一种肿瘤载药微颗粒制剂及其制备方法

本申请是申请号2017111565930，申请日2017年11月20日，发明名称一种肿瘤载药微颗粒制剂及其制备方法的分案申请。

本发明涉及药物靶向载体技术领域，尤其涉及一种肿瘤载药微颗粒制剂及其制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤严重危害人类健康，化疗是其治疗的重要手段之一。但传统化疗药物主要针对普通肿瘤细胞，而缺氧的肿瘤深部存在一群数量极少的具有自我更新能力、多向分化潜能、体内成瘤能力强的肿瘤干细胞(或称肿瘤起始细胞、肿瘤再生细胞)，由于其高表达抗凋亡蛋白和abc转运蛋白、极强的dna修复能力等而具有高度耐药性，是导致肿瘤复发和转移的主要原因。

纳米载药系统由于具有epr效应，能够提高肿瘤靶向性、增强化疗药物疗效并降低毒副作用而被广泛用于肿瘤治疗。目前已有报道利用人工合成纳米载体负载抗肿瘤药物或肿瘤干细胞信号通路(如wnt,tgf-β,notch,hedgehog)抑制剂来杀伤肿瘤干细胞。由于纳米材料是外源性物质，其本身对生物机体存在一定的毒副作用，同时很多纳米材料的生产及工艺要求高，成本大，不利于临床推广应用。

胞外囊泡(extracellularvesicles，evs)是释放到细胞外的膜性小囊泡，在生理或病理条件下发挥重要作用，且囊泡具有低免疫原性、优良的体内循环稳定性及高细胞靶向性等特点。微颗粒(microparticles)是细胞在相关信号的刺激下触发细胞膜下的骨架变化，导致细胞膜在局部向外膨出，包裹细胞内容物，并以囊泡的形式释放到细胞外所产生的一类胞外囊泡，其粒径在100-1000nm。肿瘤细胞来源载药微颗粒能有效杀伤肿瘤细胞且能逆转肿瘤干细胞的耐药性，为肿瘤生物治疗开辟了新的途径。但这种肿瘤细胞来源的载药微颗粒不能更深地渗透到肿瘤深部且更多地杀伤肿瘤干细胞。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒不能渗透至肿瘤深部以杀伤较多肿瘤干细胞的问题，提供一种肿瘤载药微颗粒制剂及其制备方法。

本发明提供的一种肿瘤载药微颗粒制剂，包括源自肿瘤干细胞凋亡释放的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药。大量研究表明，纳米特征，如粒径、表面电位、软硬度等深刻影响纳米药物体内过程，进而影响其抗肿瘤效果。与硬的纳米粒相比，软纳米粒血液循环中的液动力使其更容易变形，不易于被网状内皮系统吞噬，因而有利于其体内长循环，增加到达肿瘤组织的机会而有助于肿瘤富集。肿瘤干细胞相对于分化的肿瘤细胞更软，所分泌的囊泡也更软，更加容易变形并高效摄取干细胞来源的载药微颗粒，更利于其在体内血液长循环、靶向性更强，更深入的穿透至肿瘤深部，于肿瘤处富集，从而增强对肿瘤干细胞的杀伤作用，提高抗肿瘤效果。

优选地，所述肿瘤干细胞是用三维软纤维蛋白胶与肿瘤细胞于培养基中混合培养制得。三维软纤维蛋白胶培养得到的肿瘤干细胞增殖良好、细胞存活率较高。

优选地，所述肿瘤细胞与三维软纤维蛋白胶在培养基中的含量比为1～1.5×10⁴个:1.5～2mg。本发明是基于机械力学筛选肿瘤干细胞，优选的配比是最合适的机械力形成条件，在此条件下，能更多的形成肿瘤干细胞。

优选地，所述肿瘤细胞源自于急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌或皮肤癌中的肿瘤细胞；所述化疗药包括治疗急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌及多种其他实体肿瘤的化疗药中的一种或多种。所述化疗药的最高量取决于所使用的化疗药在微颗粒中的最大饱和度，故在最高范围内可以得到不同规格的药剂。用于包裹化疗药的微颗粒可以是与所要治疗的肿瘤细胞不同种来源，也可以是同种来源，优选与所要治疗的肿瘤细胞同种的肿瘤干细胞。所述载药微颗粒制剂的剂型可为注射制剂或口服制剂。

优选地，所述载药微颗粒制剂的粒度为200～600nm。所述载药微颗粒制剂为纳米尺寸，更有利于载药微颗粒制剂在肿瘤部位富集、穿过肿瘤血管并渗透肿瘤深部、更有效地被普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞摄取来杀伤普通肿瘤细胞及肿瘤干细胞，对正常组织不会产生任何损伤，避免使用外源性材料作为载体而对机体产生的毒害作用。

本发明还提供了一种肿瘤载药微颗粒制剂的制备方法，包括以下步骤：

s1：肿瘤干细胞的筛选：用含三维软纤维蛋白胶的培养基培养肿瘤细胞，筛选出肿瘤干细胞克隆球，即得到肿瘤干细胞；

s2：将化疗药物处理所述肿瘤干细胞使之凋亡，收集凋亡细胞所释放的载药微颗粒，该载药微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药后形成的所述肿瘤载药微颗粒制剂；或

使用紫外线照射所述肿瘤干细胞使之细胞凋亡，收集凋亡细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与化疗药进行孵育，使化疗药物被所述细胞囊泡包裹，收集载药微颗粒，即得到所述肿瘤载药微颗粒制剂。

优选地，所述步骤s1中，肿瘤干细胞的筛选具体步骤为：预先将肿瘤细胞用培养基培养稀释至1～1.5×10⁴个/ml，得到肿瘤细胞悬液，再与1.5～2mg/ml的三维软纤维蛋白胶以体积比1:1混合，向其中加入凝血酶混匀得到混合液后加入培养基中进行培养，将形成的肿瘤干细胞克隆球挑选出，即得到肿瘤干细胞。所述培养基可根据肿瘤来源不同而采用不同的培养基，优选rpmi1640培养基，在将混合液加入rpmi1640培养基中培养前，可先将1μl的凝血酶(0.1u/μl)加入预冷的96孔板中，再加入至肿瘤细胞悬液和三维软纤维蛋白胶混合的50μl混合物中得到混合液，再将所述混合液加入200μlrpmi1640完全培养基中培养。本发明是基于机械力学筛选肿瘤干细胞，优选的配比是最合适的机械力形成条件，在此条件下，能更多的形成肿瘤干细胞。

优选地，在加入所述rpmi1640培养基之前，将所述混合液于37℃的温度下孵育10～15min。优选的时间是保证三维软纤维蛋白胶更好的固化形成合适的机械力。

优选地，在使所述肿瘤干细胞克隆球凋亡之前还包括用肿瘤干细胞培养基对肿瘤干细胞进行扩大培养的步骤；所述肿瘤干细胞培养基为：含2g/ml的hla-b27(属于hla抗原)、20ng/ml小鼠表皮细胞生长因子和1g/ml的谷氨酰胺的dmem-f12培养基。优选的肿瘤干细胞培养基是使经三维软纤维蛋白胶筛选形成的干细胞能在保持干性特征的情况下大量扩增。

优选地，所述步骤s2中，在4～6℃低温下、以200～20000g的离心力收集载药微颗粒。优选地离心条件可以将肿瘤干细胞分泌的粒径在200～600nm的囊泡更有效的富集。

本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)将源自经过含三维软纤维蛋白胶的培养基中培养后的肿瘤干细胞来源的微颗粒作为本发明的药物制剂的载体，解决了外源载体给药对机体的毒副作用，同时使作为有效成分的化疗药在肿瘤部位富集、肿瘤深部穿透及被肿瘤细胞摄取，使本发明的载药微颗粒在降低化疗药对正常细胞的毒副作用的同时，提高了化疗药对肿瘤细胞的杀伤效果。

(2)通过含三维软纤维蛋白胶的培养基培养得到的肿瘤干细胞，其凋亡释放得到的微颗粒作为载体，相较于普通肿瘤细胞来源的微颗粒，具有较好的肿瘤干细胞靶向性，利于提高化疗药深入肿瘤深部，增强对肿瘤干细胞的杀伤效果。

(3)肿瘤细胞具有无限增殖的特性，且肿瘤细胞在三维软纤维蛋白胶中培养都有形成肿瘤干细胞的能力，根据本发明记载的方案可从肿瘤细胞中获得大量的肿瘤干细胞来源的微颗粒用于制备本发明的药物制剂，成本小，操作简单。

附图说明

图1为肿瘤干细胞经过化疗药处理后产生的载药微颗粒激光共聚焦图；

图2为肿瘤干细胞经紫外线处理后释放的微颗粒与化疗药孵育产生的载药微颗粒激光共聚焦图；

图3为载药微颗粒在肿瘤组织中的蓄积影响结果图；

图4为载药微颗粒在肿瘤细胞团中的激光共聚焦图；

图5为小鼠肝癌细胞对肿瘤干细胞来源的载药微颗粒的摄取影响结果图；

图6为肿瘤干细胞来源的载药微颗粒对小鼠肝癌细胞的杀伤作用影响结果图；

图7为肿瘤干细胞对肿瘤干细胞来源的载药微颗粒的摄取影响结果图；

图8为肿瘤干细胞来源的载药微颗粒在体内肿瘤干细胞的蓄积影响结果图；

图9为肿瘤干细胞来源的载药微颗粒对体内肿瘤干细胞的杀伤作用影响结果图；

图10为本发明的载药微颗粒对更多肿瘤细胞的应用图；

图11a为小鼠肝癌干细胞来源的载阿霉素微颗粒抑制h22皮下瘤小鼠肝癌生长结果图；

图11b为h22皮下瘤小鼠使用载阿霉素微颗粒的存活时间影响结果图；

图11c为小鼠肝癌干细胞来源的载阿霉素微颗粒抑制肝癌h22皮下瘤肿瘤质量影响结果图；

图12a为小鼠肝癌干细胞来源载5-氟尿嘧啶的微颗粒抑制肝癌h22皮下瘤的生长影响结果图；

图12b为肝癌h22皮下瘤小鼠使用肝癌干细胞来源载5-氟尿嘧啶的微颗粒治疗的存活时间影响结果图；

图12c为小鼠肝癌干细胞来源载5-氟尿嘧啶的微颗粒抑制肝癌h22皮下瘤肿瘤质量影响结果图；

图13a为小鼠黑色素瘤干细胞来源的载药微颗粒抑制黑色素瘤小鼠肺部转移生长图；

图13b为小鼠黑色素瘤干细胞来源的载药微颗粒延长荷瘤小鼠的存活时间影响结果图；

图14a为小鼠注射肿瘤干细胞来源的载药微颗粒组的肌酸激酶含量影响结果图；

图14b为小鼠注射肿瘤干细胞来源的载药微颗粒组的谷丙转氨酶含量影响结果图；

图14c为注射肿瘤干细胞来源的载药微颗粒组的小鼠体重影响结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明使用的术语“细胞囊泡”是由凋亡肿瘤细胞产生的，没有包裹化疗药，“载药微颗粒”是由细胞囊泡包裹化疗药后形成。本发明中所述的包裹在细胞囊泡中的“化疗药”，可以是被临床应用的化疗药，也可以是临床应用的化疗药物中的有效成分，本发明中所涉及的药物剂量，均应理解为该药物的有效成分量。

通过诱导肿瘤干细胞凋亡释放得到细胞囊泡，可通过本领域技术人员可知的方法将化疗药包裹进所述细胞囊泡中从而得到载药微颗粒。对于载药微颗粒的收集可使用高速离心机在低温条件下进行分离。根据本领域技术人员公知的判断标准，如观察到肿瘤细胞缩小、折光变暗，即可认为细胞凋亡。将细胞囊泡与化疗药进行孵育使细胞囊泡包裹化疗药可以通过在室温条件下将添加了化疗药的细胞囊泡体系进行2～4小时的静置来实现。

下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：

h22小鼠肝癌细胞、人肝癌细胞系hepg2、小鼠皮肤癌细胞系b16，均可从美国atcc公司或中国典型物保藏中心cctcc购买。

balb/c小鼠，c57小鼠，均购自武汉大学医学实验动物中心，体重18-20克；

阿霉素、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)购自sigma公司，fibrinogen购自reagentproteins公司，5-氟尿嘧啶购自阿拉丁公司。

实施例1：使用化疗药诱导小鼠肝癌干细胞凋亡产生的肿瘤载药微颗粒制剂

1、实验材料和试剂

h22小鼠肝癌细胞、阿霉素(带有红色荧光)、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)(绿色荧光染料)。

2、实验步骤

1)在rpmi1640细胞培养液中培养h22小鼠肝癌细胞，h22细胞预先用rpmi1640培养基稀释至1×10⁴个/ml，得到细胞悬液，将软纤维蛋白胶用t7缓冲液稀释至2mg/ml的溶液，将所述溶液与h22细胞悬液以体积比1:1混匀，得到混合物；在预冷的96孔板中加入1μl凝血酶(0.1u/μl)，并与50μl上述混合物吹打混匀，得到混合液，在37℃条件下孵育15min后，将所述混合液加入200μl的rpmi1640完全培养基中，培养6天后得到肿瘤干细胞克隆。将其从96孔板中取出，在无血清dmem/f12培养基(含2g/mlhla-b27、20ng/ml小鼠表皮细胞生长因子和1g/ml谷氨酰胺的dmem-f12培养基)中扩大培养，使细胞量达到2×10⁷。

2)将上述h22小鼠肝癌干细胞采用绿色荧光染料cfse按常规方法进行标记。

3)对取出的h22小鼠肝癌干细胞(带细胞培养液)施用阿霉素，使阿霉素在培养液中的终浓度为200μg/ml。

4)在施用阿霉素后的24h，对凋亡肿瘤干细胞实施分离。取上清进行逐步离心，以200g、600g的转速各离心10min后，以14000g的离心力离心1min，以除去细胞及碎片，取离心后的上清进一步以20000g的离心力离心1h，得到来自h22小鼠肝癌干细胞凋亡所产生的载药微颗粒。

3、实验结果

将上述得到的载药微颗粒用0.9％(即0.9g/ml)的生理盐水重悬后，涂片，在激光共聚焦显微镜下观察，从图1可以看出，施用阿霉素的h22小鼠肝癌干细胞产生的载药微颗粒，涂片后可以观察到红色(图1b)和绿色(图1a)的荧光，且红色荧光和绿色荧光重叠显示黄色(图1c)。由于单个的阿霉素分子极小，无法使用荧光显微镜分辨，只有被包裹后才能聚集而被观察到，在荧光显微镜下观察到的红色正是细胞囊泡包裹化疗药阿霉素所发出的红光；绿色是由于细胞标记了绿色荧光后，分泌的微颗粒被染上绿色；并且绿色和红色共定位，说明阿霉素包裹在了微颗粒中。可以看出肿瘤干细胞经过化疗药处理后，形成了载药微颗粒，大小在500nm左右，证实微颗粒包裹了化疗药。

实施例2：使用紫外线诱导小鼠肝癌干细胞凋亡产生的微颗粒与化疗药孵育后获得载药微颗粒。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，紫外线装置为常规细胞超净工作台所有，阿霉素同实施例1。

2、实验步骤

1)培养h22小鼠肝癌干细胞，使细胞量达到2×10⁷，培养方法同实施例1。

2)对h22小鼠肝癌干细胞(带细胞培养液)用紫外线照射60min。

3)在紫外线照射后的24h，对凋亡的肿瘤干细胞培养液的上清进行逐步离心，方法同实施例1，得到该肿瘤干细胞的微颗粒。

4)将所获得的微颗粒用1ml的0.9％(即0.9g/ml)的生理盐水重悬后，加入阿霉素，使阿霉素终浓度为200μg/ml，然后再室温孵育2h，之后以20000g的离心力离心1h，采用pbs清洗2次并以20000g的离心力离心1h，获得载药微颗粒。

3、实验结果

将上述得到的载药微颗粒用0.9％的生理盐水重悬后，涂片，在激光共聚焦显微镜下观察，从图2中可以看出，施用阿霉素的h22小鼠肝癌干细胞产生了载药微颗粒，涂片后可以观察到红色(图2b)和绿色(图2a)的荧光，且红色荧光和绿色荧光重叠显示黄色(图2c)，证实肿瘤干细胞经紫外线照射后，释放了微颗粒，并且与化疗药孵育后，该微颗粒包裹了化疗药。

实施例3：载药微颗粒在肿瘤组织中的蓄积

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1、化疗药阿霉素商购获得、balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)培养h22小鼠肝癌细胞和肝癌干细胞，使细胞量分别达到2×10⁷，其中h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)从上述培养的细胞中取1×10⁷个细胞施用阿霉素，使阿霉素的终浓度达到200μg/ml，剩下的细胞继续培养，不进行任何处理。

3)在施用化疗药后的24h，按照实施例1的方法收集来自h22小鼠肝癌干细胞的载药微颗粒；收集来自h22小鼠肝癌细胞的载药微颗粒。

小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：在balb/c小鼠背部右下侧近右下肢处皮下接种肝癌h22细胞悬液100μl(细胞数为1×10⁵)，建立小鼠肝癌h22皮下瘤模型。

当小鼠肝癌h22皮下瘤长到体积为0.09～0.12cm³时，随机将荷有肝癌h22皮下瘤的小鼠(18g～22g)分为3组，每组6只。将所制备的h22小鼠肝癌干细胞来源的载药微颗粒以0.5mg(阿霉素当量)/kg的给药量、200μl的剂量分别经尾静脉注射6只balb/c小鼠作为实验组，将所制备的h22小鼠肝癌细胞来源的载药微颗粒以0.5mg(阿霉素当量)/kg的给药量、200μl的剂量分别经尾静脉注射6只balb/c小鼠作为对照组1；同时对另外6只balb/c小鼠注射相同剂量的游离阿霉素，作为对照组2。尾静脉注射48h后各组处死小鼠，取出肿瘤并制备成组织匀浆，通过荧光分光光度法检测其中的药物含量。

3、实验结果

从图3的组织分布图可知，尾静脉注射载药微颗粒48h后肿瘤中的阿霉素的浓度要远高于注射游离阿霉素组；注射肿瘤干细胞来源的载药微颗粒的实验组中，阿霉素在肿瘤部位的浓度显著高于注射普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒对照组，表明肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能在肿瘤部位更多的富集。

实施例4：载药微颗粒在肿瘤细胞团中的穿透。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，fibrinogen购自reagentproteins公司。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

h22肿瘤细胞团的获得方法同实施例1，待细胞团生长至第6天，将所制备的h22小鼠肝癌干细胞来源的载药微颗粒、普通肝癌细胞来源的载药微颗粒以及游离阿霉素以0.5μg/ml的浓度加入细胞团中孵育6h。通过pbs洗3次后用4％多聚甲醛固定30min后用激光共聚焦显微镜成像。阿霉素通过ex＝488nm、em＝560nm的滤光片进行观察。

3、实验结果

由图4所示(图中灰度区域为阿霉素的荧光分布区域)，肿瘤干细胞来源的载药微颗粒在h22肿瘤细胞团不同层面的阿霉素荧光强度，均显著性高于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒和游离阿霉素处理组。表明肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能在h22肿瘤细胞团中深部穿透，说明肿瘤干细胞来源的载药微颗粒具有良好的肿瘤深部穿透能力。

实施例5:小鼠肝癌细胞对肿瘤干细胞来源的载药微颗粒的摄取。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

将所制备的h22小鼠肝癌干细胞来源的载药微颗粒、h22小鼠肝癌细胞来源的载药微颗粒以及游离阿霉素与h22小鼠肝癌细胞孵育不同时间，分别为实验组，对照组2和对照组1。通过流式细胞仪分析细胞中阿霉素荧光的含量，确定肿瘤细胞对载药微颗粒的摄取量。

3、实验结果

如图5所示，h22细胞对h22肝癌干细胞来源的载药微颗粒摄取量最多，且摄取量显著多于普通肝癌细胞来源的载药微颗粒和游离的药物。表明本发明提供的肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能被肿瘤细胞大量摄取。

实施例6：肿瘤干细胞来源的载药微颗粒对小鼠肝癌细胞的杀伤作用。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

4)将肝癌干细胞来源的载药微颗粒(实验组)和普通肝癌细胞来源的载药微颗粒(对照组2)与肿瘤h22细胞在96孔板中共同培养48h，观察肿瘤细胞的凋亡，与肿瘤细胞共同培养的载药微颗粒应为从同种类型肿瘤细胞获得的微颗粒包裹化疗药后形成的载药微颗粒。同时对肿瘤细胞施用游离的阿霉素(对照组1)使终浓度为0.5μg/ml，处理48h后，观察肿瘤细胞的死亡。

3、实验结果

如图6所示，游离的化疗药阿霉素能杀伤h22小鼠肝癌细胞，但仍有一定量的肿瘤细胞存活；而含有化疗药的肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能够使大多肿瘤细胞死亡，其杀伤细胞效果显著高于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒。表明本发明的以肿瘤干细胞微颗粒包裹化疗药形成的载药微颗粒在施用到肿瘤细胞后，显著提高了作为有效成分的化疗药的治疗效果。

实施例7:肿瘤干细胞对肿瘤干细胞来源的载药微颗粒的摄取。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

将所制备的h22小鼠肝癌干细胞来源的载药微颗粒、h22小鼠肝癌细胞来源的载药微颗粒、游离阿霉素与h22肿瘤干细胞孵育不同时间，分别为实验组，对照组2和对照组1。通过流式细胞仪分析h22肿瘤干细胞中阿霉素荧光的含量，确定肿瘤干细胞对载药微颗粒的摄取量。

3、实验结果

如图7所示，h22肿瘤干细胞对h22肝癌干细胞来源的载药微颗粒摄取量最多，且摄取量显著多于普通h22细胞来源的载药微颗粒和游离的药物。表明本发明提供的肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能被肿瘤干细胞大量摄取。

实施例8：体内载药微颗粒在肿瘤干细胞的蓄积。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：同实施例3。

给药方法同实施例3，将所制备的h22小鼠肝癌干细胞的载药微颗粒尾静脉注射4只balb/c小鼠作为实验组，将所制备的h22小鼠肝癌细胞的载药微颗粒尾静脉注射4只balb/c小鼠作为对照组2；同时对另外4只balb/c小鼠注射相同剂量的游离阿霉素，作为对照组1。

24h后将各组的小鼠处死，取出肿瘤组织并制备成组织匀浆，通过流式细胞仪分析其中具有肿瘤干细胞特性的侧群细胞中阿霉素荧光的含量，确定化疗药在肿瘤干细胞的蓄积量。

3、实验结果

如图8所示，肿瘤组织中的侧群细胞对h22肝癌干细胞来源的载药微颗粒摄取量最多，且摄取量显著多于普通h22细胞来源的载药微颗粒和游离的药物。表明本发明提供的肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能靶向肿瘤干细胞并且能被肿瘤干细胞大量摄取。

实施例9：体内载药微颗粒对肿瘤干细胞的杀伤作用。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：同实施例3。

给药方法同实施例3。将所制备的h22小鼠肝癌干细胞的载药微颗粒尾静脉注射4只balb/c小鼠作为实验组，将所制备的h22小鼠肝癌细胞的载药微颗粒尾静脉注射4只balb/c小鼠作为对照组3；同时对另外8只balb/c小鼠分别注射相同剂量的游离阿霉素和0.9％的生理盐水，分别作为对照组2和1。同样的操作和给药量，每组均每两天注射一次，连续14天。

第16天将各组的小鼠处死，取出肿瘤并制备成组织匀浆，通过流式细胞仪分析其中的侧群细胞的比例，确定肿瘤干细胞的含量。

3、实验结果

如图9所示，经药物治疗后，h22肝癌干细胞来源的载药微颗粒组侧群细胞比例最小，说明其对肝癌干细胞有高的杀伤率，效果均显著好于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒和单纯的游离阿霉素。表明本发明提供的肿瘤干细胞来源的载药微颗粒能靶向肿瘤干细胞并且杀伤肿瘤干细胞，获得良好的化疗效果。

实施例10：更多肿瘤细胞的应用。

1、实验材料和试剂

不同肿瘤细胞系包括：人肝癌细胞系hepg2，小鼠皮肤癌细胞系b16；化疗药阿霉素商购获得。

2、实验步骤

1)在dmem培养液中培养肿瘤细胞，使细胞量分别达到2×10⁷个，同时培养肿瘤干细胞，使细胞量分别达到2×10⁷个，培养方法同实施例1。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

4)实验方法同实施例6。

3、实验结果

如图10所示，各种肿瘤干细胞来源的载药微颗粒对其来源的肿瘤细胞有高的杀伤率，而且效果均要显著好于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒和游离的药物，表明本发明提供的制剂适用多种肿瘤细胞，且可获得良好的治疗效果。

实施例11：小鼠肝癌干细胞来源的载阿霉素微颗粒对h22皮下瘤小鼠生长的影响

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：同实施例3。

给药方法同实施例3。将所制备的h22小鼠肝癌干细胞的载药微颗粒尾静脉注射16只balb/c小鼠作为实验组，将所制备的h22小鼠肝癌细胞的载药微颗粒尾静脉注射16只balb/c小鼠作为对照组3；将16只balb/c小鼠注射相同剂量的游离阿霉素，作为对照组2。剩下一组16只balb/c小鼠注射相同体积的pbs，作为对照组1。同样的操作和给药量，每组均每两天注射一次，连续14天。

3、实验结果

将实验组和对照组中的小鼠都分为等数量的两部分，其中一部分每天用游标卡尺测量肿瘤的最长处(l)和最宽处(w)，计算肿瘤体积v＝l×w²/2。第16天将各组的小鼠处死，剥出皮下瘤并称重。另外一部分用于观察存活时间。

结果表明，实验组中h22小鼠肝癌干细胞来源的载阿霉素微颗粒能显著抑制小鼠h22肝癌的生长(如图11a和11c所示)，并延长小鼠的存活时间(如图11b所示)，其中肿瘤干细胞来源的载药微颗粒效果要明显好于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒和游离阿霉素。

实施例12：小鼠肝癌干细胞来源的载5-氟尿嘧啶微颗粒对h22皮下瘤小鼠生长的影响

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药5-氟尿嘧啶商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：同实施例3。

给药方案同实施例9。

3、实验结果

将实验组和对照组中的小鼠都分为等数量的两部分，其中一部分每天用游标卡尺测量肿瘤的最长处(l)和最宽处(w)，计算肿瘤体积v＝l×w^2/2，第16天将各组的小鼠处死，剥出皮下瘤并称重。另外的一部分用于观察存活时间。

结果表明实验组中h22小鼠肝癌干细胞来源的载5-氟尿嘧啶的微颗粒能显著抑制小鼠h22肝癌的生长(如图12a和12c所示)，并延长小鼠的存活时间(如图12b所示)，其中肿瘤干细胞来源的载药微颗粒效果明显好于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒和游离的药物。

实施例13：载药微颗粒抑制肺转移瘤生长、延长荷瘤小鼠的存活时间。

1、实验材料和试剂

使用的b16-f10小鼠黑色素瘤细胞同实施例8，化疗药阿霉素商购获得，c57bl/6小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)培养b16-f10小鼠黑色素瘤细胞和其干细胞，使细胞量分别达到3×10⁷，培养方法同实施例8。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

小鼠b16-f10肺转移瘤模型的建立：在c57bl/6小鼠尾部静脉注射b16-f10细胞悬液100μl(细胞数为5×10⁵)，建立小鼠肺转移瘤模型。

注射b16-f10细胞24h后，随机将c57bl/6小鼠分为4组，每组16只。给药方法同实施例3，将所制备的b16-f10小鼠黑色素瘤干细胞的载药微颗粒尾静脉注射16只c57bl/6小鼠作为实验组；将所制备的b16-f10小鼠黑色素瘤细胞的载药微颗粒注射16只c57bl/6小鼠作为对照组3；将16只c57bl/6小鼠注射相同剂量的阿霉素，作为对照组2；剩下一组16只c57bl/6小鼠注射相同体积pbs，作为对照组1。同样的操作和给药量，每组均每两天注射一次，连续14天。

3、实验结果

将实验组和对照组中的小鼠都分为等数量的两部分，其中一部分在21天将各组的小鼠处死，取出肺组织，记录结节数，另外一部分用于观察存活时间。

结果表明，实验组中b16-f10小鼠黑色素瘤干细胞来源的载药微颗粒能显著抑制小鼠肿瘤肺部转移(如图13a所示)，并延长小鼠的存活时间(如图13b所示)，其中肿瘤干细胞来源的载药微颗粒效果明显好于普通肿瘤细胞来源的载药微颗粒和游离的药物。

实施例14：载药微颗粒的生物安全性。

1、实验材料和试剂

使用的h22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素商购获得，balb/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤

1)h22小鼠肝癌干细胞的培养方法同实施例1，h22小鼠肝癌细胞用rpmi1640培养基培养。

2)化疗药处理方法同实施例3。

3)载药微颗粒收集方法同实施例1。

4)小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：同实施例3。

给药方法同实施例3。将所制备的h22小鼠肝癌干细胞的载阿霉素微颗粒经尾静脉注射6只balb/c小鼠作为实验组，将所制备的h22小鼠肝癌细胞的载阿霉素微颗粒尾静脉注射6只balb/c小鼠作为对照组1；同时对另外12只balb/c小鼠分别注射相同剂量的游离阿霉素和0.9％的生理盐水，分别作为对照组2和3。同样的操作和给药量，每组均每两天注射一次，连续14天。

5)第15天，分别对实验组、对照组1、对照组2和对照组3小鼠取静脉血，检测血清中谷丙转氨酶和肌酸激酶含量，并称量小鼠体重。

3、实验结果

结果表明，相比于注射生理盐水的对照组小鼠，注射载阿霉素微颗粒组小鼠的谷丙转氨酶含量没有明显变化(如图14b所示)，体重也无明显变化(如图14c所示)，并且注射肿瘤干细胞来源的载药微颗粒组的肌酸激酶低于所有对照组(如图14a所示)，说明其心脏毒性很低。可见，用肿瘤干细胞来源的载药微颗粒制剂对机体基本没有毒副作用。

综上，本发明提供的载药微颗粒更有利于在肿瘤组织高度富集、肿瘤深部穿透及更易被普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞有效摄取，提高化疗药物对普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞的杀伤，增强肿瘤的治疗效果，同时降低化疗药物对机体的毒副作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。