一种鱼用疫苗联合免疫接种方法

本发明涉及鱼用疫苗领域；尤其涉及一种鱼用疫苗联合免疫接种方法。

背景技术：

由于水生养殖环境复杂，养殖过程中普遍存在多种病原混合感染风险。目前，我国已获批新兽药注册证的鱼用疫苗仅7种：草鱼出血病灭活疫苗、草鱼出血病活疫苗(gchv-892株)、嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗、牙鲆鱼溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌多联抗独特型抗体疫苗、大菱鲆迟纯爱德华氏菌活疫苗(eibav1株)、大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗(mvav6203株)、鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗(nh0618株)，上述疫苗基本为针对单一病原的单效价疫苗产品，故用于预防多病原混合感染导致的养殖病害存在严重局限性。

针对多病原混合感染，从技术上可采取两种免疫防控策略：1)一种疫苗自身表达含有两种及以上抗原，形成多效价免疫能力；2)两种以上单一效价疫苗混合配制形成联合疫苗产品，或采用优化的联合接种方式进行多种疫苗接种。第一策略多以一种疫苗株(或载体菌株)为主体出发株，通过基因重组技术构建形成可表达两种及以上外源抗原的重组疫苗株，从而具备针对两种以上病原的多价免疫应答效力。这种产品形式是目前国内外的一个热点研究开发领域，但由于属于遗传改造生物(geneticallymodifiedorganisms,gmo)，存在天然的潜在转基因生物安全问题，因此，在世界范围内各国的行政许可监管程序更加苛刻，极大增加了疫苗产品的研发周期，在国内外水产疫苗领域鲜有该类产品商业化。同时，该类产品形式无法精准控制各抗原的含量与占比，存在针对某一病原的免疫剂量不足或过量的缺陷，可导致多价免疫效力无法达到预期或过剂量接种安全隐患。

鉴于上述病害防控需求和不同疫苗免疫策略技术特点，开发兼具效力和安全性的联合免疫策略成为目前国内外水产疫苗商业化的主要技术形式。

大菱鲆(又名多宝鱼)是我国北方重要的海水经济养殖鱼种，2019年养殖量达约8万吨，但近年来病害频发导致的经济损失制约了大菱鲆养殖产业的健康可持续发展。

迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌是大菱鲆养殖过程中的两大重要细菌性病原，前者可引起腹水病，后者可引起出血性败血症。针对上述两种病原，华东理工大学开发了迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株，并均获批农业转基因生物安全证书(证书号：农基安(2013)第267号和农基安(2011)第065号)。两种疫苗单独注射接种大菱鲆可有效激发鱼体免疫应答，并获得良好免疫保护效果，相对免疫保护力(rps)均超过70％。但是两种疫苗能否联合应用、联合应用时是否存在抗原竞争、以何种接种策略联合应用可确保接种安全并使疫苗发挥最佳免疫效力，对养殖生产中多病害混合发生起到联防作用未知。

bao等考察了迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株与大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203同时注射接种大菱鲆的免疫效力。实验中两种疫苗以等体积混合后注射接种大菱鲆，抗原含量均为1×10⁶cfu/尾。结果表明，两种疫苗同时接种较单独接种时对爱德华氏菌的相对免疫保护力维持不变(rps均为70％)，对鳗弧菌的相对免疫保护力由77.7％提高至83.3％。但是该研究未对联合接种实施中两种抗原的含量、配比、接种顺序等进行考察。

另一方面，在养殖生产中，大菱鲆幼苗期更容易受感染爱德华氏菌感染，而此阶段(＜120日龄，＜50g)不适宜采用大规模注射接种方式进行免疫，只能采取浸泡免疫接种方式进行病害防控。这就使得在大菱鲆疫苗免疫策略实施中产生了防控漏洞，如何建立大菱鲆养殖全周期的免疫策略，实现养殖全程多病原防控成为一个亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是可实现两种鱼用疫苗联合免疫实施的接种策略，用于预防由迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌感染导致的养殖病害问题；提供了一种鱼用疫苗联合免疫接种方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种鱼用疫苗联合免疫接种方法，所述方法包括：

第一种方式：采用迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，该菌株的分类命名为：vibrioanguillarum，保藏号：cctccno:m204066；该菌株的抗原浓度以1:10进行疫苗配制注射接种大菱鲆；第一种联合接种策略可实现两种疫苗同时接种，减少鱼体因注射接种操作导致的机械损伤。同时，以抗原浓度为1:10进行疫苗配制后接种大菱鲆，疫苗安全性佳，未对大菱鲆生长产生抑制作用，同时较正常饲养组的饵料系数和死淘率均有降低，用迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌野生毒株进行攻毒挑战，较单联疫苗的相对免疫保护力有所提高。

第二种方式：选取幼苗期大菱鲆进行浸泡接种迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株，长至幼鱼期时采取注射接种大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株。第二种联合接种策略可实现对不同养成阶段的易感病原进行分阶段预防，两种接种方式有利于局部黏膜免疫应答和全身系统免疫应答的激发，同时，首次免疫有助于鱼体免疫系统对二次接种抗原的识别过程。该接种策略安全性佳，未对大菱鲆生长产生抑制作用，同时较正常饲养组的饵料系数和死淘率均有降低，用迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌野生毒株进行攻毒挑战，较单联疫苗的相对免疫保护力有所提高。

优选地，所述第一种方式中，所述迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株的推荐抗原含量为1×10⁵cfu/尾，所述大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株的推荐抗原含量为1×10⁶cfu/尾。

优选地，第一种方式中，所述大菱鲆的体重约为80～85g。

优选地，第二种方式中，以浸泡和注射方式先后接种大菱鲆，选取幼苗期大菱鲆进行浸泡接种迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株，抗原浓度为1×10⁷cfu/ml，长至幼鱼期时采取注射接种大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株，抗原浓度为1×10⁶cfu/尾。

优选地，第二种方式中，所述幼苗期大菱鲆体重约为3～5g，所述幼鱼期大菱鲆体重约为30～50g。

本发明以迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株(该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，该菌株的分类命名为：edwardsiellatarda，保藏号：cctccno:m2010278)和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株(该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，该菌株的分类命名为：vibrioanguillarum，保藏号：cctccno:m204066)为产品基础，以冷水性鲆鲽类养殖品种为免疫靶动物，探索了上述两种疫苗的联合接种策略，通过评价该策略对实际生产中鲆鲽类的饲料转化率、死淘率等关键生产性能的影响，确定联合接种策略的可行性和有效性，最终建立起以联合免疫接种为核心的新型鲆鲽类健康养殖生产体系，实现对多病原混合感染的联防联控效果。

本发明具有以下优点：

(1)本发明所涉及的联合免疫接种策略可有效激发鱼体免疫应答，较单联疫苗预防迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌的相对免疫保护力有显著提升。

(2)本发明根据大菱鲆养殖过程中的多病原病害流行特征，根据大菱鲆养殖不同阶段的主要病害威胁，采用各阶段大菱鲆适宜的免疫接种方式，对迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株(该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，该菌株的分类命名为：edwardsiellatarda，保藏号：cctccno:m2010278)和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株的接种配比、抗原浓度、接种方式和接种顺序等进行探索。

(3)本发明以迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株(该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，该菌株的分类命名为：edwardsiellatarda，保藏号：cctccno:m2010278)和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株为产品基础，以冷水性鲆鲽类养殖品种为免疫靶动物，探索了上述两种疫苗的联合接种策略，通过评价该策略对实际生产中鲆鲽类的饲料转化率、死淘率等关键生产性能的影响，确定联合接种策略的可行性和有效性，最终建立起以联合免疫接种为核心的新型鲆鲽类健康养殖生产体系，实现对多病原混合感染的联防联控效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。

实施例

本实施例涉及一种鱼用疫苗联合免疫接种方法，所述方法包括：

第一种方式：采用迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株(该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，该菌株的分类命名为：edwardsiellatarda，保藏号：cctccno:m2010278，保藏日期：2010年10月24日)和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株(该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，该菌株的分类命名为：vibrioanguillarum，保藏号：cctccno:m204066，保藏日期：2004年9月7日)的抗原浓度以1:10进行疫苗配制注射接种大菱鲆；第一种联合接种策略可实现两种疫苗同时接种，减少鱼体因注射接种操作导致的机械损伤。同时，以抗原浓度为1:10进行疫苗配制后接种大菱鲆，疫苗安全性佳，未对大菱鲆生长产生抑制作用，同时较正常饲养组的饵料系数和死淘率均有降低，用迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌野生毒株进行攻毒挑战，较单联疫苗的相对免疫保护力有所提高。

第二种方式：选取幼苗期大菱鲆进行浸泡接种迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株，长至幼鱼期时采取注射接种大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗mvav6203株。第二种联合接种策略可实现对不同养成阶段的易感病原进行分阶段预防，两种接种方式有利于局部黏膜免疫应答和全身系统免疫应答的激发，同时，首次免疫有助于鱼体免疫系统对二次接种抗原的识别过程。该接种策略安全性佳，未对大菱鲆生长产生抑制作用，同时较正常饲养组的饵料系数和死淘率均有降低，用迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌野生毒株进行攻毒挑战，较单联疫苗的相对免疫保护力有所提高。目前，注射接种是常见的鱼用疫苗免疫接种方式。但是接种操作可能导致鱼体机械损伤。因此，开发多联疫苗或探索疫苗联合接种策略，减少注射操作本身导致的鱼体损伤，对于预防多病原混合感染具有积极意义。然而，两种疫苗联合接种时是否存在抗原竞争是影响疫苗免疫效果的重要因素。鉴于此，我们首先对实施联合免疫接种的疫苗抗原浓度进行了确定。

尽管疫苗接种是预防养殖病害的有效方式，但由接种疫苗导致的鱼体生长缓慢、代谢水平降低等副作用时常是限制疫苗广泛应用的主要原因。因此，除需评价疫苗接种的安全性和免疫效力以外，尚需考察接种疫苗对受种鱼体生产性能的影响。生长性能、饵料系数和死淘率是评价鱼体生产性能的常见指标。本发明中在明确联合接种策略后，分别对上述指标进行定期测评，以分析联合接种策略实施的可行性。

浸泡接种在应用中操作较注射接种更简单，可在养殖鱼体较小时实施浸泡接种免疫。本发明探索了针对幼苗期大菱鲆实施浸泡接种免疫，在幼鱼期实施注射追加免疫的联合接种策略。数据显示，浸泡接种有助于鱼体对追加免疫抗原的识别。其中，所述的幼苗期大菱鲆体重约为3～5g，所述的幼鱼期大菱鲆体重约为30～50g。

1、不同抗原浓度联合注射接种大菱鲆的安全剂量确定

随机选取健康大菱鲆250尾，体重约80±10g，于试验前1周至于5个养殖缸暂养，每缸50尾，养殖水体1000l、水温16±2℃，盐度3‰。

试验中分别用不同抗原浓度的疫苗组合接种大菱鲆，抗原浓度见表1，注射剂量为100μl/尾，免疫接种后观察14天，记录各组大菱鲆死亡情况，由表1可知，两种疫苗以不同抗原浓度联合接种，低于单联疫苗推荐抗原浓度时安全性佳，未造成接种大菱鲆死亡现象；表1为不同抗原浓度联合接种大菱鲆的安全剂量试验数据；

表1

2、不同抗原浓度联合注射接种大菱鲆的免疫效力确定

随机选取健康大菱鲆600尾，体重约80±10g，于试验前1周置于5个养殖缸暂养，每缸120尾，养殖水体1000l、水温16±2℃，盐度3‰。

试验中分别用不同抗原浓度的疫苗组合接种大菱鲆，抗原浓度见表1，注射剂量为100μl/尾，免疫接种后正常饲养。接种28天后从各组中随机选取100尾，均分为2组，每组50尾，用迟纯爱德华氏菌野生毒株eib202株和鳗弧菌野生毒株mvm425株分别进行攻毒挑战，攻毒剂量分别为1×10⁴cfu/尾和1×10⁷cfu/尾。记录各组大菱鲆死亡情况。由表2可知，wed株疫苗的抗原浓度为1×10⁵cfu/尾或1×10⁶cfu/尾，mvav6203株疫苗的抗原浓度为1×10⁶cfu/尾时接种大菱鲆可产生较单联疫苗更好的免疫保护效果。鉴于生产成本、疫苗使用量等因素考虑，确定联合注射接种的疫苗抗原浓度：wed株为1×10⁵cfu/尾，mvav6203株为1×10⁶cfu/尾；表2为不同抗原浓度联合接种大菱鲆的免疫效力试验数据；

表2

3、不同抗原浓度联合注射接种大菱鲆的生产性能确定

试验选取烟台开发区天源水产有限公司养殖车间进行，对各养殖池进行标注：1^#、2^#、3^#……18^#、19^#、20^#，其中1^#～10^#为免疫组，11^#～20^#为对照组，每组约2000尾，体重约80±10g。免疫组以抗原浓度为wed株1×10⁵cfu/尾和mvav6203株1×10⁶cfu/尾联合注射接种大菱鲆，每尾接种剂量为100μl，对照组不做任何处理。每四周从各养殖池中随机抽取50尾大菱鲆进行称重，记录鱼体平均体重，分析疫苗接种组与对照组生长性能及整齐度是否存在差异；接种后4个月时统计疫苗接种组与对照组饵料系数及大菱鲆死淘率。由表3可知，接种后4个月内，对照组平均日增重为1.1～1.2g，免疫组平均日增重为1.4～1.5g。由表4可知，接种后4个月内，免疫组饲料系数为1.2，死淘率为1.8％，对照组饲料系数为1.5，死淘率为2.8％；表3为不同抗原浓度联合接种大菱鲆的生长性能试验数据；表4为不同抗原浓度联合接种大菱鲆的饲料系数和死淘率确定。

表3

表3中，a.净增重代表免疫后120日大菱鲆重量减去免疫当天大菱鲆重量；

b.日增重等于净增重除以120。

c.表格中单位为g(克)。

表4

4、不同免疫方式联合接种大菱鲆的安全性确定

试验选取烟台开发区天源水产有限公司养殖车间进行。选取体重约3～5g的健康大菱鲆10000尾，实施迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株浸泡接种操作。接种时将大菱鲆从养殖池中取出，疫苗液浓度为1×10⁷cfu/ml，浸泡时间为30min，浸泡水体体积为100l，每次浸泡500尾，浸泡过程需通纯氧气。浸泡结束后返回原养殖池正常喂养，并按照生产实际情况进行倒池和分池操作。同时，取相同批次、相同规格的大菱鲆幼苗10000尾正常饲养，作为对照组。对各养殖池进行标注：1^#、2^#、3^#……18^#、19^#、20^#，其中1^#～10^#为免疫组，11^#～20^#为对照组，每组约养殖1000尾，免疫接种后观察14天，记录各组大菱鲆死亡情况。

待上述幼苗大菱鲆长至体重约30～50g实施注射追加免疫接种操作。将mvav6203株以抗原浓度为1×10⁶cfu/尾注射接种大菱鲆，每尾接种剂量为100μl，对照组不做任何处理。免疫接种后观察14天，记录各组大菱鲆死亡情况。由表5可知，两种疫苗以不同免疫方式联合接种时安全性佳，实验期间大菱鲆死亡为正常死亡；表5为不同免疫方式联合接种大菱鲆的安全性确定。

表5

5、不同免疫方式联合接种大菱鲆的免疫效力确定

从上述免疫组和对照组中各随机选取健康大菱鲆120尾，体重约40±10g，于试验前1周置于2个养殖缸暂养，每缸120尾，养殖水体1000l、水温16±2℃，盐度3‰。

从各组中随机选取100尾，均分为2组，每组50尾，用迟纯爱德华氏菌野生毒株eib202株和鳗弧菌野生毒株mvm425株分别进行攻毒挑战，记录各组大菱鲆死亡情况。由表6可知，表6为不同免疫方式联合接种大菱鲆的免疫效力试验数据。

表6

6、不同免疫方式联合接种大菱鲆的生产性能确定

试验选取烟台开发区天源水产有限公司养殖车间进行。经浸泡和注射接种的大菱鲆正常饲养于养殖池。注射接种后每四周从各养殖池中随机抽取50尾大菱鲆进行称重，记录鱼体平均体重，分析疫苗接种组与对照组生长性能及整齐度是否存在差异；接种后4个月时统计疫苗接种组与对照组饵料系数及大菱鲆死淘率。由表7可知，接种后4个月内，对照组平均日增重为0.69～0.86g，免疫组平均日增重为0.89～1.04g。由表8不同免疫方式联合接种大菱鲆的饲料系数和死淘率确定可知，接种后4个月内，免疫组饲料系数为0.9，死淘率为1.4％，对照组饲料系数为1.2，死淘率为2.0％；表7为不同免疫方式联合接种大菱鲆的生长性能试验数据；

表7

表7中，a.净增重代表免疫后120日大菱鲆重量减去免疫当天大菱鲆重量；

b.日增重等于净增重除以120。

c.表格中单位为g(克)

表8

由上述实施例可知，本发明以迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗(mvav6203株)为产品基础，以冷水性鲆鲽类养殖品种为免疫靶动物，探索了上述两种疫苗的联合接种策略，通过评价该策略对实际生产中鲆鲽类的饲料转化率、死淘率等关键生产性能的影响，确定联合接种策略的可行性和有效性，最终建立起以联合免疫接种为核心的新型鲆鲽类健康养殖生产体系，实现对多病原混合感染的联防联控效果。

针对现有技术的不足，本发明具有以下优点：(1)本发明所涉及的联合免疫接种策略可有效激发鱼体免疫应答，较单联疫苗预防迟纯爱德华氏菌和鳗弧菌的相对免疫保护力有显著提升。(2)本发明根据大菱鲆养殖过程中的多病原病害流行特征，根据大菱鲆养殖不同阶段的主要病害威胁，采用各阶段大菱鲆适宜的免疫接种方式，对迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗(mvav6203株)的接种配比、抗原浓度、接种方式和接种顺序等进行探索。(3)本发明以迟纯爱德华氏菌减毒候选疫苗株wed株和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗(mvav6203株)为产品基础，以冷水性鲆鲽类养殖品种为免疫靶动物，探索了上述两种疫苗的联合接种策略，通过评价该策略对实际生产中鲆鲽类的饲料转化率、死淘率等关键生产性能的影响，确定联合接种策略的可行性和有效性，最终建立起以联合免疫接种为核心的新型鲆鲽类健康养殖生产体系，实现对多病原混合感染的联防联控效果。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。