几种治疗心力衰竭的组合药物及其用途

1.本发明属于生物医药技术，具体地涉及几种治疗心力衰竭的组合药物及其用途。


背景技术：

2.心力衰竭(简称心衰)是多种因素诱导的心脏结构和功能异常，使心室收缩或舒张功能受损，从而引起一系列复杂的临床综合征，同时也是多种心血管疾病(糖尿病、高血糖、高血脂、)的晚期阶段。虽然目前已经有一些药物(β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、醛固酮受体拮抗剂、血管扩张剂、正性肌力药物、利尿剂)用来治疗心衰，但是常规的药物治疗仍然存在着五年内心衰患者住院率和死亡率高等问题。
3.组合药物，通过药物组合联用同时作用在疾病的多个信号通路从而达到增加药物疗效、降低药物副作用的有效方法，广泛应用于临床治疗中。目前治疗心衰的上市组合药物仅有4种，相较51种上市单药，有明显的差距。因此本领域迫切开发新型抗心衰的组合药物。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供新型抗心衰的组合药物。具体地，本发明提供了薄荷醇-丙烯菊酯、硝苯地平-维拉帕米、咪康唑-丙烯菊酯、咪康唑-氨苯丁酯和硝苯地平-丙烯菊酯的药物组合物，用于制备抗心衰的药物。
5.在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含:
6.a)选自下组的第一活性成分:
7.a1)薄荷醇-丙烯菊酯组合；
8.a2)硝苯地平-维拉帕米组合；
9.a3)咪康唑-丙烯菊酯组合；
10.a4)咪康唑-氨苯丁酯组合；
11.a5)硝苯地平-丙烯菊酯组合；
12.a6)任一选自下组的活性成分：薄荷醇、丙烯菊酯、咪康唑、和氨苯丁酯；
13.a7)a1)～a6)中的一种或多种；和/或
14.b)其他药学上可接受的载体、赋形剂或辅料。
15.在另一优选例中，所述辅料选自：稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、乳化剂、着色剂、增溶剂、或其组合。
16.在另一优选例中，当所述第一活性成分为薄荷醇-丙烯菊酯组合，其中薄荷醇与丙烯菊酯的用量摩尔比为0.5～1000:0.5～100；较佳地为0.5～20:0.5～20；
17.当所述第一活性成分为硝苯地平-维拉帕米组合，其中硝苯地平与维拉帕米的用量摩尔比为0.5～500:0.5～500；较佳地为0.5～20:0.5～20；更佳地为10～15:10～15；
18.当所述第一活性成分为咪康唑-丙烯菊酯组合，其中咪康唑与丙烯菊酯的用量摩尔比为0.5～200:10～500；较佳地为0.5～10:0.5～20；
19.当所述第一活性成分为咪康唑-氨苯丁酯组合，其中咪康唑与氨苯丁酯的用量摩
尔比为0.5～200:0.5～1000；较佳地为0.5～10:0.5～20；更佳地为0.5～10:10～20；
20.当所述第一活性成分为硝苯地平-丙烯菊酯组合，其中硝苯地平与丙烯菊酯的用量摩尔比为0.5～500:0.5～500；较佳地为0.5～20:0.5～20；更佳地为10～20:10～20。
21.在本发明的第二方面，提供了一种第一方面所述的药物组合物的用途，用于制备：a)钙离子通道阻滞剂；和/或b)抗心衰的药物。
22.在另一优选例中，所述钙离子为l-型钙离子。
23.在另一优选例中，所述药物组合物用于制备具有以下一种或多种作用的钙离子阻滞剂或药物：
24.(1)阻断ca
2+
内流；
25.(2)降低细胞质ca
2+
浓度；
26.(3)改善舒张功能；
27.(4)保护心肌细胞。
28.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自：口服液、片剂、胶囊剂、注射剂或颗粒剂。
29.在本发明的第三方面，提供了一种体外的非诊断性，非治疗性的阻断ca
2+
内流和/或降低细胞质ca
2+
浓度的方法，包括步骤：
30.s1)给心肌细胞施用医学有效量的如第一方面所述的药物组合物；
31.s2)所述药物组合物结合钙离子通道的变构位点和中央空腔。
32.在另一优选例中，所述钙离子通道位于心肌细胞上。
33.在另一优选例中，所述钙离子通道为l-型钙离子通道。
34.在另一优选例中，所述心肌细胞选自哺乳动物，优选地为人、大鼠或小鼠。
35.在另一优选例中，所述心肌细胞为h9c2细胞。
36.在本发明的第四方面，提供了一种治疗心衰的方法，包括步骤：给有需要的对象施用医学有效量的第一方面所述的药物组合物。
37.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
38.图1显示了实施例1中，薄荷醇和丙烯菊酯对心肌细胞的保护
39.图2显示了实施例2中，薄荷醇-丙烯菊酯协同保护心肌细胞
40.图3显示了实施例3中，薄荷醇-丙烯菊酯对心肌细胞ldh释放影响及结晶紫染色
41.图4显示了实施例4中，薄荷醇-丙烯菊酯协同抑制ca
2+
内流
42.图5显示了实施例5中，硝苯地平-维拉帕米协同保护心肌细胞
43.图6显示了实施例6中，咪康唑-丙烯菊酯协同保护心肌细胞
44.图7显示了实施例7中，咪康唑-氨苯丁酯协同保护心肌细胞
45.图8显示了实施例8中，硝苯地平-丙烯菊酯协同保护心肌细胞
46.图9显示了实施例9中，硝苯地平-维拉帕米协同抑制ca
2+
内流
具体实施方式
47.本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现一系列能有效抗心衰的药物组合，在此基础上，完成了本发明。
48.具体地，本发明研究发现薄荷醇和丙烯菊酯均有抗心衰作用，并据此开发一种新型的组合药物薄荷醇-丙烯菊酯以及其他几种抗心衰的组合药物，包括硝苯地平-维拉帕米、咪康唑-丙烯菊酯、咪康唑-氨苯丁酯和硝苯地平-丙烯菊酯。
49.术语
50.如本文所用，“本发明的药物组合物”、“一系列可以有效抗心衰的药物组合物”可互换使用，指的是包含以下成分的药物组合物：
51.a)选自下组的第一活性成分:
52.a1)薄荷醇-丙烯菊酯组合；
53.a2)硝苯地平-维拉帕米组合；
54.a3)咪康唑-丙烯菊酯组合；
55.a4)咪康唑-氨苯丁酯组合；
56.a5)硝苯地平-丙烯菊酯组合；
57.a6)任一选自下组的活性成分：薄荷醇、丙烯菊酯、咪康唑、和氨苯丁酯；
58.a7)a1)～a6)中的一种或多种；和/或
59.b)其他药学上可接受的载体、赋形剂或辅料。
60.在另一优选例中，所述辅料选自：稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、乳化剂、着色剂、增溶剂、或其组合。
61.本发明的药物组合物
62.本发明的药物组合物包含的成分如上所述，其配伍如下所述：
63.当所述第一活性成分为薄荷醇-丙烯菊酯组合，其中薄荷醇与丙烯菊酯的用量摩尔比为0.5～1000:0.5～100；较佳地为0.5～20:0.5～20；
64.当所述第一活性成分为硝苯地平-维拉帕米组合，其中硝苯地平与维拉帕米的用量摩尔比为0.5～500:0.5～500；较佳地为0.5～20:0.5～20；更佳地为10～15:10～15；
65.当所述第一活性成分为咪康唑-丙烯菊酯组合，其中咪康唑与丙烯菊酯的用量摩尔比为0.5～200:10～500；较佳地为0.5～10:0.5～20；
66.当所述第一活性成分为咪康唑-氨苯丁酯组合，其中咪康唑与氨苯丁酯的用量摩尔比为0.5～200:0.5～1000；较佳地为0.5～10:0.5～20；更佳地为0.5～10:10～20；
67.当所述第一活性成分为硝苯地平-丙烯菊酯组合，其中硝苯地平与丙烯菊酯的用量摩尔比为0.5～500:0.5～500；较佳地为0.5～20:0.5～20；更佳地为10～20:10～20。
68.施用方法
69.如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性(即抗衰老功能)的且可被人和/或动物所接受的量。
70.如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
71.本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的第一活性成分以及药学上可接
受的载体和辅料。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。这类辅料包括但不限于稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、乳化剂、着色剂、增溶剂、或其组合。
72.通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
73.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的药物组合物每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
74.典型地，当以口服方式给予本发明药物组合物时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。
75.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
76.心衰&l型钙离子通道
77.l型钙通道相关蛋白与心肌细胞中的肾上腺素和心脏肌肉收缩信号通路相关。钙通道阻滞剂可以降低胞内钙离子浓度，引起心肌舒张，直接改善心肌舒张功能，进而缓解心衰。
78.本发明的主要优点包括:
79.(1)本发明首次发现了一系列可以有效抗心衰的药物组合物。
80.(2)本发明的药物组合物可以发挥协同抗心衰的作用。
81.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆:实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
82.实施例1基于心衰疾病模型薄荷醇和丙烯菊酯对心肌细胞的保护作用
83.(1)将大鼠心肌细胞(h9c2)均匀接种在96孔板中，细胞浓度为10000-15000细胞/孔，每孔含有100μl高糖dmem培养基(含1％青霉素+1％链霉素+10％fbs)，96孔板外围加满pbs。
84.(2)细胞培养箱中培养h9c2细胞36h,吸出培养基，然后每孔加入100μlpbs进行润洗，然后吸出pbs。
85.(3)实验分为正常组(ng)，模型组(gd)，恩格列净组(empa)，给药组。正常组加入高糖dmem培养基，模型组加入无血清无糖的dmem培养基。恩格列净组和给药组加入溶有药物
的无血清无糖的dmem培养基。药物处理36h后，用cck8试剂盒检测细胞存活度。
86.测试结果表明100μm-400μm薄荷醇对心肌细胞均有不同程度的保护作用。10μm-25μm丙烯菊酯心肌细胞均有不同程度的保护作用。
87.实施例2薄荷醇和丙烯菊酯对心肌细胞协同保护作用
88.本发明人测试了0-20μm薄荷醇，0-20μm丙烯菊酯，以及他们组合后对h9c2细胞存活度的影响，同时将单药和组合药的细胞存活度输入compusyn(http://www.combosyn.com)计算协同系数。
89.结果显示，0-20μm薄荷醇和0-20μm丙烯菊酯的组合表现出不同程度的细胞保护活性。10μm薄荷醇+10μm丙烯菊酯表现出较优的细胞保护活性(72.1％)，他们协同系数是0.01，表现出明显的协同效果。
90.实施例3薄荷醇和丙烯菊酯ldh和结晶紫染色实验
91.乳酸脱氢酶(ldh)从死细胞中释放，因此被用来衡量细胞损伤。36h h9c2细胞gd处理后，取50μl的上清和50μl反应液(reagent)加入96孔板中。室温避光温育，30分钟后加入50μl的终止液。收集490nm的紫外吸收值，计算ldh的释放量。
92.本发明人发现，相较于模型组，10μm薄荷醇+10μm丙烯菊酯可以明显地减少ldh的释放，这说明10μm薄荷醇+10μm丙烯菊酯可以保护心肌细胞。
93.结晶紫染色可以直观反映细胞的存活度。h9c2细胞接种于12孔板中，每孔100,000的细胞。药物处理并损伤36h后，细胞放置冰上并用预冷的pbs润洗两次。随后加入预冷的甲醇溶液，放置在-20度冰箱10min。吸出甲醇,加入0.5％结晶紫溶液温育10min。染色后，用ddh2o清洗细胞,并拍照。
94.本发明人发现薄荷醇+丙烯菊酯组相较gd组染色面积更多，表明其有明显的细胞保护作用。
95.实施例4薄荷醇和丙烯菊酯影响ca
2+
进入胞内实验
96.钙通道阻滞剂降低细胞质钙浓度，引起心肌舒张，直接改善舒张功能，从而达到抗心衰的作用。薄荷醇和丙烯菊酯均是钙通道阻滞剂，本发明人猜测薄荷醇和丙烯菊酯协同抗心衰的作用是两者同时作用钙通道不同的位点，从而起到协同保护作用。
97.本发明人用ca
2+
荧光探针fluo-4/am测量细胞内ca
2+
浓度。h9c2细胞接种到96孔板中，过夜培养12h后，用hbss缓冲液清洗三次。4μm fluo-4/am溶剂于hbss缓冲液中，并在37℃温育10min。随后细胞用hbss缓冲润洗三次。待测化合物溶于hbss中并加入细胞中温育15min,然后用50mm kcl引发ca
2+
内流。利用酶标仪测试荧光信号。fluo-4/am激发波长为488nm，发射波长为520nm。
98.本发明人发现10μm丙烯菊酯相较于对照组，ca
2+
荧光信号明显下降，而10μm薄荷醇则没有明显地变化。而10μm丙烯菊酯+10μm薄荷醇相较于与单药，ca
2+
荧光信号明显下降，这表明丙烯菊酯和薄荷醇可以协同阻碍ca
2+
内流，从而达到抗心衰的作用。
99.实施例5基于心衰疾病模型硝苯地平和维拉帕米对心肌细胞协同保护作用
100.本发明人测试了0-20μm硝苯地平，0-20μm丙烯菊酯，以及他们组合后对h9c2细胞存活度的影响，同时将单药和组合药的细胞存活度输入compusyn(http://www.combosyn.com)计算协同系数。
101.测试结果表明硝苯地平和维拉帕米可以协同保护h9c2细胞。其中20μm硝苯地平+
20μm维拉帕米表现出较优的细胞保护活性(66.4％)，他们协同系数是0.02，表现出明显的协同效果。
102.实施例6基于心衰疾病模型咪康唑和丙烯菊酯对心肌细胞协同保护作用
103.本发明人测试了0-10μm咪康唑，0-20μm丙烯菊酯，以及他们组合后对h9c2细胞存活度的影响，同时将单药和组合药的细胞存活度输入compusyn(http://www.combosyn.com)计算协同系数。
104.测试结果表明咪康唑和丙烯菊酯可以协同保护h9c2细胞。其中10μm咪康唑+20μm丙烯菊酯表现出较优的细胞保护活性(63.8％)，他们协同系数是0.01，表现出明显的协同效果。
105.实施例7基于心衰疾病模型咪康唑和氨苯丁酯对心肌细胞协同保护作用
106.本发明人测试了0-10μm咪康唑，0-20μm氨苯丁酯，以及他们组合后对h9c2细胞存活度的影响，同时将单药和组合药的细胞存活度输入compusyn(http://www.combosyn.com)计算协同系数。
107.测试结果表明咪康唑和氨苯丁酯可以协同保护h9c2细胞。其中10μm咪康唑+20μm氨苯丁酯表现出较优的细胞保护活性(68.7％)，他们协同系数是0.01，表现出明显的协同效果。
108.实施例8基于心衰疾病模型硝苯地平和丙烯菊酯对心肌细胞协同保护作用
109.本发明人测试了0-20μm硝苯地平，0-20μm丙烯菊酯，以及他们组合后对h9c2细胞存活度的影响，同时将单药和组合药的细胞存活度输入compusyn(http://www.combosyn.com)计算协同系数。
110.测试结果表明硝苯地平和丙烯菊酯可以协同保护h9c2细胞。其中20μm硝苯地平+20μm丙烯菊酯表现出较优的细胞保护活性(76.6％)，他们协同系数是0.009，表现出明显的协同效果。
111.实施例9硝苯地平和维拉帕米影响ca
2+
进入胞内实验
112.本发明人发现20μm硝苯地平和20μm维拉帕米相较于对照组，ca
2+
荧光信号明显下降。而20μm硝苯地平+20μm维拉帕米相较于与单药，ca
2+
荧光信号明显下降，这表明硝苯地平和维拉帕米可以协同作用l-型钙离子通道阻碍ca
2+
内流，从而达到抗心衰的作用。
113.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。