博赛泼维在治疗或改善新型冠状病毒肺炎中的应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种丙肝药物博赛泼维boceprevir和瑞德西韦在制备用于治疗或改善新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎“covid-19”是由新型冠状病毒sars-cov-2引起的急性传染病。目前，针对该病毒还没有有效的药物以及疫苗。因此，寻找到对新型冠状病毒有抑制效果的已上市药物具有重要意义。

新型冠状病毒基因在宿主细胞内将产生2个重叠的转录翻译产物,多聚蛋白1a与1ab。多聚蛋白经过主蛋白酶和木瓜样蛋白酶的水解后才能产生一系列具有生物功能的蛋白单体，从而完成病毒的复制和包装。以蛋白酶为靶点的抗病毒药物在hiv和hcv药物开发中取得巨大的成功，如利托那韦、达芦那韦、特拉匹韦等。因此新型冠状病毒的主蛋白酶是个理想的药物开发靶点。

博赛泼维(boceprevir)是由美国先灵葆雅(schering-plough)公司研发(该公司于2009年11月与默克药厂合并)的一种药物。2011年5月13日美国食品药品管理局(fda)批准该药上市，用于某些成人患者慢性丙型肝炎的治疗。该药为口服制剂，商品名为victrelis。该药由于体内半衰期短，口服剂量为800mg，每日3次，结构式如下：

瑞德西韦是一种吉利德公司开发的针对埃博拉病毒的核苷类似物，2020年10月22日，美国食品药品管理局(fda)批准了吉利德科学的抗病毒药物瑞德西韦用于治疗新冠住院患者，成为美国首个正式获批的新冠治疗药物。但是世卫组织表示，瑞德西韦对改善新冠肺炎住院患者病亡率影响不大，其在单独施用时抗病毒活性不够好。

技术实现要素：

本发明首次公开了博赛泼维和瑞德西韦联用可用于高效抑制(甚至完全抑制)新型冠状病毒或治疗新型冠状病毒肺炎。具体地，本发明提供了以下技术方案：

1.博赛泼维和瑞德西韦在制备用于抑制新型冠状病毒sars-cov-2的药物或试剂盒中的用途。

2.根据项目1所述的用途，其中，所述博赛泼维的浓度为8μm-100μm。

3.根据项目1所述的用途，其中，所述瑞德西韦的浓度为1μm-100μm，优选为1μm-20μm。

4.根据项目1所述的用途，其中，当所述博赛泼维和瑞德西韦存在于试剂盒中时，所述博赛泼维与瑞德西韦同时、依次或分别施用。

5.一种药物组合物(优选用于抑制新型冠状病毒sars-cov-2或治疗新型冠状病毒肺炎)，其包含化合物博赛泼维和瑞德西韦，以及任选地药学上可接受的载体。

6.根据项目5所述的药物组合物，其中所述博赛泼维的浓度为8μm-100μm。

7.根据项目5所述的药物组合物，其中所述瑞德西韦的浓度为1μm-100μm，优选为1μm-20μm。

8.一种制品(优选用于抑制新型冠状病毒sars-cov-2或治疗新型冠状病毒肺炎)，其包含化合物博赛泼维和瑞德西韦，以及任选地容器和使用说明书，所述使用说明书描述所述博赛泼维与瑞德西韦同时、依次或分别施用。

本发明相对于现有技术具有以下优点和效果：

博赛泼维和瑞德西韦之间具有协同作用，博赛泼维的靶点时新冠病毒的蛋白酶，瑞德西韦的靶点是新冠病毒的rna聚合酶，2种药物作用的是病毒不同的复制阶段。将博赛泼维和瑞德西韦进行联用之后对于新型冠状病毒的抑制效果远高于二者分别的技术效果之和，可实现完全抑制新型冠状病毒的增殖，并且通过小剂量的博赛泼维和瑞德西韦即可实现完全抑制新型冠状病毒的效果，从而降低了大剂量施用药物对受试者的副作用。例如，如实施例3所示，低剂量(即8μm和1μm)的博赛泼维与瑞德西韦联用即可实现完全抑制新型冠状病毒的增殖，其对病毒的抑制效果远高于分别以高剂量(即，40μm和5μm)单独施用的博赛泼维与瑞德西韦对病毒的抑制效果。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1是表示博赛泼维与新型冠状病毒主蛋白酶的复合物晶体结构；其中，黑色箭头所指的较小分子为博赛泼维，黑色箭头所指的较大分子为新型冠状病毒主蛋白酶；

图2是博赛泼维在不同浓度下对新型冠状病毒主蛋白酶的反应曲线图；

图3是博赛泼维对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制曲线图；

图4是博赛泼维和瑞德西韦对新型冠状病毒的抑制曲线图；

图5是40μm博赛泼维对感染新型冠状病毒的细胞的保护效果；

图6是感染新型冠状病毒的细胞病变图；

图7显示了博赛泼维和瑞德西韦联用对新型冠状病毒的抑制效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实验所用到的试剂，如无特殊说明，均可试剂公司购买到。

本发明的术语

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指药物制剂中的活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在本发明中，“容器”可采用通常药物中所使用的类型和形状，例如可以为瓶状、管状、罐状等，其材质可以是玻璃或有机聚合物或其他药物可接受的材质；或者是任何其他的本领域技术认可的药物可用的类型。

在本发明的具体实施方案中，所使用的博赛泼维可通过商购获得，其浓度为8μm-100μm；具体地，所述浓度可以是8μm-10μm、10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、10μm-50μm、10μm-60μm、10μm-70μm、10μm-80μm、10μm-90μm、20μm-30μm、20μm-40μm、20μm-50μm、20μm-60μm、20μm-70μm、20μm-80μm、20μm-90μm、20μm-100μm、30μm-40μm、30μm-50μm、30μm-60μm、30μm-70μm、30μm-80μm、30μm-90μm、30μm-100μm、40μm-50μm、40μm-60μm、40μm-70μm、40μm-80μm、40μm-90μm、40μm-100μm、50μm-60μm、50μm-70μm、50μm-80μm、50μm-90μm、50μm-100μm、60μm-70μm、60μm-80μm、60μm-90μm、60μm-100μm、70μm-80μm、70μm-90μm、70μm-100μm、80μm-90μm、80μm-100μm或90μm-100μm；更具体地，所述浓度可以是8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。

在本发明的具体实施方案中，所使用的瑞德西韦可通过商购获得(例如购自吉利德)，其浓度为1.00μm-100.00μm；具体地，所述浓度可以是1.00μm-2.00μm、1.00μm-3.00μm、1.00μm-4.00μm、2.00μm-3.00μm、2.00μm-4.00μm、2.00μm-5.00μm、3.00μm-4.00μm、3.00μm-5.00μm、4.00μm-5.00μm、5μm-10μm、10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、10μm-50μm、20μm-30μm、20μm-40μm、20μm-50μm、50μm-80μm、50μm-100μm、80μm-100μm；更具体地，所述浓度可以是1.00μm、1.05μm、1.10μm、1.15μm、1.20μm、1.25μm、1.30μm、1.35μm、1.40μm、1.45μm、1.50μm、1.55μm、1.60μm、1.65μm、1.70μm、1.75μm、1.80μm、1.85μm、1.90μm、1.95μm、2.00μm、2.10μm、2.20μm、2.30μm、2.40μm、2.50μm、2.60μm、2.70μm、2.80μm、2.90μm、3.00μm、3.10μm、3.20μm、3.30μm、3.40μm、3.50μm、3.60μm、3.70μm、3.80μm、3.90μm、4.00μm、4.10μm、4.20μm、4.30μm、4.40μm、4.50μm、4.60μm、4.70μm、4.80μm、4.90μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。

实施例1.博赛泼维对新型冠状病毒主蛋白酶活性的抑制效果

图1展示了博赛泼维与新型冠状病毒主蛋白酶的复合物晶体结构，表明博赛泼维可阻止新型冠状病毒主蛋白酶的活性。本发明人进一步进行了以下实验来验证博赛泼维对新型冠状病毒主蛋白酶活性的抑制效果。

1.实验方法

用pbs溶液将20mm的博赛泼维溶液(购自陶素生化)进行稀释，得到浓度分别为2000μm、400μm、80μm、16μm、3.2μm、0.64μm、0.128μm的博赛泼维溶液。

在黑色96孔板分别加入10μl上述稀释后的不同浓度的博赛泼维溶液，每个浓度重复3个孔，再加入30μl的3μm新型冠状病毒主蛋白酶溶液(购自苏州金斯瑞公司)。同时设对照组：阴性对照组为加入10μlpbs溶液和30μl的3μm新型冠状病毒主蛋白酶溶液，重复3个孔；空白对照组为加入40μlpbs缓冲液，重复3个孔。然后将黑色96孔板放入37度培养箱孵育30分钟。然后向每个孔中加入10μl的20μm底物(dabcyl-tsavlqsgfrkme-edans)溶液(金斯瑞生物科技股份有限公司)，其中新型冠状病毒主蛋白酶可水解该底物释放荧光，从而通过检测荧光来反映酶活性。立即用酶标仪测量35分钟内每分钟的荧光值(ex340nm、em490nm)，每个孔共测量36次。

2.实验结果

用graphpadprism软件绘制横坐标为时间、纵坐标为荧光值的蛋白酶反应曲线图，如图2所示，随着博赛泼维的浓度增高，新型冠状病毒蛋白酶反应速率逐渐降低，80μm博赛泼维可以完全抑制蛋白酶活性。并计算30分钟内酶反应速率v。阴性对照的酶反应速率作为vmax，将加入不同浓度博赛泼维后的酶反应速率作为vx，空白对照的荧光变化速率为v0，则不同浓度博赛泼维对酶反应活性的抑制率为1-(vx-v0)/(vmax-v0)×100％。然后用graphpadprism分析作图后得到博赛泼维对主蛋白酶的ic50值，如图3所示，博赛泼维对新型冠状病毒蛋白酶的半数抑制浓度ic50为12.43μm。

实施例2博赛泼维和瑞德西韦在细胞水平对病毒的抑制效果

1.实验方法

用dmem培养基将20mm的博赛泼维进行梯度稀释，得到浓度分别为200μm、40μm、8μm、1.6μm、0.32μm、0.064μm、0.0128μm、0.00256μm的溶液。同时，将10mm的瑞德西韦溶液(陶素生化)用dmem培养基稀释成100μm、20μm、4μm、0.8μm、0.16μm、0.032μm溶液作为阳性对照。用dmem培养基将100％的dmso稀释成1％dmso培养基溶液作为空白对照。

在生物安全柜内用dmem稀释sars-cov-2病毒(来自中国疾病预防中心)至0.01moi。将长满vero细胞(购自上海细胞所)的96孔板拿至生物安全柜。向96孔板每个孔中加入100μl的0.01moi病毒溶液，同时向3个孔加入100μl的dmem(作为未感染组)，放入到co2培养箱中培养2h。在生物安全柜内将病毒上清液吸弃，并用pbs清洗，然后向不同孔中分别加入100μl上述稀释后的含有不同浓度博赛泼维的培养基溶液、含有瑞德西韦的培养基溶液(阳性对照)或100μl1％dmso培养基溶液(空白对照)。同时，向未感染组加入含1％dmso的培养基溶液。每个浓度梯度重复3遍。将细胞培养板移出生物安全柜，放入co2培养箱中，5％co2、37℃培养。48小时后裂解细胞，提取rna，进行rt-pcr检测ct值。72小时后，将96孔板拿出培养箱，用显微镜观察(注意：小心操作，以防瓶内感染性液体泄露)，记录细胞病变情况并进行拍照。

2.实验结果

利用实施例1中所述的graphpadprism分析作图方法获得阳性对照瑞德西韦和博赛泼维分别对新型冠状病毒的ec50。由图4可知，阳性对照瑞德西韦在细胞水平上对新型冠状病毒的半数抑制浓度ec50为0.58μm，博赛泼维在细胞水平上对新型冠状病毒的半数抑制浓度ec50为15.57μm。说明了博赛泼维在细胞水平上可以有效地抑制新型冠状病毒复制。

在40μm博赛泼维存在下，感染了新型冠状病毒的细胞没有观察到明显的病变(图5)，而没有加入博赛泼维的细胞，在感染了新型冠状病毒后出现了明显的细胞病变(图6)。这表明40μm的博赛泼维可以有效抑制新型冠状病毒的增殖。

实施例3博赛泼维与瑞德西韦联合抗新冠病毒实验

将vero细胞铺24孔板(50000细胞/孔)，24h后再利用100pfu的病毒进行孵育感染2h。感染后，将单层细胞用含有40μm博赛泼维、8μm博赛泼维、5μm瑞德西韦、1μm瑞德西韦、8μm博赛泼维+1μm瑞德西韦组合以及不加药物的avicell培养基进行固定(每组4个重复)。将板子放置于37℃培养72h后，4％多聚甲醛固定后用1％结晶紫染色后拍照(见图7)。从实验结果可以看出8μm博赛泼维+1μm瑞德西韦组合可以明显地抑制(或基本完全抑制)新型冠状病毒的增殖。

按照实施例3的操作方法，施用8μm博赛泼维+100μm瑞德西韦组合、8μm博赛泼维+20μm瑞德西韦组合以及100μm博赛泼维+1μm瑞德西韦组合也可实现类似的技术效果，可基本完全抑制新型冠状病毒的增殖。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。