具有美白功效的中药组合物的制作方法

本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，具体涉及一种具有美白功效的中药组合物，该中药组合物的制备方法以及应用。
背景技术：
：皮肤颜色的深浅受多种因素调控，但主要仍取决于黑色素的含量及分布。黑色素的数量与性别和人种无关，但随年龄增长而递减；并且由日光照射程度的差异导致在人体的不同部位有显著区别。现有研究表明，当黑色素细胞将黑色素小体转运至邻近的皮肤角质细胞时，将导致胶质细胞产生变化，使黑色素在皮肤细胞内沉积，从而皮肤颜色加深。同时，皮肤中黑色素沉着还与黑色素小体形成、黑色素稳定合成、黑色素小体转运及各个阶段相关基因的转录激活密切相关。目前主要由l-酪氨酸(l-tyrosine)氧化作为黑色素合成的起始步骤，酪氨酸酶(tyrosinase)将l-酪氨酸氧化为多巴醌，随后多巴醌发生自氧化转变为多巴(dopa)与多巴色素，多巴色素在酪氨酸酶相关蛋白1/2(tyrosinaserelatedprotein1/2，trp-1/trp-2)作用下转化为5,6-二羟基吲哚羧酸(dhica)和5,6-二羟基吲哚(dhi)，进一步被氧化成真黑素；而在半胱氨酸或谷胱甘肽作用下，多巴醌形成半光氨酰多巴进而合成褐色素，真黑素与褐色素形成混合色素，再由黑色素细胞树突转运至表皮基底层细胞，随着细胞新陈代谢被带到角质层中，伴随角质层脱落而排出。溶质转运蛋白slc3a2位于染色体11q12.3，其编码的蛋白也称为cd98hc蛋白，在正常的皮肤稳态维持和皮肤受伤修复中有重要作用。溶质转运蛋白(slc3a2)是一种2型转运蛋白，它的细胞膜外部可以与左旋氨基酸转运蛋白(l-typeaminoacidtransporter-1，lat1)共价结合为二聚体从而构成一个氨基酸转运系统。黑素相关转运蛋白rab27a是一种小分子g蛋白，这种蛋白可通过其c末端固定于黑素体膜，并和黑素亲和素蛋白(melanophilin，mlph)、肌球蛋白va(myosinva，myova)构成三联分子复合物，参与黑素细胞中黑素体的转运过程。第五类非典型肌球蛋白(myov或myo5)是目前研究最为深入的一类非典型肌球蛋白。在哺乳动物中，肌球蛋白v(myov或myo5)参与黑色素颗粒的转运，与皮肤的颜色深浅有关。肌球蛋白va(myova或myo5a)与皮肤颜色尤其相关。现有技术中虽有披露西红花、人参、虎杖等单味药材的一些功效，例如cn201911230731.4公开了西红花提取物具有美白功效；又如cn201510776857.7公开了虎杖提取物含有虎杖苷，具有美白保湿作用；再如cn201910928223.7公开了当归提取物具有美白功效，但是，本发明意外地发现，含有西红花、人参、荷花、虎杖、川芎及当归的6味复方提取物具有令人惊讶的协同美白功效，该复方提取物可以作为具有美白功效的添加剂应用于化妆品中。现有技术均没有披露本发明中所述的6味中药材复方提取物的美白功效优于单味药提取物，呈现出了协同增效的意外有益效果。而且，以往美白功效均已抑制酪氨酸酶或抑制黑色素为主要功效研究方向，没有披露本发明中含有西红花的复方提取物具有黑色素转运方向的相关机理。本发明意外地发现，包含西红花复方提取物，具有优异的抑制酪氨酸酶活性及下调slc3a2、rab27a、myo5a基因的作用。技术实现要素：本发明的一方面，提供了一种中药组合物在非治疗目的的美白中的用途，所述中药组合物包含：西红花提取物1-10重量份，人参提取物15-40重量份，荷花提取物15-35重量份，虎杖提取物15-30重量份，川芎提取物10-25重量份，当归提取物10-25重量份，其中，所述西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物、当归提取物采用溶剂超声提取法制备。在优选的实施方式中，本发明中药组合物中西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物、当归提取物的重量比为0.1-0.5:1-3:1-2:0.5-2:1-2:1-2。在更优选的实施方式中，本发明中药组合物中西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物、当归提取物的重量比为0.1:3:2:2:1:1。在优选的实施方式中，本发明所述的提取物采用乙醇，优选70体积％的乙醇进行提取。在优选的实施方式中，本发明中药组合物的美白效果通过下调slc3a2、rab27a和/或myo5a实现。另一方面，本发明提供了中药组合物在制备具有美白功效的皮肤外用剂中的用途，所述中药组合物包含：西红花提取物1-10重量份，人参提取物15-40重量份，荷花提取物15-35重量份，虎杖提取物15-30重量份，川芎提取物10-25重量份，当归提取物10-25重量份，其中，所述西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物、当归提取物采用溶剂超声提取法制备。在优选的实施方式中，所述皮肤外用剂包含0.01-5重量％的中药组合物。附图说明下面结合附图进一步说明本发明。图1显示了本申请实施例7提取物和烟酰胺的基因检测结果。其中，jp-4为15.625μg/ml烟酰胺，zyzy2019-55为0.125％(v/v)实施例7提取物。发明详述除非另有定义，否则本文使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。另外，将本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献以引用方式并入本文中。除非另有指明，否则百分比是指重量百分比。本文所用的“化妆品”指能保持、恢复、赋予、刺激或增强体美外观或者似乎能增进美貌或年轻的美容物质或制品，具体地涉及到组织或皮肤的外观。本文所用的“化妆品上有效量”是指足以治疗一种或多种皮肤老化迹象、但充分低以避免严重副作用的生理活性化合物或组合物的量。化合物或组合物的美容上有效量要随以下因素而变：所治疗的具体病症、最终用户的年龄和身体状况、所治疗/预防的病症的严重程度、治疗的持续时间、其他治疗的性质、所采用的具体化合物或产品/组合物、所具体采用的美容上可接受的载体等等。西红花提取物本发明的中药组合物包含西红花提取物。西红花，为鸢尾科番红花crocussativusl.的柱头。别名有藏红花、番红花等。性甘，平。归心、肝经。有活血祛瘀，散郁开结的作用。现代研究表明西红花具有抗氧化、抗凝血及免疫调节等功效。现有技术中虽有披露西红花提取物的应用，但并没有披露西红花提取物的功效，更没有披露本发明中含有西红花的复方提取物的功效和应用。例如，cn110812299a公开了一直含有西红花的爽肤水及其配制工艺。又如，cn106821932a公开了含有西红花提取液的化妆品，其中并未披露西红花提取液的功效。再如，cn110279640a公开了西红花提取物具有美白功效。在优选的实施方式中，本发明的中药组合物包含1-10重量份，优选1-2重量份的西红花提取物。人参提取物本发明的中药组合物包含人参提取物。人参，为五加科人参panaxginsengc.a.mey.的根。别称有黄参、玉精、血参、孩儿参等。性甘，微温。归肺、脾、心、肾经。具有大补元气，生津安神的效果。文献报道人参及其制剂主要成分为人参皂苷，在提高学习能力、易化记忆方面有显著的促进作用，同时还能够抑制金黄色葡萄球菌、提升自身免疫能力。不仅如此，人参还具有抗氧化、抗衰老、抗炎之效。现有技术中虽有披露人参根、人参花籽等提取物的应用，但并没有披露人参，尤其是鲜人参提取物的功效，更没有披露本发明中含有鲜人参的复方提取物的功效和应用。例如，cn110787075a一种含有人参根提取物和人参籽油的护肤油组合物，其中未公开人参根或人参籽油的功效。在优选的实施方式中，本发明的中药组合物包含15-40重量份，优选15-35重量份的人参提取物。荷花提取物本发明的中药组合物包含荷花提取物。荷花，为睡莲科莲nelumbonuciferagaertn.的花蕾。又名菡萏、芙蕖、芙蓉。性苦、甘，平。归肝、胃经。荷花能散瘀止血，祛湿消风。荷花中含有丰富的黄酮成分，是良好的抗氧化剂和抑菌剂，荷花黄酮类成分能够清楚超氧阴离子自由基及羟基自由基。现有技术中虽有披露荷花活性物的应用，但并没有披露莲花，尤其是莲花/荷花提取物的功效，更没有披露本发明中含有莲花/荷花的复方提取物的功效和应用。例如，cn105534815b公开了一种含有荷花活性成分的护肤组合物，其中并未公开荷花活性成分的具体功效。在优选的实施方式中，本发明的中药组合物包含15-35重量份，优选20-30重量份的荷花提取物。虎杖提取物本发明的中药组合物包含虎杖提取物。虎杖，为廖科虎杖polygonumcuspidatumsieb.etzucc.的根茎及根。又被称为斑杖、苦杖、酸杖等。性苦，微寒。归肝、胆、肺经。虎杖有活血祛瘀，清热解毒的功效。现代药理表明虎杖中含有白藜芦醇苷，能够有效地抑制由自由基发生系统引起的脂质过氧化，还具有抗菌抗病毒作用。现有技术中虽有披露虎杖提取物及应用，但并没有披露本发明中含有虎杖的复方提取物的功效和应用。例如，cn111870572a公开了虎杖提取物的抗氧化作用及其应用。在优选的实施方式中，本发明的中药组合物包含15-30重量份，优选15-25重量份的虎杖提取物。川芎提取物本发明的中药组合物包含川芎提取物。川芎，为伞形科川芎ligusticumchuanxionghort.的根茎。别称有芎、香果、胡、京芎等。性辛，温。归肝、胆、心包经。川芎主要有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛的作用。主要成分为川芎嗪，具有抗氧化、抗炎、促进血液微循环、提升免疫力的功效。同样，现有技术中被披露本发明中含有川芎的复方提取物的功效和应用。在优选的实施方式中，本发明的中药组合物包含10-25重量份，优选10-15重量份的川芎提取物。当归提取物本发明的中药组合物包含当归提取物。当归，为伞形科当归angelicasinensis(oliv.)diels的根。别名干归、马尾当归、云归等。性甘、辛、苦，温。归肝、心、脾经。具有活血补血之效。当归主要含挥发油、有机酸等，能够起到抗氧化、抗炎的作用。现有技术如cn102209526b虽有披露含有极细当归提取物的组合物，但并没有披露当归提取物，更没有披露本发明中含有当归的复方提取物的功效和应用。在优选的实施方式中，本发明的中药组合物包含10-25重量份，优选10-15重量份的当归提取物。中药组合物本申请首次将西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物和当归提取物进行组合，得到的复方中药组合物中各味药之间相辅相成，以达到美白功效。本发明的中药组合物适用于化妆品领域。本发明意外地发现，包含西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物和当归提取物的中药组合物具有下调slc3a2、rab27a和/或myo5a基因的作用。因此，本发明的中药组合物可以作为功效添加剂加入到化妆品中使用，以辅助改善皮肤问题(例如皮肤美白)。在本发明一个实施方式中，本发明的中药组合物中西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物和当归提取物的重量比为0.1-0.5:1-3:1-2:0.5-2:1-2:1-2。在优选的实施方式中，西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物和当归提取物的重量比为0.1:3:2:2:1:1。提取方法本发明的中药提取物通过溶剂超声提取法制备。例如，可以采用乙醇作为提取溶剂。在优选的实施方式中，可以采用70体积％的乙醇进行提取。在一个具体的实施方式中，提取过程可以分步进行。例如，第一步采用95体积％的乙醇进行超声提取，离心过滤，弃去滤液；第二步采用70体积％的乙醇进行超声提取，离心过滤，滤液浓缩，过滤后获得所需的提取物。进行提取步骤的时间最多为24小时，但还可更短。例如，提取过程可以进行30分钟至1小时。皮肤外用剂本发明还涉及一种皮肤外用剂，该皮肤外用剂包含西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物和当归提取物的中药组合物以及化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂。在一些优选的实施方式中，以所述皮肤外用剂的总重量计，西红花提取物、人参提取物、荷花提取物、虎杖提取物、川芎提取物和当归提取物的中药组合物的用量为0.001-20％(w/w)，优选为0.008-10％(w/w)，更优选为0.01-5％(w/w)，最优选为0.01-2％(w/w)。在本发明的一些实施方式中，皮肤外用剂包含0.01-10％(v/v)，优选为0.008-10％(v/v)，更优选为0.01-5％(v/v)，最优选为0.01-2％(v/v)的本发明中药组合物。在一个具体的实施方式中，皮肤外用剂包含0.125％(v/v)的本发明中药提取物。所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。这种皮肤外用剂可以配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以这种皮肤外用剂通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的c4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有c12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有c16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。具体实施方式下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。以下实施例中采用的药材来源和产地如下：西红花京皖饮片厂，产地西藏；鲜人参京皖饮片厂，产地吉林；荷花京皖饮片厂，产地湖南；虎杖京皖饮片厂，产地湖北；川芎京皖饮片厂，产地四川；当归京皖饮片厂，产地甘肃。实施例1：西红花提取物制备称取西红花10g，用10倍95％乙醇超声提取30min，离心过滤，弃去滤液。药渣用20倍70％乙醇超声40min，离心过滤，滤液于55℃条件下浓缩，4℃静置过夜。取出后，在3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤，最终配制成1g/ml的溶液，固含20.02％，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例2：鲜人参提取物制备称取鲜人参100g，打粗粉，用10倍95％乙醇超声提取30min，离心过滤，弃去滤液。药渣用8倍70％乙醇超声40min，离心过滤，滤液于55℃条件下浓缩，4℃静置过夜。取出后，在3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤，最终配制成1g/ml的溶液，固含2.43％，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例3：荷花提取物制备称取荷花100g，用10倍95％乙醇超声提取30min，离心过滤，弃去滤液。药渣用20倍70％乙醇超声40min，离心过滤，滤液于55℃条件下浓缩，4℃静置过夜。取出后，在3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤，最终配制成1g/ml的溶液，固含4.91％，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例4：虎杖提取物制备称取虎杖100g，用10倍95％乙醇超声提取30min，离心过滤，弃去滤液。药渣用20倍70％乙醇超声40min，离心过滤，滤液于55℃条件下浓缩，4℃静置过夜。取出后，在3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤，最终配制成1g/ml的溶液，固含6.77％，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例5：川芎提取物制备称取川芎100g，用10倍95％乙醇超声提取30min，离心过滤，弃去滤液。药渣用20倍70％乙醇超声40min，离心过滤，滤液于55℃条件下浓缩，4℃静置过夜。取出后，在3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤，最终配制成1g/ml的溶液，固含5.72％，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例6：当归提取物制备称取当归100g，用10倍95％乙醇超声提取30min，离心过滤，弃去滤液。药渣用20倍70％乙醇超声40min，离心过滤，滤液于55℃条件下浓缩，4℃静置过夜。取出后，在3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤，最终配制成1g/ml的溶液，固含33.35％，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例7：中药组合物的制备按质量比实施例1提取物：实施例2提取物：实施例3提取物：实施例4提取物：实施例5提取物：实施例6提取物(0.1:3:2:2:1:1)混合制备中药组合物，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例8：中药组合物的制备按质量比实施例1提取物：实施例2提取物：实施例3提取物：实施例5提取物：实施例6提取物(0.1:3:2:1:1)混合制备中药组合物，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例9：中药组合物的制备按质量比实施例1提取物：实施例3提取物：实施例5提取物：实施例6提取物(0.1:2:1:1)混合制备中药组合物，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例10：中药组合物的制备按质量比实施例1提取物：实施例2提取物：实施例3提取物：实施例4提取物：实施例5提取物：实施例6提取物(0.5:1:2:1:1:1)混合制备中药组合物，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例11：中药组合物的制备按质量比实施例1提取物：实施例2提取物：实施例3提取物：实施例4提取物：实施例5提取物：实施例6提取物(0.2:1:1:0.5:1:1)混合制备中药组合物，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例12：中药组合物的制备按质量比实施例1提取物：实施例2提取物：实施例3提取物：实施例4提取物：实施例5提取物：实施例6提取物(0.1:2:1:0.5:1:1)混合制备中药组合物，最终配制成固含1％溶液，备用。实施例13：中药组合物的酪氨酸酶活性抑制评价在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在ph6.8的磷酸缓冲液中，可催化多巴转化成多巴醌(呈肾上腺素红色)，在分光光度计475nm处可测定光密度值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值。根据光密度值的变化，评估原料对酪氨酸酶的抑制作用，抑制率越大表示美白效果越好。取14.33g的12水合磷酸氢二钠(国药试剂，分析纯)溶于200ml水中，用玻璃棒搅拌均匀，配制成0.2mol/l的溶液a，备用；取2.1g的一水合柠檬酸(国药试剂，分析纯)溶于100ml水中，用玻璃棒搅拌均匀，配制成0.1mol/l的溶液b，备用；取154.5ml溶液a，加入45.5ml溶液b，配制成ph6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(以下简称缓冲液)200ml。取酪氨酸酶(活力≥1000unit/mg，sigma公司)，用缓冲液配制成100u/ml，临用配制。取左旋多巴(纯度≥98％，sigma公司)，用缓冲液配制成1mg/ml，避光保存。将曲酸(纯度≥98.5％，sigma公司)作为阳性对照，用缓冲液稀释成8μg/ml浓度溶液，备用。取制备好的实施例1-12提取物，以缓冲液配制成12.5μg/ml、62.5μg/ml、312.5μg/ml各1ml，按下表方法进行试验，加入酪氨酸酶溶液后，充分混匀，置37℃水浴槽中孵育10min，依次在各管中加入左旋多巴溶液，控制每管反应时间为5min，即刻将各管反应溶液移入比色皿中，于475nm处测吸光值。表1单位/mltt0cc0样品11－－缓冲液－0.511.5酪氨酸酶0.5－0.5－左旋多巴2222其中t为样品，t0为样品对照，c为空白，c0为空白对照。表2由酪氨酸酶活性抑制实验结果可知，实施例7、10提取物的美白能力优于实施例1-6提取物，实施例9提取物在低浓度下美白能力与实施例6提取物效果相当，实施例11、12提取物在高浓度下美白能力与实施例6提取物接近。其中实施例10提取物的美白能力最强，认为复合提取物比例最佳，其次为实施例7提取物。实施例9提取物中去除2味中药，实施例8提取物中去除了1味中药，但实施例9提取物的美白能力优于实施例8提取物，推测是由于实施例2提取物即鲜人参提取物并无显著美白活性，同时在实施例8提取物中比例较大所致。当6味药物进行复配时，具有协同增效作用。实施例14：中药组合物的黑色素细胞基因检测评价1实验方法：1.1细胞毒性检测(1)细胞接种：按1×104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃，5％co2)中孵育过夜。本次测试所用细胞为人黑色素细胞(批号：mc200301)，由广东博溪生物科技有限公司生产。细胞培养液是medium-254，生产商是gibco公司。(2)实验分组：实验设置空白对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。(3)配液：按测试浓度设定表(表3)配制不同浓度的受试物工作液。表3(4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。空白对照组每孔加入200μl细胞培养液；阳性对照组每孔加入200μl含10％二甲亚砜(sigma)的培养液；样品组每孔加入200μl含有相应浓度受试物的培养液；调零孔无细胞接种，仅加入200μl细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃，5％co2)中培养。(5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入mtt工作液(0.5mg/ml，现配现用，sigma公司，货号为m5655-1g，批号为mkbx6716v)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加入150μl二甲亚砜。采用酶标仪(biotek，epoch)，在490nm处测吸光值。(6)计算公式：1.2基因检测(1)细胞接种：按1×105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃，5％co2)中孵育过夜。本次测试所用细胞为人黑色素细胞(批号：mc200301)，由广东博溪生物科技有限公司生产。细胞培养液是medium-254，生产商是gibco公司。(2)实验分组：实验设置空白对照组(bc)和样品组。(3)配液：按测试浓度设定表(表4)配制不同浓度的受试物工作液。表4*荧光定量pcr仪(biorad，cfx96)，普通pcr仪(博日，tc-xp-g)(4)给药：根据表4实验设计，待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药，进行分组给药，每孔加样2ml，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃，5％co2)中培养。(5)收集细胞：培养24h后，弃掉上清，1ml/孔磷酸缓冲盐溶液(博士德)清洗两次，每孔加入1mlrnaisoplus9(takara)，吹打裂解细胞后，收样。(6)基因表达检测：提rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2-△△ct方法进行结果计算。2实验结果：2.1细胞毒性检测结果2.2基因检测结果根据具体实验方法，进行基因检测，检测结果如表7所示。表7备注：采用2-△△ct方法进行结果计算，用t-检验方法进行统计分析时，将bc组mrna扩增倍数归一处理，样品组与bc组相比，显著性以*表示，p-值＜0.05表示为*，p-值＜0.01表示为**。由基因检测结果可知，实施例7提取物除了对slc3a2基因的下调之外，还能对rab27a、myova基因的表达也同时又显著下调作用，可以减少黑色素在表皮的沉积。而烟酰胺仅表现在对slc3a2基因的下调。实施例7和实施例9-12的提取物用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述复合提取物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)。优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)。更优选的重量百分比为0.001％-5％(w/w)。最优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。以下是中药组合物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。实施例15：面霜的制备实施例16：乳液的制备实施例17：啫喱的制备实施例18：化妆水的制备实施例19：精华液的制备实施例20：面膜的制备实施例21：眼霜的制备实施例22：气雾(清洁泡)的制备实施例23：喷雾的制备实施例24：沐浴露的制备实施例25：洗面奶的制备当前第1页12