢性肾炎的中药制剂配伍科学合理，具有“对因治疗”作用的同时，更可调整、改善人体脏腑、气血功能活动和整体机能，起到了多途径、多靶点治疗的效果，从而改善慢性肾炎的症状，延缓病变的进展。
15.在临床上，以本方对中医辨证为脾肾气虚血瘀型的1035例慢性肾疾病患者进行了临床治疗，其中，慢性肾小球肾炎217例，隐匿性肾小球肾炎115例，肾病综合症269例，糖尿病肾病216例，紫癜性肾炎99例，痛风肾119例，以上1035例均未进入慢性肾衰阶段。采用随机抽样的方法，并系统观察疗效。结果：痊愈者286例，显效491例，有效207例，总有效率95％，其中痊愈与显效777例，占75％。可见，本方在临床上对脾肾气虚血瘀型的慢性肾疾病及慢性肾炎疗效显著。
16.因此，本发明的产品具有治疗慢性肾炎的临床效果显著，且安全性较高的特点。
附图说明
17.图1是本发明药物对大鼠masugi肾炎肾脏病理的影响图；
18.图2是本发明药物对大鼠masugi肾炎肾小球基底膜兔igg沉积的影响图；
19.图3是本发明药物对大鼠masugi肾炎肾小球基底膜大鼠igg沉积的影响图；
20.图4是本发明药物对家兔c
‑
bsa肾炎肾脏病理的影响图；
21.图5是本发明药物对大鼠heymann肾炎肾脏病理的影响图；
22.图6是本发明药物对系膜增生性肾小球肾炎的影响。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
24.实施例1：
25.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪17.5g、丹参22.5g、五味子15g、青蒿32.5g、土茯苓22g分别切制成1cm段，混合均匀，称取80g，用8倍量水将药材浸润30min，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为70℃、真空度为0.1mpa的条件下减压干燥，即得。
26.实施例2：
27.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪19g、丹参24.5g、五味子17g、青蒿34.5g、土茯苓24g分别切制成0.5cm段，混合均匀，称取90g，用7倍量水将药材浸润60min，煎煮2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为68℃、真空度为0.09mpa的条件下减压干燥，即得。
28.实施例3：
29.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪15.5g、丹参20.5g、五味子13g、青蒿30.5g、土茯苓20g分别切制成0.02cm段，混合均匀，称取110g，用10倍量水将药材浸润120min，煎煮3次，每次3小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为75℃、真空度为0.1mpa的条件下减压干燥，即得。
30.实施例4：
31.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪10g、丹参15g、五味子
5g、青蒿12g、土茯苓20g分别切制成0.02cm段，混合均匀，称取80g，用6倍量水将药材浸润30min，煎煮1小时，滤过，浓缩，于温度为65℃、真空度为0.08mpa的条件下减压干燥，即得。
32.实施例5：
33.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪10g、丹参15g、五味子5g、青蒿12g、土茯苓20g分别切制成1cm段，混合均匀，称取100g，加10倍药材量的5％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为72℃、真空度为0.09mpa的条件下减压干燥，即得。
34.实施例6：
35.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪10g、丹参15g、五味子5g、青蒿12g、土茯苓20g分别切制成1cm段，混合均匀，称取100g，加10倍药材量的40％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为72℃、真空度为0.09mpa的条件下减压干燥，即得。
36.实施例7：
37.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪10g、丹参15g、五味子5g、青蒿12g、土茯苓20g分别切制成1cm段，混合均匀，称取100g，加10倍药材量的80％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩，于温度为72℃、真空度为0.09mpa的条件下减压干燥，即得。
38.实施例8：
39.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪10g、丹参15g、五味子5g、青蒿12g、土茯苓20g分别切制成1cm段，混合均匀，称取100g，co2超临界提取，其中，以质量比为5％的乙醇作夹带剂，萃取压力为30mpa，萃取温度为50℃，静态浸泡时间为3h，动态萃取3h，减压干燥，即得。
40.实施例9：
41.一种治疗慢性肾炎的中药组合物的制备方法，包括将黄芪10g、丹参15g、五味子5g、青蒿12g、土茯苓20g分别切制成1cm段，混合均匀，称取100g，co2超临界提取，其中，以质量比为40％的乙醇作夹带剂，萃取压力为30mpa，萃取温度为50℃，静态浸泡时间为3h，动态萃取3h，减压干燥，即得。
42.实施例10：
43.取实施例1～9任一所得的本发明中药组合物，加入适量的常规辅料，混匀，烘干，灭菌，装入硬胶囊，包装，制成胶囊剂。
44.实施例11：
45.取实施例1～9任一所得的本发明中药组合物，加适量的常规辅料，混匀，制成颗粒，干燥，压片，制成片剂。
46.实施例12：
47.取实施例1～9任一所得的本发明中药组合物，加入适量常用辅料，成丸，干燥，制成丸剂。
48.提取率实验：
49.取实施例1中的切制后的中药混合物随机平均分成9份，每份均为80g，9份中药混合物平均分成三组，每组3份，分别为实验组、对照组1和对照组2，进行提取，测定浸膏收率
(出膏率)。
50.出膏率测定的具体方法为：取浓缩至相对密度1.20～1.30(测定温度60℃)的清膏，转移至1000ml的容量瓶中并定容，摇匀，精密量取20ml分别置于已恒重的蒸发皿中，水浴挥干，残渣于105℃干燥3小时，取出，置干燥器中放置30分钟，称重，计算；超临界二氧化碳萃取的提取物水浴挥干，置于105℃下干燥至恒重，称重，计算。
51.将实验组按照实施例1的提取方法进行提取试验，将对照组1以现有的提取方式：回流提取2次，每次2小时，加95％乙醇量为10倍药材量进行提取；将对照组2以现有的提取方式：超临界co2结合质量比为95％的乙醇作夹带剂，压力30mpa、萃取温度50℃、静态浸泡时间3h，动态萃取3h进行提取，得到的浸膏收率的实验结果见表1所示。
52.表1不同提取方法对出膏率的影响
[0053][0054]
由表1可知，采用本申请的提取方式，得到的提取物的浸膏收率最高，成本最低。
[0055]
本发明用于治疗慢性肾炎的药效学试验：
[0056]
1试验目的
[0057]
本发明药物临床拟用于治疗慢性肾小球肾炎，本研究采用多种实验模型观察其对实验性慢性肾小球肾炎的治疗作用，以证明其有效性，并探讨其作用机理，为临床应用提供实验依据。
[0058]
2实验材料
[0059]
2.1药物与试剂
[0060]
本发明药物：棕色粉末，批号120207，每克粉末相当于3.16g生药，由天津药物研究院中药现代研究室提供。
[0061]
肾炎康复片：天津同仁堂集团股份有限公司生产，批号b89134。
[0062]
香菇菌多糖片：湖北广仁药业有限公司生产，批号111107。
[0063]
醋酸地塞米松片：天津力生制药股份有限公司，批号1201001。
[0064]
环磷酰胺注射液：山西普德药业有限公司生产，批号04120103。
[0065]
氢氯噻嗪片：天津力生制药有限公司生产，批号1203007。
[0066]
尼莫地平片：天津市中央药业有限公司生产，批号110616。
[0067]
盐酸肾上腺素注射液：天津力生制药有限公司生产，批号1201001。
[0068]
弗氏完全佐剂：博美科生产，批号61185028。
[0069]
弗氏完全佐剂：sigma生产，批号080m8724。
[0070]
牛血清白蛋白组分v：amresco生产，cat no：a015
‑
3。
[0071]
dnfb：e merck，darmstadt，批号20041110。
[0072]
兔抗鼠gmb血清：免疫扩散法测得抗血清效价大于等于(1：32)，
‑
20℃保存备用。
[0073]
c
‑
bsa制备：沉淀法测得等电点为8.4，
‑
20℃保存备用。
[0074]
同种免疫复合物制备：用大鼠肾皮质匀浆和弗氏完全佐剂乳化，供腹腔注射用。
[0075]
anti
‑
rabbit igg(whole molecule)
‑
fitc:sigma
‑
aldrich,product number f9887.
[0076]
anti
‑
rat igg(whole molecule)
‑
fitc:sigma
‑
aldrich,product number f1763.
[0077]
2.2动物
[0078]
wistar种大鼠：spf级，北京维通利华实验动物科技有限公司提供，许可证编号：scxk(京)2011
‑
0011。
[0079]
sd种大鼠：spf级，天津山川红实验动物科技有限公司提供，许可证编号：scxk(京)2009
‑
0001。
[0080]
icr种小鼠：spf级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：scxk(京)2012－0001。
[0081]
大耳白种家兔：spf级，北京维通利华实验动物科技有限公司提供，许可证编号：scxk(京)2012
‑
0001。
[0082]
豚鼠：spf级，北京维通利华实验动物科技有限公司提供，许可证编号：scxk(京)2012
‑
0002。
[0083]
2.3饲养管理
[0084]
动物饲料：天津市华荣实验动物科技有限公司生产，许可证号：scxk(津)2012
‑
0001。
[0085]
动物实验室：室温由中央空调控制在(233)℃，湿度为(5515)％。
[0086]
2.3实验仪器
[0087]
紫外可见分光光度计：tu－1810型，北京普析通用仪器有限责任公司。
[0088]
vitalab selectra2型全自动生化仪：荷兰威图公司。
[0089]
血液粘度仪：lg－r－80c型，北京中勤世帝科学仪器有限公司。
[0090]
varioskan flash酶标仪：美国thermo公司产品。
[0091]
3.实验方法
[0092]
3.1本发明药物对膜性肾炎的治疗作用
[0093]
3.1.1对大鼠masugi肾炎的影响
[0094]
选用wistar种雄性大鼠118只，体重(120～140)g，除10只大鼠做正常对照外，其余大鼠用于造模。首先，进行预免疫，将兔igg 1mg溶解后与等量完全弗氏佐剂充分乳化后进行腹腔注射(1ml/只)，预免疫后6天，给造模组大鼠均尾静脉注射1ml/只的兔抗鼠gmb血清进行免疫，第7天同样剂量再尾静脉注射2次(间隔1小时)，正常对照组注射等量的正常兔血清。免疫后3天，检测24小时尿蛋白定量、血清生化指标，将造型成功的大鼠按24小时尿蛋白定量，随机分为模型对照组、本发明药物1.058、2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组(相当于人拟用临床剂量等效量的0.25、0.5、1、2倍)、醋酸地塞米松0.0675mg/kg剂量组、肾炎康复片1.296g药粉/kg剂量组(临床等效量的2倍)，每组12只，加上正常对照组，共8组，进行灌胃给药，每天一次，连续3周，给药容积为10ml/kg，正常及模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na，每周检测一次24小时尿蛋白定量。实验结束，取血测定血清bun、cr、tp、alb、tc、tg；取肾脏称量，以100g体重的肾重计算肾脏脏器系数，其中的一个肾用10％福尔马林固定，石蜡包
埋，he染色，光镜检查肾脏病变，并用ida2000图象分析系统测量肾小球等效直径、周长、面积，计数肾小球内细胞数；另一个肾用生理盐水灌流干净后在
‑
80℃冰箱中冷冻保存，用于荧光免疫检查，观察大鼠igg、兔igg在肾小球基底膜上的沉积。根据荧光强度分为五个等级：(0)无荧光；(ⅰ)荧光弱；(ⅱ)荧光较明亮；(ⅲ)荧光非常明亮；(ⅳ)荧光闪亮。结果见表2
‑
表6、附图1、附图2、附图3。
[0095]
表2本发明药物对大鼠masugi肾炎24小时尿蛋白定量的影响(n)
[0096][0097]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n：动物数
[0098]
表3本发明药物对大鼠masugi肾炎血清生化的影响(n)
[0099][0100][0101]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05；n：动物数
[0102]
表4本发明药物对大鼠masugi肾炎肾脏系数的影响
[0103][0104]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01
[0105]
表5本发明药物对大鼠masugi肾炎肾脏病理的影响与正常组相比：
△△
p＜0.01与模型组相比：
*
p＜0.05
**
p＜0.01
***
p＜0.001
[0106][0107]
表6
‑
1本发明药物对大鼠masugi肾炎肾小球基底膜兔igg含量的影响
[0108][0109][0110]
注：p值为各组与模型组比较(采用等级序值法进行统计分析)
[0111]
表6
‑
2本发明药物对大鼠masugi肾炎肾小球基底膜大鼠igg含量的影响
[0112][0113]
注：p值为各组与模型组比较(采用等级序值法进行统计分析)
[0114]
上述实验结果显示：
[0115]
(1)24小时尿蛋白定量：给药前，与正常对照组比较，各给药剂量组的24小时尿蛋白均明显升高，各给药剂量组之间无明显差异，表明造型成功，分组合理。给药3周，与模型对照组比较，本发明药物2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组给药(2
‑
3)周，明显降低24小时尿蛋白定量，工具药醋酸地塞米松0.0675mg/kg剂量组(2
‑
3)周、阳性药肾炎康复片给药3周亦有明显降低作用。
[0116]
(2)血清生化指标：给药前，与正常对照组比较，各剂量组的bun、cr、tc、tg明显升高，tp、alb明显下降，各给药剂量组之间无明显差异，显示已造成慢性肾炎模型。给药3周，与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g/kg剂量组明显降低bun、cr，升高tp、alb，2.115g/kg剂量组明显降低bun，显示对肾功能有明显改善作用。醋酸地塞米松0.05mg/kg剂量组作用相似，肾炎康复片仅降低bun、cr，对tp、alb无明显改善作用。
[0117]
(3)肾脏系数：与正常组比较，模型组肾脏系数明显增大，显示肾脏病变明显。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组明显减小肾脏系数，显示对肾脏病变有明显改善作用，醋酸地塞米松与肾炎康复片均有明显作用。
[0118]
(4)肾小球等效直径、周长、面积、细胞数：与正常组比较，模型组肾小球等效直径、周长、面积明显增大、细胞数明显增多，显示肾小球病变明显。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组明显减小肾小球等效直径、周长、面积，减少细胞数，显示对肾小球病变有明显改善作用，醋酸地塞米松与肾炎康复片只明显减少细胞数，对肾小球等效直径、周长、面积均无明显作用。
[0119]
(5)免疫荧光检测：正常对照组肾小球gbm未见igg沉积，模型对照组兔igg、大鼠igg均沿gbm呈线性沉积。与模型对照组比较，本发明药物8.46g生药/kg、4.23g生药/kg荧光强度均显著减弱，表明沉积减少，其余各组有减弱趋势，但未见显著变化。
[0120]
(6)病理组织学检查：正常对照组各肾组织形态未见著变。模型组各肾病变明显，肾小球体积普遍增大、肾小球内细胞数增多，部分肾小球毛细血管扩张，基底膜增厚，肾小球囊扩大，肾小管扩张，肾小管均见轻重不等的蛋白管型，肾间质弥漫炎细胞浸润。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组、地塞米松组、肾炎康复片组肾病变减轻，肾小球体积有所缩小，细胞数亦减少，偶见肾小管扩张剂或管型，肾间质灶性炎细胞浸润。
[0121]
3.1.2对家兔c
‑
bsa肾炎的影响
[0122]
选用雄性大耳白种家兔70只，体重(2～2.5)kg，测定24小时尿蛋白定量，淘汰尿蛋白偏高的家兔后，选用8只家兔作为正常组，其余均耳静脉注射c
‑
bsa 10mg/只进行造模，每
天一次，连续5周，第6周剂量加倍，造模结束后，检测24小时尿蛋白定量和血清生化指标。选用24小时尿蛋白定量大于100mg的家兔，随机分为模型对照组、本发明药物1.10、2.19、4.38g生药/kg剂量组(相当于人拟用临床剂量等效量的0.5、1、2倍)、醋酸地塞米松0.05mg/kg剂量组、肾炎康复片0.672g药粉/kg剂量组(相当于人拟用临床剂量等效量的2倍)，每组9只，加上正常对照组，共7组，开始灌胃给药，每天一次，连续5周，灌胃量为3ml/kg，正常及模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。每周测定24小时尿蛋白定量；实验结束取血测定血清bun、cr、tp、alb、tc、tg；取肾脏称量，以1kg体重的肾重计算肾脏脏器系数；用10％福尔马林固定，石蜡包埋，he染色，光镜检查肾脏病变，并用ida2000图象分析系统随机测量肾小球等效直径、周长、面积，计数肾小球内细胞数。结果见表7
‑
表10、附图4。
[0123]
表7本发明药物对家兔c
‑
bsa肾炎24小时尿蛋白定量的影响(n)
[0124][0125]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n：动物数
[0126]
表8
‑
1本发明药物对家兔c
‑
bsa肾炎血清生化的影响(n)
[0127]
[0128][0129]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n：动物数
[0130]
表8
‑
2本发明药物对家兔c
‑
bsa肾炎血清生化的影响(n)
[0131][0132]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n：动物数
[0133]
表9本发明药物对家兔c
‑
bsa肾炎肾脏系数的影响
[0134][0135]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01
[0136]
表10本发明药物对家兔c
‑
bsa肾炎肾脏病理的影响
[0137][0138]
与正常组相比：
△△△
p＜0.001；与模型组相比：
*
p＜0.05
**
p＜0.01
***
p＜0.001
[0139]
上述结果显示：
[0140]
(1)24小时尿蛋白定量：与正常对照组比较，给药后5周，模型对照组家兔24小时尿蛋白定量明显升高，表明模型成功；与模型对照组比较，本发明药物4.38g/kg剂量组给药(2
‑
5)周、2.19g/kg剂量组给药(3
‑
4)周，明显降低24小时尿蛋白定量，工具药醋酸地塞米松0.05mg/kg剂量组(2
‑
5)周及阳性药肾炎康复片(2
‑
4)周亦有明显作用。
[0141]
(2)血清生化检测：给药前，与正常对照组比较，各剂量组的bun、cr、cho、tg明显升高，alb明显下降，显示已形成慢性肾炎模型。给药5周，与模型组比较，本发明药物1.10、2.19、4.38g生药/kg剂量组均明显升高血清alb，2.19、4.38g生药/kg剂量组明显降低血清cr，显示对肾功能有明显改善作用。醋酸地塞米松0.05mg/kg剂量组有明显作用，肾炎康复片无明显改善作用。
[0142]
(3)肾脏系数：与正常组比较，模型组的肾脏系数明显增大，显示肾脏病变明显；与模型组比较，本发明药物1.10、2.19、4.38g生药/kg剂量组明显减小肾脏系数，显示对肾脏病变有明显改善作用。肾炎康复片有明显作用。
[0143]
(4)肾小球等效直径、细胞数：与正常组比较，模型组肾小球等效直径明显增大、细胞数明显增多，显示肾小球病变明显。与模型组比较，本发明药物4.38、2.19生药/kg剂量组明显减小肾小球等效直径，减少细胞数，本发明药物1.10g生药/kg剂量组明显减小肾小球等效直径，显示对肾小球病变有明显改善作用，醋酸地塞米松与肾炎康复片也有明显改善作用。
[0144]
(5)病理组织学检查：正常对照组各肾组织形态未见著变。模型组各肾病变明显，肾小球体积普遍增大、肾小球内细胞数增多，部分肾小球毛细血管扩张，基底膜增厚，肾小球囊扩大，肾小管扩张，肾小管均见轻重不等的蛋白管型，肾间质弥漫炎细胞浸润。肾炎康、地塞米松组与模型组比较，肾病变减轻，肾小球体积有所缩小，细胞数亦减少，偶见肾小管扩张或管型，肾间质灶性炎细胞浸润。本发明药物2.19、4.38g生药/kg剂量组肾病变减轻明显，肾小球体积缩小，细胞数减少，基底膜增厚不明显，肾小管及间质无明显病变。
[0145]
3.1.3对大鼠heymann肾炎的影响
[0146]
选用wistar种大鼠116只，雌雄兼用，体重(170～200)g，除雌雄各5只大鼠做正常对照外，其余大鼠均腹腔注射同种免疫复合物进行造模，两周1次，每次2ml，直至出现蛋白尿，表明造模成功。将造模成功的大鼠按24小时尿蛋白定量，随机分为模型对照组、本发明药物2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组、醋酸地塞米松0.0675mg/kg剂量组、肾炎康复片1.296g药粉/kg剂量组，每组12只，加上正常对照组，共7组，开始灌胃给药，每天一次，连续6周，灌胃量为10ml/kg，正常及模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。每周测定24小时尿蛋白定量，实验结束取血测定血清bun、cr、tp、alb、tc、tg；取肾脏称量，以100g体重的肾重计算
肾脏脏器系数；肾脏用10％福尔马林固定，石蜡包埋，he染色，光镜检查其病变，并用ida2000图象分析系统随机测量肾小球等效直径、周长、面积，计数肾小球内细胞数。结果见表11
‑
表14、附图5。
[0147]
表11本发明药物对大鼠heymann肾炎24小时尿蛋白定量的影响(n)
[0148][0149]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05；n：动物数
[0150]
表12
‑
1本发明药物对大鼠heymann肾炎血清生化的影响(n)
[0151][0152]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
：p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；与肾炎康复片比较：
#
p<0.05；n：动物数
[0153]
表12
‑
2本发明药物对大鼠heymann肾炎血清生化的影响(n)
[0154][0155]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n：动物数
[0156]
表13本发明药物对大鼠heymann肾炎肾脏系数的影响
[0157][0158]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01
[0159]
表14本发明药物对大鼠heymann肾炎肾脏病理的影响
[0160][0161]
与正常组相比：
△
p＜0.05
△△
p＜0.01；与模型组相比：*p＜0.05**p＜0.01
[0162]
上述结果显示：
[0163]
(1)24小时尿蛋白定量：与正常对照组比较，给药6周，模型组大鼠24小时尿蛋白定量明显升高，表明造型成功；与模型对照组比较，本发明药物4.23、8.46g/kg剂量组给药(4
‑
6)周、2.115g/kg剂量组给药6周，明显降低24小时尿蛋白定量，工具药醋酸地塞米松0.0675mg/kg剂量组(4
‑
6)周亦有明显作用，阳性药肾炎康复片仅有降低的趋势。
[0164]
(2)血清生化指标：给药前，与正常对照组比较，各剂量组的bun、tc、tg明显升高，显示已造成慢性肾炎模型，各剂量组与模型组比较，各项生化指标均无明显差异。给药6周
后，与模型对照组，本发明药物4.23、8.46g/kg剂量组明显升高tp，降低bun，显示对肾功能有明显改善作用。醋酸地塞米松0.05mg/kg剂量组也有明显作用，肾炎康复片仅降低bun，对tp无明显升高作用。与肾炎康复片比较，本发明药物4.23、8.46g/kg剂量组明显升高tp。
[0165]
(3)肾脏系数：与正常组比较，模型组的肾脏系数明显增大，肾脏病变明显。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组明显减小肾脏系数，显示对肾脏病变有改善作用。醋酸地塞米松与肾炎康复片均有明显作用。
[0166]
(4)肾小球等效直径、周长、面积、细胞数：与正常组比较，模型组肾小球周长、面积明显增大、细胞数明显增多，显示肾小球病变明显。与模型组比较，本发明药物8.46g生药/kg剂量组明显减小肾小球周长、面积，减少细胞数，本发明药物4.23g生药/kg剂量组明显减小肾小球面积，显示对肾小球病变有明显改善作用，肾炎康复片只明显减少细胞数，对肾小球周长、面积均无明显作用，醋酸地塞米松无明显作用。
[0167]
(5)病理组织学检查：正常对照组各肾组织形态未见显著变化。模型组各肾病变明显，肾小球体积普遍增大、肾小球内细胞数增多，部分肾小球毛细血管扩张，基底膜增厚，肾小管均见轻重不等的蛋白管型，肾间质有炎细胞浸润。肾炎康复片、地塞米松组与模型组比较，肾病变有减轻的趋势，部分肾小球体积缩小，细胞数减少，以肾炎康组较明显，但各组均能见到肾小管管型,部分肾小球毛细血管扩张以及基底膜增厚。本发明药物8.46g生药/kg剂量组与模型组比较，肾病变减轻明显，肾小球体积缩小，细胞数减少，本发明药物4.23g生药/kg剂量组与模型组比较，肾病变有不同程度减轻，肾小球体积缩小，细胞数有减少的趋势。本发明药物2.115g生药/kg剂量组与模型组比较有减轻趋势，病理形态大致与模型组相似。
[0168]
3.2本发明药物对系膜增生性肾炎的治疗作用
[0169]
3.2.1对改良慢性血清病肾炎的影响
[0170]
选用sd种雄性大鼠110只，体重(180～200)g，除10只大鼠作为正常对照外，其余大鼠用40mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，常规消毒后，手术切除右侧肾脏，恢复2周后复制改良慢性血清病肾炎模型。
[0171]
预免疫：大鼠足垫注射完全弗氏佐剂与3mgbsa的乳化物(50ul)，1周末、2周末各加强一次，3周末腹腔连续注射bsa4次，每次间隔1小时，注射剂量分别为0.5、1.0、1.5、3.0mg/只，次日再加强注射1次(2mg/只)。
[0172]
免疫：加强注射后每日尾静脉注射bsa，剂量从每只1mg开始，每日增加1mg至5mg为止，继续每周加量1mg至10mg为止。
[0173]
造型结束，检测24小时尿蛋白定量及血清生化指标，将造型成功的大鼠随机分为模型对照组、本发明药物2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组、醋酸地塞米松0.0675mg/kg剂量组、肾炎康复片1.296g药粉/kg剂量组，每组10只，加上正常对照组，共7组进行灌胃给药，每天一次，连续3周，灌胃量为10ml/kg，正常及模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。
[0174]
每周测定24小时尿蛋白定量，实验结束取血测定血清bun、cr、tp、alb、tc、tg，sod、mda、cic(循环免疫复合物)；称量肾脏、脾脏、肝脏，以100g体重的脏器重计算脏器系数，然用10％福尔马林固定，石蜡包埋，masson特殊染色，光镜检查肾脏系膜病变(肾小球血管袢系膜显示蓝色，是否增生观察肾小球里蓝色区域的多少)。结果见表15
‑
表19、附图6。
[0175]
表15本发明药物对系膜增生性肾炎尿蛋白的影响(n)
[0176][0177]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05n：动物数
[0178]
表16
‑
1本发明药物对系膜增生性肾炎血清生化的影响(n)
[0179][0180][0181]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：*p<0.05**p<0.01n：动物数
[0182]
表16
‑
2本发明药物对系膜增生性肾炎血清生化的影响(n)
[0183][0184]
与正常对照组比较：
δ
p<0.05
δδ
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01n：动物数
[0185]
表17本发明药物对系膜增生性肾炎脏器系数的影响
[0186][0187][0188]
与正常对照组比较：
△
p<0.05
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01
[0189]
表18本发明药物对系膜增生性肾炎mda、sod的影响
[0190][0191]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01
[0192]
表19本发明药物对系膜增生性肾炎循环免疫复合物(cic)的影响
[0193][0194]
与正常对照组比较：
△
p<0.05；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；与肾炎康复片比较：
#
p<0.05
[0195]
上述结果显示：
[0196]
(1)24小时尿蛋白定量：与正常对照组比较，模型给药组大鼠24小时尿蛋白定量明显升高，表明造型成功；给药3周，与模型对照组比较，本发明药物8.46g生药/kg剂量组尿蛋白明显降低，其余各剂量组及工具药地塞米松、阳性药肾炎康复片有降低的趋势，无明显差异。
[0197]
(2)血清生化指标：给药前，与正常对照组比较，各剂量组的bun、cr、tc、明显升高，tp、alb明显下降，显示已造成慢性肾炎模型，各剂量组与模型组比较，各项生化指标均无明显差异。给药3周，与模型对照组，本发明药物8.46g/kg剂量组明显降低bun，cr，2.115、4.23g/kg剂量组明显降低bun，显示对肾功能有明显改善作用。醋酸地塞米松0.05mg/kg剂量组也有明显作用，肾炎康复片仅明显降低bun。
[0198]
(3)肾脏系数：与正常组比较，模型组的肾脏系数明显增大，肾脏病变明显。与模型组比较，本发明药物各剂量组无明显作用，肾炎康复片有显著改善作用。
[0199]
(4)氧化损伤指标：与正常组比较，模型组的sod明显下降、mda明显升高，显示有明显的氧化损伤。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组sod明显升高、mda明显下降，表示有明显的抗氧化损伤作用。
[0200]
(5)免疫指标：与正常组比较，模型组的脾脏指数明显升高，显示有明显免疫亢进作用。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组明显降低脾脏指数，显示对免疫亢进有明显的抑制作用，醋酸地塞米松作用相似，肾炎康复片无明显作用。
[0201]
(6)cic(免疫复合物)测定：与正常组比较，模型组的cic明显升高。与模型组比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组免疫复合物明显下降，表示对循环中的免疫复合物有明显的清除作用，减轻对肾脏的损害。与肾炎康复片比较，本发明药物4.23、8.46g生药/kg剂量组免疫复合物也明显下降。
[0202]
(7)病理组织学检查：正常对照组各肾组织形态未见著变。模型组各肾病变明显，肾小球体积普遍增大、血管球系膜增生，半数动物肾间质见炎细胞浸润或部分肾小管高度扩张或水肿。地塞米松0.0675mg/kg组与模型组比较，血管球系膜增生略有减轻；间质见炎细胞浸润或部分肾小管高度扩张或水肿的动物数减少。肾炎康复片1.296g药粉/kg组与模型组比较，血管球系膜增生、肾间质及肾小管病变减轻不明显。本发明药物8.46g生药/kg组与模型组比较，肾小球体积缩小，血管球系膜增生减轻；除1只间质见炎细胞浸润明显，余肾病变仅偶见部分肾小管扩张或水肿。本发明药物4.23g生药/kg组及2.115g生药/kg组与模
型组比较病变减轻不明显，仅血管球系膜增生略有减轻；余间质见炎细胞浸润或部分肾小管高度扩张或水肿的动物数与模型组大致相似。
[0203]
3.3本发明药物的活血作用
[0204]
3.3.1对“血症”大鼠全血粘度的影响
[0205]
选用健康wistar种大鼠70只，体重(240～260)g，按体重随机分组，每组10只，雌雄各半。实验设正常对照组、模型对照组、本发明药物2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组、肾炎康复片1.296g药粉/kg及尼莫地平21.6mg/kg剂量组，共7组，进行灌胃给药，正常及模型对照组灌胃给予等容量0.5％cmc
‑
na，给药容积均为10ml/kg，每天一次，连续7天。第6天给药后1小时，除正常对照组外，其余各组皮下注射盐酸肾上腺素0.8mg/kg两次，间隔6小时，中间第一次注射3小时后冰水游泳5分钟(4
±
1)℃，禁食过夜，末次给药后1小时，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，用3.8％枸橼酸钠抗凝(抗凝剂与全血的比为1：9)，在lg
‑
r
‑
80c血液粘度计上测定不同切速下的全血粘度，结果见表20。
[0206]
表20本发明药物对血瘀大鼠全血粘度的影响(n＝10)
[0207][0208]
与正常对照组比较：
△△△
p<0.001；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n：动物数
[0209]
表20结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠各切速下的全血粘度明显升高，表明已造成血瘀模型。与模型对照组比较，本发明药物2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组明显降低血瘀大鼠低切速下的全血粘度，表明能抑制红细胞的聚集，具有明显的活血作用，阳性药尼莫地平也有明显作用，肾炎康复片作用相似。
[0210]
3.4本发明药物的免疫作用
[0211]
3.4.1对免疫功能低下小鼠非特异性免疫的影响
[0212]
选用健康icr种小鼠，体重(18～22)g，随机分组，每组12只，均雌雄各半，实验设正常对照组、模型对照组、本发明药物3.05、6.11、12.22g生药/kg剂量组(相当于人拟用临床剂量等效量的0.5、1、2倍)、香菇菌多糖0.1g药粉/kg、肾炎康复片1.872g药粉/kg(临床等效量的2倍)，共7组，进行灌胃给药，每天一次，连续5周，给药容量为20ml/kg体重，正常及模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。试验结束前4天，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余动物均每天皮下注射盐酸环磷酰胺80mg/kg，连续3天，末次给药后1小时，尾静脉注射25％印度墨汁10ml/kg，分别于注射后2分钟、10分钟，用毛细管从眼眶静脉丛取血20ul，于2ml 0.1％naco3溶液中混匀，用分光光度计测定波长680nm处的吸光度。处死小鼠，取出肝、脾和
胸腺，进行称量，分别以每10克小鼠体重的脾重、胸腺重作为脾指数、胸腺指数，并计算吞噬指数(k)、廓清指数α，结果见表21。
[0213]
k＝(logod2
‑
logod10)/(t2
‑
t1)，式中od2、od10为2min、10min的吸收度，t为时间。
[0214][0215]
表21本发明药物对免疫功能低下小鼠非特异性免疫的影响(n＝12)
[0216][0217]
与正常对照组比较：
△△
p<0.01
△△△
p<0.001；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01；n动物数
[0218]
表21结果显示，与正常对照组比较，模型对照组的脾指数、胸腺指数及k、a均明显降低，表明已形成免疫功能低下，造模成功。与模型对照组比较，本发明药物12.22g生药/kg剂量组明显增加k、a，显示有明显的非特异性免疫增强的作用，香菇菌多糖也有明显增强作用，肾炎康复片无明显作用。
[0219]
3.4.2对免疫功能低下小鼠体液免疫的影响
[0220]
选用健康icr种小鼠，体重(18～22)g，雌雄各半，随机分组，实验设正常对照组、模型对照组、本发明药物3.05、6.11、12.22g生药/kg剂量组、香菇菌多糖0.1g药粉/kg、肾炎康复片1.872g药粉/kg，共7组，每组12只。进行灌胃给药，每天一次，连续5周，给药容量为0.2ml/10g体重，正常及模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。试验结束前7天和4天，每鼠均腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.3ml致敏，试验结束前6天，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余动物均每天皮下注射盐酸环磷酰胺100mg/kg，末次给药后1小时，用毛细管从眼眶静脉丛采血，静置30分钟，2000r/min离心15分钟，分离血清，取稀释血清(血清2ul+生理盐水1ml)加入5％鸡红细胞悬液0.5ml，将反应体系放入冰水浴中，加入1ml 10％补体，在37℃水浴中保温30min，再放入冰水浴中终止反应，2000r/min离心10分钟，取上清液用紫外可见分光光度计在540nm处比色，读取吸光度(od)，结果见表22。
[0221]
表22本发明药物对免疫功能低下小鼠体液免疫的影响
[0222]
[0223]
与正常对照组比较：
△△△
p<0.001；与模型对照组比较：
*
p<0.05
**
p<0.01
[0224]
与肾炎康复片比较：
#
p<0.05
##
p<0.01
[0225]
表22结果显示，与正常对照组比较，模型对照组的od值明显减小，表明已形成免疫功能低下，造模成功。与模型对照组比较，本发明药物6.11、12.22g生药/kg剂量组明显增加od，显示有明显的体液免疫增强作用，香菇菌多糖也有明显增强作用，肾炎康复片有明显抑制作用。与肾炎康复片比较，本发明药物三个剂量组免疫作用明显增强。
[0226]
3.4.3对正常小鼠免疫的影响
[0227]
选用健康icr种小鼠，体重18～20g，均雌雄各半，随机分组，每组12只，实验设模型对照组、本发明药物3.05、6.11、12.22g生药/kg剂量组、香菇菌多糖0.1g药粉/kg、肾炎康复片1.872g药粉/kg，共6组，进行灌胃给药，每天1次，连续1周，给药容量为0.2ml/10g体重，模型对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。分别在给药前1天，各剂量组动物腹部剃毛，剃毛区域为(3*3)cm2，在给药第1天给药后1小时，用1％dnfb 50ul在小鼠剃毛区域致敏，冷风吹干，第2天，同法加强1次，给药第6天给药后1小时，用1％dnfb 20ul均匀涂抹于右耳背进行攻击，左耳涂20ul丙酮
‑
橄榄油(体积比4：1)作对照，攻击24小时后剪下左右双耳，用直径8mm打孔器在双耳相同部位各打一耳片，称重，计算肿胀度(左右耳片重量差)，结果见表23。
[0228]
表23本发明药物对迟发型超敏反应的影响
[0229][0230]
与模型对照组比较：
*
p<0.05
[0231]
表23结果显示：与正常对照组比较，肾炎康复片的耳肿胀度明显减小，显示有明显的免疫抑制作用，本发明药物、香菇菌多糖均无明显作用。
[0232]
3.5本发明药物的利尿作用
[0233]
选用经过筛选的合格雄性wistar大鼠60只(2小时内的排尿量超过所给水负荷的40％)，体重(120～140)g，随机分为6组，每组10只。实验设正常对照组、本发明药物2.115、4.23、8.46g生药/kg剂量组、肾炎康复片1.296g药粉/kg及双氢氯噻嗪8mg/kg(于试验前给药1次)剂量组，共6组，进行灌胃给药，每天1次，连续5天，给药容量为10ml/kg体重，正常对照组给予等容量0.5％cmc
‑
na。试验前一天，禁食不禁水15小时后，灌胃给予用1％盐水配制的药液5ml/100g体重，正常对照组灌胃给予等容量1％盐水溶液，给药后轻压下腹使膀胱排空，放于大鼠代谢笼中，收集1
‑
5小时的尿液，结果见表24。
[0234]
表24本发明药物对大鼠利尿的影响
[0235][0236]
与正常对照组比较：*p<0.05
[0237]
表24结果显示，与正常对照组比较，本发明药物各剂量组在5小时内的排尿量均无明显差异，表明对正常大鼠无明显利尿作用，双氢氯噻嗪在给药后(0
‑
3)小时有明显利尿作用，肾炎康复片也无明显作用。
[0238]
4.实验结论
[0239]
以上实验结果显示，本发明药物具有明显的活血、抗氧化、免疫双向调节作用，对膜性肾炎及系膜增生性肾炎有明显的治疗作用。可能的作用机理是，通过活血作用，改善血液的高凝状态及肾小球微循环障碍，促进免疫复合物的清除；通过对免疫亢进的抑制作用，减少抗体的产生和免疫复合物的形成，通过对免疫抑制的增强作用，提高机体免疫力，防止复发；通过抗氧化损伤，保护细胞免受自由基侵害、促进新成代谢；通过抑制鼠igg、兔igg在毛细血管基底膜上的沉积，促进肾小球毛细血管内皮电荷屏障的恢复，改善肾功能，减轻肾小球病变。
[0240]
与等临床剂量的阳性药肾炎康复片比较，heymann模型实验明显增加血清tp含量(p<0.05)，系膜增生性模型实验明显减少循环中免疫复合物含量(p<0.05)，在免疫功能低下小鼠体液免疫实验中，免疫功能明显增强(p<0.01)。其作用特点表现在：改善肾功能的同时，能明显增加tp、alb含量；清除循环中的免疫复合物、抑制大鼠igg和兔igg在毛细血管基底膜上的沉积，从根本上减少致病原的产生；免疫双向调节作用，既能抑制免疫复合物的生成，又能增强机体的免疫力，优于仅有免疫抑制作用的肾炎康复片，值得开发成一个治疗慢性肾小球肾炎的中药新药。