间充质干细胞在制备牙槽骨缺损修复药物中的应用的制作方法

本发明涉及牙槽骨修复技术领域，更具体地说是涉及间充质干细胞在制备牙槽骨缺损修复药物中的应用。

背景技术：

牙槽骨，俗称牙槽突，指上下颌骨包绕、支持牙根的部分，由于口腔卫生环境差、咬合不良、肿块或先天性因素、外部因素，如交通事故、创伤等原因，造成牙槽骨的完整性被破坏，临床上称之为牙槽骨缺损。在正常情况下，牙槽骨包绕牙根，缺损则会造成牙齿松动、脱落，如为外伤引起的牙槽骨缺失，还会引起咬合错乱、脸部外形改变。

目前，医学上牙槽骨修复普遍应用grb技术，普通gbr手术要求是用膜覆盖+骨充填材料，并保持骨生长空间密闭，确保粘膜上皮细胞不长进骨组织，同时可以让骨缺损修复，间充质干细胞在口腔再生医学领域的应用越来越普遍，但是支持其在gbr中效果的临床研究研究仍十分有限。间充质干细胞用于软组织再生的数据比较多，但迄今仍无研究证实它对牙槽骨缺损有骨再生潜能。

因此，如何将间充质干细胞应用于制备牙槽骨缺损修复药物中是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明将间充质干细胞应用于制备牙槽骨缺损修复药物中，首次将间充质干细胞单独应用于牙槽骨修复中，促进了牙槽骨的再生。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

间充质干细胞在制备牙槽骨缺损修复药物中的应用。

一种牙槽骨缺损修复的药物，包括间充质干细胞凝胶和诱导剂，且所述间充质干细胞凝胶和诱导剂的质量比为99∶1。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明使用单纯的干细胞作为骨移植材料，不用gbr盖膜技术，与传统的gbr手术相比本发明没有其他骨充填材料，且没有用任何膜覆盖也能成骨，gbr的原理是用膜去隔离细胞，让骨腔的骨粉生长。本发明则利用细胞再生原理，用干细胞分化为成骨细胞，充填骨腔，颠覆了gbr观念。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为显微镜下观察到的间充质干细胞；

图2附图为200倍目镜荧光检测cd34表达情况图；

图3附图为200倍目镜荧光检测cd45表达情况图；

图4附图为200倍目镜荧光检测cd73表达情况图；

图5附图为200倍目镜荧光检测cd90表达情况图；

图6附图为200倍目镜荧光检测cd105表达情况图；

图7附图为流式细胞仪检测cd73浓度结果图；

图8附图为流式细胞仪检测cd90浓度结果图；

图9附图为流式细胞仪检测cd105浓度结果图；

图10附图为流式细胞仪检测hla-dr表达结果图；

图11附图为流式细胞仪检测cd34结果图；

图12附图为流式细胞仪检测cd45结果图；

图13附图为流式细胞仪检测cd14结果图；

图14附图为流式细胞仪检测cd19结果图；

图15附图为手术患者术前病症表征图；

图16附图为患者病症表征图；

图17附图为手术过程中摘除的囊中图；

图18附图为术前x光显示21牙根吸收及骨破坏图；

图19附图为术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图20附图为术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图21附图术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图22附图术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图23附图术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图24附图术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图25附图术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图；

图26附图术后九个月缺损颊侧骨头ct结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1干细胞富集。

实验试剂

生理盐水、pbs缓冲液、血细胞计数试剂、间充质干细胞培养基、无血清添加物、多聚甲醛固定剂、tritonx-100、bsa、dapi、hla-dr抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd34抗体、cd45抗体、cd73抗体、cd90抗体、cd105抗体、荧光标记山羊抗小鼠抗体、抗粹灭孵育液、抗粹灭封片剂，均购自hyclone公司；

实验耗材：采血管、采血针、96孔培养板、24孔培养板、无菌盖玻片、载玻片、移液管、离心管、巴氏吸管、无菌吸头、ep管、医用变速离心机、血细胞分析仪、co2培养箱、荧光倒置显微镜、超净台、微量移液器、微量电子天平、流式细胞分析仪；

实验方法

富集：

prf细胞层分离采集静脉外周血10ml(普通负压管)，三分钟内放入变速离心机，设定制备程序。离心程序分四个阶段。变速离心结束后，无菌操作台内，打开采血管至消毒器皿，剪切去除上层淡黄色胶体，用5ml生理盐水简单清洗胶冻的红细胞，保留胶体。

增培和传代：

用间充质干细胞专用培养基(购自hyclone公司)进行增培代传，收货p4代细胞。

免疫荧光染色检测：

取待检测细胞，制成单细胞悬液，将细胞接种到预先放置在24孔板里的无菌盖玻片上，于co2培养箱中培养48小时，使待测细胞贴壁。弃去细胞培养基，用pbs洗两次，去除红细胞等非贴壁细胞，加入终浓度为4％的多聚甲醛溶液，室温固定30min，用pbs洗涤盖玻片2次，每次3min。向24孔板中加入透化溶液tritonx-100，室温透化10min，用pbs洗涤2次，每次3min。向24孔板中加入含5％bsa的pbs，室温封闭30min，弃去液体。用pbs以一定的比例稀释一抗，并加入到各个待测孔中，每孔200μl，室温孵育2h，吸弃一抗，pbs洗涤3次，每次5min。以适当的比例稀释荧光染料偶联的二抗，每孔200μl，避光条件下孵30min，吸弃二抗。用pbs冲洗玻片后加入100μl适当浓度的dapi，避光染细胞核10min，吸弃染色液，pbs冲洗后，取出盖玻片，用滤纸吸去盖玻片上的残余液体，在载玻片中间滴一滴抗猝灭的封片剂，然后将盖玻片倒扣在载玻片上以备镜下观察。镜下可见的间充质干细胞如图1所示；200倍目镜荧光检测cd34表达如图2所示；200倍目镜免疫荧光cd45表达如图3所示；200倍目镜免疫荧光检测cd73表达如图4所示；200倍目镜cd90免疫荧光检测表达如图5所示；200倍免疫荧光检测cd105表达如图6所示；

流式细胞术检测细胞标志物：

取单细胞悬液，使其细胞密度为0.5-1×10⁷/ml，且总体积大于800μl。轻轻吹打充分混匀后，将细胞悬液以100μl/管的体积分装至ep管中，在各管中分别加入荧光标记的hla-dr、cd14、cd19、cd45、cd73、cd90和cd105抗体，轻轻吹打混匀。将加完抗体的样品管用锡箱纸遮盖好置于避光处，常温孵育20-30min。孵育完成后，将样品管在4℃条件下，400g离心5min，小心的吸去含抗体的上清液，加500μl的pbs重悬，避光置于4℃待检。检测前轻轻吹打混匀，用流式细胞仪检测，cd73浓度检测如图7所示；cd90浓度检测如图8所示；cd105浓度检测如图9所示；hla-dr表达结果如图10所示；cd34结果如图11所示；cd45结果如图12所示；cd14结果如图13所示；cd19结果如图14所示；

结果分析

根据国际细胞治疗联盟的检测标准，间充质干细胞因表达cd73，cd90，cd105。因此利用流式细胞仪分析，可知，培养液有间充质干细胞及众多辅助生长细胞。(以上结果均由国家药物基因和蛋白筛选实验室出具检测报告)。

临床案例

病历介绍：王xx，男，17岁，因上颌窦骨头压痛半年就诊。检查：21冠折，穿髓，叩痛(++)，松动(+)，21，22，23，24，25牙髓热测试阴性。ct显示21，22，23，24，25根尖巨大囊肿，3.5x3mm质软，压痛。ct显示上颌实底骨板破坏。

诊断：1，21，22，23，24，25死髓牙2.21，22，23，24，25区巨大根尖囊肿321冠折

手术过程：局麻下沿牙槽峭顶切开，剥开粘膜，剔除囊肿，刮干净骨膜，生理盐水和替硝唑抗生素液冲洗，当场完善根管充填治疗清楚超充的牙胶和充填糊剂。发现上颌窦底骨板已经损坏，面积8×10mm。上颌窦粘膜穿孔。松弛上颌窦内膜，用可吸收性缝线围绕松弛的上颌窦粘膜织网，因窦粘膜极薄，不能强力拉扯，还留有间隙大约1mm因为手术空腔极大，空腔上部骨板破坏，有缝隙，因此不能使用传统gbr技术，填骨粉，盖膜。只能在空腔内按照99∶1的质量比填入间充质干细胞凝胶(凝胶由血浆在变速离心后获得，把红细胞滤掉后，血浆中的纤维蛋白就会形成凝胶)和诱导剂(sdf1，又称基质细胞衍生因子，购自hyclone公司)。缝合外部粘膜。

手术患者术前如图15所示；囊肿已经烂穿骨头，如图16所示；摘除的巨大颌骨囊肿如图17所示；术前x光显示21牙根吸收及骨破坏，如图18所示；

手术结果：9个月后，整个空腔内新骨生成。原来裸露的根尖周可见新骨包裹，以及牙骨质线。ct显示腐蚀的骨头新骨增高3mm，且出现骨再生，见图19-图26；

广西医学科学信息研究所查新报告证明吴涛的发明在全世界的文献报道中没有人做过。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。