一种植物组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及植物提取研究领域，具体涉及一种植物组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.中药双向发酵是在继承中药炮制学中发酵法的基础上，吸取微生态学研究成果，结合现代微生物工程而形成的高科技中药制药新技术。所谓“双向发酵”是指采用具有一定活性成分的中药材或药渣作为药性基质来代替传统的营养基质，并把经过优选的菌种加入其中进行微生物转化，它们构成的发酵组合物称作药用菌质。其双向性体现在药性基质在提供真菌所需营养的同时，还受到真菌中酶的影响而改变自身的组织、成分，产生新的性味功能。因此，采用微生物发酵中药，即环保，提取效率高，功效良好，可应用于食品、药品等多个行业，但在化妆品中应用较少，可拓展化妆品原料领域新成分、新功效提供途径，应用前景十分广阔。
3.专利（cn107898931a）公开了一种时钟基因表达量的调整剂及其制备方法，所述的调整剂为石斛提取物。首创性地发现石斛提取物能够促进clock基因的表达。但有研究（孙洋. bmal1/clock在uvb照射下对角质细胞凋亡、dna损伤和免疫的调控作用[d].天津大学,2018.）表明，
①
在没有uv照射的正常培养条件下，小rna介导的clock基因沉默能够促进角质形成细胞增殖，并引起原代角质细胞分化；
②
clock基因沉默能够阻碍uvb引起的原代角质细胞和hacat细胞的凋亡；
③
在角质形成细胞中，沉默clock能有效抑制uvb引起的细胞因子的高表达；
④
在原代角质形成细胞中，clock基因沉默对uvb导致的p53蛋白总量和磷酸化的升高有强烈的抑制作用。综上表明，促进clock将会对肌肤产生不良反应，而抑制clock基因表达，可以有效降低角质形成细胞凋亡和抵御uvb对机体产生的不良反应。
[0004]
针对上述单一石斛提取物促进clock基因的表达及其对肌肤产生的不良反应，开发一种活性成分含量高，能够抑制非酶糖基化反应、抑制clock基因表达、抑制酪氨酸酶活性，具有抗衰老、美白的功效植物组合物是十分有必要的。


技术实现要素：

[0005]
基于上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种植物组合物，该植物组合物活性物含量高，能够抑制非酶糖基化反应、抑制clock基因表达、抑制酪氨酸酶活性，具有抗衰老、美白的功效。
[0006]
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：本发明第一方面提供一种植物组合物，所述植物组合物包括以下组分：铁皮石斛、黄精、晚香玉和灵芝。
[0007]
根据本发明，所述植物组合物通过双向发酵工艺制备得到。
[0008]
根据本发明，以双向发酵培养基重量计，所述植物组合物中铁皮石斛添加量为1
‑
10%。
[0009]
根据本发明，以双向发酵培养基重量计，所述植物组合物中黄精添加量0.01
‑
1%。
[0010]
根据本发明，以双向发酵培养基重量计，所述植物组合物中晚香玉添加量为0.01
‑
1%。
[0011]
根据本发明，所述植物组合物中多糖含量为5.11
‑
5.98mg/ml，黄酮含量为0.11
‑
0.23mg/ml。
[0012]
根据本发明一些具体实施方式，所述植物组合物中多糖含量为5.23
‑
5.98mg/ml，黄酮含量为0.13
‑
0.23mg/ml。
[0013]
根据本发明，所述植物组合物通过包括以下制备方法制备：
①
原料预处理：铁皮石斛、黄精、晚香玉分别粉碎、过筛；
②
活化灵芝菌：灵芝菌培养基制备，接种灵芝菌，培养得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备；
④
接种和发酵：接种灵芝种子液接种至双向发酵培养基中培养；
⑤
发酵液后处理：灭菌、过滤。
[0014]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中活化灵芝菌培养基为淀粉0.5
‑
5%，酵母粉0.1
‑
5%，氯化钠0.1
‑
2%，碳酸钙0.01
‑
0.1%，加水至100%。
[0015]
根据本发明，所述灵芝菌培养温度为25
‑
35℃。
[0016]
根据本发明，所述灵芝菌培养转速为50
‑
300rpm。
[0017]
根据本发明，所述灵芝菌培养时间为50
‑
80h。
[0018]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基为淀粉0.5
‑
5%，酵母粉0.1
‑
5%，氯化钠0.1
‑
2%，碳酸钙0.01
‑
0.1%，铁皮石斛1
‑
10%，黄精0.01
‑
1%，晚香玉0.01
‑
1%，加水至100%。
[0019]
根据本发明一些具体实施方式，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基为淀粉0.5
‑
5%，酵母粉0.1
‑
5%，氯化钠0.1
‑
2%，碳酸钙0.01
‑
0.1%，铁皮石斛1
‑
2%，黄精0.01
‑
0.2%，晚香玉0.01
‑
0.2%，加水至100%。
[0020]
根据本发明，所述步骤
③
中双向发酵培养温度为25
‑
35℃。
[0021]
根据本发明，所述步骤
③
中双向发酵培养转速为50
‑
300rpm。
[0022]
根据本发明，所述步骤
③
中双向发酵培养时间为1
‑
7d。
[0023]
根据本发明，所述步骤
③
中双向发酵培养ph值为3.5
‑
7.5。
[0024]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养温度为30℃。
[0025]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养转速为150rpm。
[0026]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养时间为3d。
[0027]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养ph值为5.5。
[0028]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
④
中灵芝种子液接种量为1
‑
15%。
[0029]
根据本发明一些具体实施方式，所述植物组合制备方法中步骤
④
中灵芝种子液接种量为10%。
[0030]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中灭菌方式为本领域常规灭菌方式。
[0031]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中灭菌方式为高温灭菌。
[0032]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中高温灭菌条件为灭菌温度为115
‑
121℃。
[0033]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中高温灭菌条件为灭菌时间为10
‑
60min。
[0034]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基制备还包括分装、灭菌。
[0035]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为50
‑
100ml。
[0036]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基灭菌方式为本领域常规灭菌方式。
[0037]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基灭菌方式高温灭菌。
[0038]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基高温灭菌温度为115
‑
121℃。
[0039]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基高温灭菌时间为10
‑
60min。
[0040]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基制备还包括分装、灭菌。
[0041]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶装液量为50
‑
200ml。
[0042]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基灭菌方式为本领域常规灭菌方式。
[0043]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基灭菌方式高温灭菌。
[0044]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基高温灭菌温度为115
‑
121℃。
[0045]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基高温灭菌时间为10
‑
60min。
[0046]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理还包括灭菌后添加辅料。
[0047]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料包括甘油、戊二醇和己二醇。
[0048]
根据本发明，以双向发酵液重量计，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料包括添加10
‑
50%甘油、0.1
‑
5%戊二醇和0.1
‑
5%己二醇。
[0049]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理还包括添加辅料后灭菌。
[0050]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料后灭菌温度为70
‑
100℃。
[0051]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料后灭菌时间20
‑
60min。
[0052]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
①
原料预处理中铁皮石斛碎过80
‑
120
目筛，取80目筛下及120目筛上部分备用。
[0053]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
①
原料预处理中黄精粉碎过10
‑
25目筛，取10目筛下及25目筛上部分备用。
[0054]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
①
原料预处理中晚香玉粉碎过10
‑
25目筛，取10目筛下及25目筛上部分备用。
[0055]
本发明第二方面提供本发明第一方面所述植物组合物的制备方法。
[0056]
根据本发明，所述制备方法包括以下步骤：
①
原料预处理：铁皮石斛、黄精、晚香玉分别粉碎、过筛；
②
活化灵芝菌：将淀粉0.5
‑
5%，酵母粉0.1
‑
5%，氯化钠0.1
‑
2%，碳酸钙0.01
‑
0.1%，加水至100%，混合、分装、灭菌，制备灵芝菌培养基；挑取灵芝菌菌丝体，接种至培养基，于25
‑
35℃，50
‑
300rpm条件下培养50
‑
80h，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：将淀粉0.5
‑
5%，酵母粉0.1
‑
5%；氯化钠0.1
‑ꢀ
2%，碳酸钙0.01
‑
0.1%，铁皮石斛1
‑
10%，黄精0.01
‑
1%，晚香玉0.01
‑
1%，加水至100%，混合、分装、灭菌，制备双向发酵培养基；
④
接种和发酵：按照1
‑
15%接种量，将步骤
②
灵芝种子液接种至发酵培养基中，然后于25
‑
35℃，50
‑
300rpm条件下培养1
‑
7d；
⑤
发酵液后处理：灭菌、过滤。
[0057]
根据本发明一些具体实施方式，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基为淀粉0.5
‑
5%，酵母粉0.1
‑
5%，氯化钠0.1
‑
2%，碳酸钙0.01
‑
0.1%，铁皮石斛1
‑
2%，黄精0.01
‑
0.2%，晚香玉0.01
‑
0.2%，加水至100%。
[0058]
根据本发明，所述步骤
③
中双向发酵培养ph值为3.5
‑
7.5。
[0059]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养ph值为5.5。
[0060]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养温度为30℃。
[0061]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养转速为150rpm。
[0062]
根据本发明一些具体实施方式，所述步骤
③
中双向发酵培养时间为3d。
[0063]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
④
中灵芝种子液接种量为1
‑
15%。
[0064]
根据本发明一些具体实施方式，所述植物组合制备方法中步骤
④
中灵芝种子液接种量为10%。
[0065]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中灭菌方式为本领域常规灭菌方式。
[0066]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中灭菌方式为高温灭菌。
[0067]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中高温灭菌条件为灭菌温度为115
‑
121℃。
[0068]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中高温灭菌条件为灭菌时间为10
‑
60min。
[0069]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为50
‑
100ml。
[0070]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基灭菌方式为本领域常规灭菌方式。
[0071]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基灭菌方式高温灭菌。
[0072]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基高温灭菌温度为115
‑
121℃。
[0073]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
②
中灵芝菌培养基高温灭菌时间为10
‑
60min。
[0074]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶装液量为50
‑
200ml。
[0075]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基灭菌方式为本领域常规灭菌方式。
[0076]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基灭菌方式高温灭菌。
[0077]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基高温灭菌温度为115
‑
121℃。
[0078]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
③
中双向发酵培养基高温灭菌时间为10
‑
60min。
[0079]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理还包括灭菌后添加辅料。
[0080]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料包括甘油、戊二醇和己二醇。
[0081]
根据本发明，以双向发酵液重量计，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料包括添加10
‑
50%甘油、0.1
‑
5%戊二醇和0.1
‑
5%己二醇。
[0082]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理还包括添加辅料后灭菌。
[0083]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料后灭菌温度为70
‑
100℃。
[0084]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
⑤
中发酵液后处理添加辅料后灭菌时间20
‑
60min。
[0085]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
①
原料预处理中铁皮石斛碎过80
‑
120目筛，取80目筛下及120目筛上部分备用。
[0086]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
①
原料预处理中黄精粉碎过10
‑
25目筛，取10目筛下及25目筛上部分备用。
[0087]
根据本发明，所述植物组合制备方法中步骤
①
原料预处理中晚香玉粉碎过10
‑
25目筛，取10目筛下及25目筛上部分备用。
[0088]
本发明第三方面提供本发明第一方面所述植物组合物或本发明第二方面所述植物组合物的制备方法制备的植物组合物在化妆品和/或化妆品中的应用。
[0089]
根据本发明，所述植物组合物在制备具有抗衰老和/或美白功效护肤品和/或化妆品中的应用。
[0090]
根据本发明，所述化妆品种类、剂型没有特殊限制，例如面膜、膏霜、洗面奶、精华
液或乳液等。
[0091]
本发明有益效果:1. 本发明植物组合物通过双向发酵工艺制备，采用药食同源的真菌灵芝对铁皮石斛、黄精、晚香玉进行低温发酵，利用真菌具有分解纤维素等物质的强大酶系，以真菌对铁皮石斛、黄精、晚香玉进行深层发酵分解为小分子碳源，增加了植物原料活性成分的利用率，提高植物组合物活性成分多糖含量。
[0092]
2. 本发明植物组合物通过抑制非酶糖基化反应和抑制clock基因表达来达到良好的抗衰老作用，通过抑制酪氨酸酶活性来达到良好的美白功效，将其添加到化妆品和/或护肤品中可以达到抗衰老和美白的双重效果。
附图说明
[0093]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将所需要使用的附图作简单地介绍。
[0094]
图1是clock表达基因结果图。
具体实施方式
[0095]
下面结合具体实例对本发明进行进一步阐述，但本发明并不局限于此。
[0096]
下面实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的实验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0097]
本发明主要原料名称、供应商/生产商、产地如表1所示：表1 原料及来源原料名称供应商/生产商产地铁皮石斛中科院昆明植物研究所云南黄精北京仟草中药饮品有限公司河北晚香玉云南瑞朵花卉有限公司云南灵芝菌中国工业微生物菌种保藏管理中心中国已二醇德之馨(上海)有限公司德国戊二醇德之馨(上海)有限公司德国实施例1
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：按照表2中各原料配比，加入淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0098]
表2中药原料添加量优化样品编号铁皮石斛（%）黄精（%）晚香玉（%）样品110.10.05样品210.20.1样品310.40.2样品420.10.1样品520.20.2样品620.40.05样品740.10.2样品840.20.05样品940.40.1实施例2
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照表3接种量（2%、5%、10%、15%）接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0099]
表3发酵接种量优化样品编号接种量（%）样品102样品115样品1210样品1315实施例3
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制
备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养1d、3d、5d、7d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0100]
表4发酵时间优化样品编号发酵时间（d）样品141样品153样品165样品177实施例4
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度28℃、30℃、35℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0101]
表5发酵温度优化样品编号发酵温度（℃）样品1828样品1930样品2035实施例5
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，使用柠檬酸调节ph至3.5，使用氢氧化钠调节ph至7.5，培养基自然状态下ph为5.5。分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0102]
表6发酵初始ph优化样品编号发酵ph值样品213.5样品225.5样品237.5实施例6
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液121℃灭菌20min，冷却至常温，精滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭菌40min，冷却后即得实施例6。
[0103]
实施例7
①
原料预处理：铁皮石斛粉碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，
121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
中药双向发酵培养基制备：铁皮石斛1%，黄精0.01%，晚香玉0.01%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备中药双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述中药双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液121℃灭菌20min，冷却至常温，精滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭菌40min，冷却后即得实施例7。
[0104]
实施例8
①
原料预处理：铁皮石斛粉碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
中药双向发酵培养基制备：铁皮石斛10%，黄精1%，晚香玉1%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备中药双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述中药双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液121℃灭菌20min，冷却至常温，精滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭菌40min，冷却后即得实施例8。
[0105]
实施例9
①
原料预处理：铁皮石斛粉碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
中药双向发酵培养基制备：铁皮石斛10%，黄精1%，晚香玉0.01%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备中药双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述中药双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液121℃灭菌20min，冷却至常温，精滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭菌40min，冷却后即得实施例9。
[0106]
对比例1铁皮石斛2%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，加水至100%，80℃提取2h，过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0107]
对比例2
①
原料预处理：黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0108]
对比例3
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛0.5%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，检测滤液中多糖和黄酮含量。
[0109]
对比例4
①
原料预处理：黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，
121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭菌40min，冷却后即得对比例4。
[0110]
对比例5
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精、晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛0.5%，黄精0.2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭40min，冷却后即得对比例5。
[0111]
对比例6
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭40min，冷却后即得对比例6。
[0112]
对比例7
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，黄精粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，黄精0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭40min，冷却后即得对比例7。
[0113]
对比例8
①
原料预处理：铁皮石斛碎、过80目筛，晚香玉分别粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：铁皮石斛2%，晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭40min，冷却后即得对比例8。
[0114]
对比例9
①
原料预处理：黄精粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：黄精0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭40min，冷却后即得对比例9。
[0115]
对比例10
①
原料预处理：晚香玉粉碎、过10目筛；
②
活化灵芝菌：淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，纯加水至100%，制备灵芝菌培养基，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml。将培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；挑取灵芝斜面中的菌丝，接种至灵芝菌培养基中；接种后的培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，得灵芝种子液；
③
双向发酵培养基制备：晚香玉0.2%，淀粉2%，酵母粉1.5%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.02%，加水至100%，制备双向发酵培养基，初始ph5.5，分装于250ml锥形瓶中，每瓶装液量100ml，每种培养基各3瓶。将上述双向发酵培养基分别放置灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌结束后，放置超净台中冷却备用；
④
接种和发酵：按照10%接种量接种灵芝种子液，然后将培养基放置恒温摇床中培养，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养3d，每组样品各3瓶；
⑤
发酵液后处理：发酵结束，发酵液进行灭菌，121℃灭菌20min。灭菌后，发酵液进行过滤，加入30%甘油，1%己二醇，2%戊二醇，95℃灭40min，冷却后即得对比例10。
[0116]
1. 活性物质含量检测
①
总黄酮检测方法采用nano2‑
al(no3)3比色法测试样品中的黄酮含量，参考《gb/t 20574
‑
2006蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法》。
[0117]
②
多糖检测方法采用95%乙醇醇沉，沉淀物溶解后采用苯酚
‑
硫酸法检测多糖含量，参考《qb/t 2488
‑
2006化妆品用芦荟汁、粉》。
[0118]
2. 非酶糖基化试验皮肤老化的一个主要特征就是皮肤变黄和出现老年色斑，其主要原因是脂质过氧化和非酶糖基化反应。生物体内非酶糖基化反应，是指在无酶催化条件下，还原性糖的醛基或酮基与蛋白质等大分子的氨基发生美拉德（maillard）反应，生成黄褐色糖基化终产物（ages）。
[0119]
通过抑制蛋白非酶糖基化，可以反映物质对黄褐色素沉积的抑制作用。具体测试方法如下：将0.5mol/l牛血清白蛋白溶液（bca）与20mg/ml果糖溶液等体积混合得到bca
‑
果糖反应液。按表7顺序依次加入各种试剂，加完后涡旋混匀。37℃避光孵育5天，之后测试荧
光强度，激发波长370nm，发射波长为440nm。根据荧光强度（rfu，relative fluorescence unit），计算待测样品对于非酶糖基化反应的抑制程度，见公式（1）。
[0120]
表7非酶糖基化试验实验分组及添加量组别待测样品（μl）pbs缓冲液（μl）bca
‑
果糖反应（μl）待测组/阳性对照+
‑
+阴性对照
‑
++空白组++
‑
3. 抑制酪氨酸酶试验皮肤色素的形成是由于表皮中黑色素的积累造成的，黑色素合成过量，会造成皮肤色素沉积，形成色斑，导致肌肤黯沉。一般情况下，酪氨酸酶活性越高，黑色素合成越多。通过抑制酪氨酸酶活性，可控制黑色素的合成速率。通过酪氨酸酶活性抑制率，评估物质应用于化妆品中的美白功效，实验反应体系如表8所示。加样结束后，在25℃下孵育30min，在475nm处测定吸光值。
[0121]
表8酪氨酸酶反应体系试管编号pbs缓冲液（μl）l
‑
酪氨酸（μl）样品/阳性对照（μl）酪氨酸酶（μl）a++
‑
+b++
‑‑
c+++
‑
d+++
‑
酪氨酸酶抑制率，计算公式见（2）：式（2）中：a、b、c、d分别为阴性组吸光值、阴性对照组空白吸光值、样品组/阳性组吸光值、样品组/阳性组空白吸光值。
[0122]
4. 时钟基因clock表达试验在自然界中，从单细胞到高等动植物以及人类的所有生命活动均存在着按照一定规律运行的、周期性的生命活动现象，称为生物节律。目前认为，在自然界生物体中广泛存在着一个时间控制机构系统，称之为生物钟系统，由此控制和调节各种节律性活动，维持生物体内环境的周期性振荡。生物钟的分子元件由一系列核心钟组分构成，包括clock、bmal1、per、cry、tim等基因及其相关蛋白产物。报道称，uvb引起的dna损伤修复反应也呈现依赖时钟的节律变化。除此之外，昼夜节律钟还参加调控多方面的皮肤稳态，比如：毛发生长，细胞增殖，干细胞功能，癌症发生，衰老，免疫等。
[0123]
时钟基因clock表达实验，具体操作如下：
①
基于细胞毒性检测本次检测样品设置8个浓度，每个浓度设置3个重复孔，同时，试验设置阴性对照（培养基）、调零孔（去离子水）和阳性对照（含5% dmso（二甲基亚砜）培养基）。本试验采用mtt活性检测方法，筛选细胞给药的最大安全浓度。具体操作步骤如下：
a. 细胞接种：按1
×
104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱（37℃、5% co2、95% 相对湿度（rh））中孵育过夜。
[0124]
b. 配液：按表9中浓度设置，配制不同浓度的受试物。
[0125]
表9受试浓度设定样品名称样品浓度（v/v）双向发酵液0.08%、0.16%、0.31%、0.63%、1.25%、2.5%、5%、10%c. 给药：待96孔板中细胞铺板率达到40
‑
60%时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μl培养液；阳性对照组每孔加入200μl含10% dmso的培养液；样品组每孔加入200μl含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μl细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱（37℃、5% co2、95% rh）中培养。
[0126]
d. 检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入mtt工作液（0.5mg/ml），37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150
µ
l dmso，在490nm处读取od值。
[0127]
e. 相对细胞活率：根据计算公式：
②
形态学检测a. 细胞接种：设立样品组与溶剂对照组，每组设两个复孔。按相应的接种密度接种细胞至24孔板中，培养箱（37℃、5% co2、95% rh）中孵育过夜。
[0128]
b. 配液：根据mtt检测结果，确定检测样品的形态学观察浓度，配制不同浓度的受试物工作液。
[0129]
c. 给药：待24孔板细胞铺板率达到40%时，进行给药，样品组加入不同浓度的受试物，溶剂对照组加入细胞培养液，培养箱（37℃、5% co2、95% rh）中孵育24h。
[0130]
d. 细胞观察：孵育结束后，显微镜下观察细胞形态并拍照。
[0131]
③
基因检测a. 细胞接种：按2.5
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱（37℃、5% co2、95% rh）中孵育过夜。
[0132]
b. 给药：根据表10实验分组，待6孔板中细胞铺板率达到40
‑
60%时，进行分组给药，每孔加样2ml，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱（37℃、5% co2、95% rh）中培养24h。
[0133]
c. 收集细胞：培养24h后，弃掉细胞上清，1ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。
[0134]
d. 基因表达检测：提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2
‑△△
ct
方法进行结果计算e. 结果分析：应用graphpad prism program软件作图，各组间采用t
‑
test统计分析。
[0135]
表10试验分组
5. 试验结果分析5.1活性成分含量表11样品中活性成分对比样品编号多糖含量（mg/ml）黄酮含量（mg/ml）样品15.110.15样品25.450.16样品35.230.13样品45.830.18样品55.980.21样品65.790.15样品75.380.12样品85.550.15样品95.210.11样品105.170.12样品115.320.16样品125.890.19样品135.780.18样品145.680.14样品155.850.18样品165.740.21样品175.330.23样品185.680.14样品195.820.15样品205.740.17样品215.320.15样品225.790.14样品235.130.11对比例13.110.11对比例22.640.17对比例32.730.13以多糖含量和黄酮含量为研究目标，采用双向发酵工艺制备，考察发酵原料、发酵接种量（%）、发酵时间（d）、发酵温度（℃）、发酵ph值对植物组合物中多糖含量和黄酮含量的
影响，优化较优的制备工艺为：以双向发酵培养基重量计，铁皮石斛1
‑
10%，黄精0.01
‑
1%，晚香玉0.01
‑
1%；发酵接种量1
‑
15%；发酵时间1
‑
7d、发酵温度25
‑
35℃、发酵ph3.5
‑
7.5，此时植物组合物中多糖含量为5.11
‑
5.98mg/ml，黄酮含量为0.11
‑
0.23mg/ml。
[0136]
本发明植物组合物通过双向发酵工艺制备，将铁皮石斛、黄精和晚香玉以特定比例组合后采用药食同源的真菌灵芝进行双向发酵，利用真菌具有分解纤维素等物质的强大酶系，以真菌对铁皮石斛、黄精、晚香玉进行深层发酵分解为小分子碳源，增加了植物原料活性成分的利用率，提高植物组合物活性成分多糖。
[0137]
5.2 非酶糖基化试验表12样品的非酶糖基化抑制率样品编号非酶糖基化抑制率（%）2.5%实施例6732.5%实施例7672.5%实施例8752.5%实施例9742.5%对比例4362.5%对比例5322.5%对比例6242.5%对比例7312.5%对比例8222.5%对比例9242.5%对比例10210.5%vc乙基醚58非酶糖基化试验结果如表12所示，相同添加量下（2.5%），本发明实施例6
‑
9制备的植物组合物对非酶糖基化抑制率均高于对比例4
‑
10得到的植物组合物以及0.5%vc乙基醚（阳性对照），说明本发明植物组合物比任何灵芝菌双向发酵单一原料得到的发酵产物以及灵芝菌双向发酵任意其中两种组合原料得到的发酵产物能更好的抑制非酶糖基化反应。通过上述试验结果可以证实，铁皮石斛、黄精、晚香玉按特定比例经灵芝菌双向发酵后具有显著的协同增效作用，相比于对比例中提供的组合或用量范围，本技术的组合与比例经灵芝双向发酵工艺处理后能够显著增加对非酶糖基化反应的抑制作用。
[0138]
5.3酪氨酸酶试验表13样品的酪氨酸酶抑制率样品编号酪氨酸酶抑制率（%）15%实施例66315%实施例75915%实施例86415%实施例96515%对比例42315%对比例51915%对比例611
15%对比例71815%对比例81415%对比例91315%对比例10120.075%α
‑
熊果苷87酪氨酸酶试验结果如表13所示，相同添加量下（15%），与对比例4
‑
10相比，本发明实施例6
‑
9制备的植物组合物具有良好的抑制酪氨酸酶活性的作用，而其对酪氨酸酶活性的抑制率效果低于α
‑
熊果苷（阳性对照）。这说明本发明植物组合物比任何灵芝菌双向发酵单一原料得到的发酵产物以及灵芝菌双向发酵任意其中两种组合原料得到的发酵产物能更好的抑制酪氨酸酶活性，具有更好的美白效果。通过上述试验结果可以证实，铁皮石斛、黄精、晚香玉按特定比例经灵芝菌双向发酵后具有显著的协同增效作用，相比于对比例中提供的组合或用量范围，本技术的组合与比例经灵芝双向发酵工艺处理后能够显著增加对酪氨酸酶活性的抑制作用。
[0139]
5.4时钟基因clock基因表达试验表14 clock基因结果汇总表样品名称平均值（mean）标准差（sd）差异显著性（p
‑
value）空白对照1.000.07/0.025%实施例60.880.020.043*0.05%实施例60.840.030.023*0.075%实施例60.770.040.007**0.025%对比例61.040.040.032*0.05%对比例61.110.050.028*0.075%对比例61.170.030.025*clock基因表达试验结果如表14和图1所示，与空白对照相比，在添加量0.025%
‑
0.075%范围内，实施例6具有良好的抑制clock基因表达的功效，且效果显著优于对比例6，这说明本发明植物组合物比灵芝菌双向发酵铁皮石斛得到的发酵产物具有更好的抑制clock基因表达的功效。通过上述试验结果可以证实，铁皮石斛、黄精、晚香玉按特定比例经灵芝菌双向发酵后具有显著的协同增效作用，相比于对比例6中提供的灵芝菌双向发酵铁皮石斛的发酵产物，本技术的组合与比例经灵芝双向发酵工艺处理后能够显著增加对clock基因表达的抑制作用。
[0140]
本发明将铁皮石斛、黄精和晚香玉以特定比例组合后通过灵芝菌接种双向发酵获得具有抑制非酶糖基化反应和抑制clock基因表达的发酵产物，该发酵产物还能够抑制酪氨酸酶活性，具有抗衰老和美白的双重效果。