葛根芹菜汤在制备抗败血症及心肌损伤营养食品中的应用的制作方法

本发明属于营养食品技术领域，特别是涉及葛根芹菜汤在制备抗败血症及心肌损伤营养食品的应用。

背景技术：

葛根芹菜汤主要成分为葛根、芹菜、山楂、决明子、山药、枸杞子、玉米须、低聚果糖，具有清热除烦、生津止渴、降血糖的功效。

现已有中医临床经验表明，葛根及其提取物对于治疗糖尿病及其并发症、心血管疾病等有着不错的疗效。

技术实现要素：

本发明提供了一种葛根芹菜汤在制备抗败血症及心肌损伤营养食品的应用。

为了实现上述目的，本发明实施例的一个方面提供了，葛根芹菜汤用于制备治疗和/或预防败血症的营养食品的应用。

进一步的，葛根芹菜汤用于制备治疗和/或预防败血症诱发的心肌损伤营养食品的应用。

本发明的另一个方面，提供了，一种治疗和/或预防败血症及其诱发的心肌损伤营养食品，所述营养食品包括葛根8—12份、山药6—8份、枸杞子3份—6份、山楂15—25份、决明子15—25份、芹菜6—8份和玉米须5—8份。

进一步的，所述营养食品食用量为每千克体重3g。

进一步的，所述营养食品为丸状、片状、液态、散剂状中的一种。

本发明相对现有技术的有益效果：经过试验证明，本发明所述葛根芹菜汤可增加体重；升高体温；改善败血症评分；增加白细胞(whitebloodcell，wbc)、淋巴细胞(lymphocyte，lym)和粒细胞(granulocyte，gra)的数量以及降低血清中谷草转氨酶(aspartateaminotransferase，ast)和尿素氮(bloodureanitrogen，bun)的水平；同时可通过增加左心室收缩末期容积(lvesv)、左心室舒张末期容积(lvedv)，减小左心室收缩末期后壁厚度(lvpw；s)、左心室舒张末期后壁厚度(lvpw；d)，改善由败血症引起的心肌组织损伤；另外葛根芹菜汤也能通过降低心肌组织中炎症相关分子白细胞介素-1β(interleukin-1β，il-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)、白细胞介素-18(interleukin-18，il-18)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)、cxc类趋化因子配体2(cxcligand2,cxcl2)、nod样受体家族3(nod-likereceptorpyrindomain-containingprotein3，nlrp3)、ly6g和f4/80的水平发挥抗炎作用，从而对抗败血症及其引发的心肌损伤具有很好的有益作用。

附图说明

图1为葛根芹菜汤对小鼠体重的影响试验图。

图2a为小鼠功能学检测造模图。

图2b为败血症评分结果图。

图2c为肛温结果图，结果以均数±标准差表示，n＝6；^*vs.clp组，^*p<0.05，^***p<0.001，^****p<0.0001。

图3为葛根芹菜汤对clp损伤后小鼠血常规各项指标的影响结果图，于小鼠术后8h测定血常规，结果以均数±标准差表示，n＝6；^*vs.clp组，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，^****p<0.0001。

图4为小鼠术后8h测定血生化结果图，结果以均数±标准差表示，n＝6；^*vs.clp组，^*p<0.05，^**p<0.01，^****p<0.0001。

图5a为葛根芹菜汤对clp损伤8h后小鼠心肌组织切片he染色结果。

图5b为葛根芹菜汤对clp损伤8h后小鼠心肌组织切片masson染色结果；he，苏木精-伊红。

图6a为a轴超声心动图胸骨旁左室长轴切面、m模典型图片以及各项心脏功能指标的统计分析图。

图6b为b轴超声心动图短轴切面、m模典型图片以及各项心脏功能指标的统计分析图；结果以均数±标准差表示，n＝6，^*vs.clp组，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，^****p<0.0001。

图7a为免疫组织化学染色结果图。

图7b为mrna表达水平结果图；结果以均数±标准差表示，n＝6，^*vs.clp组，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，^****p<0.0001。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例的说明书和权利要求书中的术语“第一”和“第二”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述对象的特定顺序。例如，第一参数集合和第二参数集合等是用于区别不同的参数集合，而不是用于描述参数集合的特定顺序。

在本发明实施例的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是指两个或两个以上。例如，多个元件是指两个元件或两个以上元件。

本文中术语“和/或”，是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，显示面板和/或背光，可以表示：单独存在显示面板，同时存在显示面板和背光，单独存在背光这三种情况。本文中符号“/”表示关联对象是或者的关系，例如输入/输出表示输入或者输出。

在本发明实施例中，“示例性的”或者“例如”等词用于表示作例子、例证或说明。本发明实施例中被描述为“示例性的”或者“例如”的任何实施例或设计方案不应被解释为比其它实施例或设计方案更优选或更具优势。确切而言，使用“示例性的”或者“例如”等词旨在以具体方式呈现相关概念。

2016年，《败血症和败血性休克国际共识定义》(sepsis-3)将败血症定义为宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。败血症加重可引起感染性休克、弥散性血管内凝血和器官功能受损，严重威胁患者生命。心脏是易受败血症损伤的靶器官之一，充分证据显示败血症可导致心脏功能障碍。临床研究表明，败血症患者并发心脏功能障碍死亡率高达70％-90％。而无心脏功能障碍的败血症患者死亡率约为20％。

盲肠结扎穿孔(cecalligationandpuncture，clp)动物模型是经典的败血症动物模型，本发明采用clp动物模型为研究对象，根据现有技术研究，该动物模型可造成急性心肌损伤，如败血症诱发的心肌损伤。

败血症诱发的心肌损伤属于感染性心肌损伤的一种，感染性心肌损伤指病毒感染过程中或恢复期中出现的如心脏扩大、心力衰竭、心源性休克或心律异常等反应，典型的症状为疲乏无力、食欲不振、恶心、呕吐、呼吸困难、面色苍白以及发热等。

本发明所述的感染性心肌损伤，特别是指细菌性心内膜炎、系统性或者其他脏器感染所致菌血症导致的心肌炎性病变和系统性或者其他脏器感染所致脓毒血症导致的心肌炎性病变，临床上多用肾上腺皮质激素和广谱抗生素，防止菌群失调。在应用过程中应严加观察，特别注意有无消化道、泌尿道和呼吸道的真菌感染。

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些的任何限定。

需要说明的是，以下实施例所用的葛根芹菜汤由陕西健驰生物药业有限公司提供，所用动物购自空军军医大学实验动物中心，所用试剂均为市场采购。如无特殊说明，以下实施例中所采用的实验方法或相关检测方法采用本领域已知方法。所述葛根芹菜汤包括葛根8—12份、山药6—8份、枸杞子3份—6份、山楂15—25份、决明子15—25份、芹菜6—8份和玉米须5—8份。

制备方法如下，步骤一：于35—50摄氏度之间进行干燥，干燥时间2个小时；

步骤二：粉碎，将物料各自粉碎后，分别过120目筛，随后将筛下物混合即得。

试验例1:发明人研究发现葛根芹菜汤可显著增加小鼠体重。

方案：

连续灌胃给药葛根芹菜汤15天,观察并记录小鼠的体重变化。

步骤：

使用balb/c小鼠作为研究对象，按照研究设计，用随机数字表法将balb/c小鼠分为对照组和葛根芹菜汤低、中、高剂量实验组，每组12只。按照10ml/kg(体重)的浓度给对照组pbs(磷酸缓冲盐溶液)，实验组葛根芹菜汤(pbs溶解，制成剂量分别为0.75g/kg、1.5g/kg、3g/kg的葛根芹菜汤溶液)，每天给药1次，共15天，确保每次给药的时间点相同，每天观察小鼠状态并记录小鼠体重。

结果：

小鼠体重曲线如图1所示，与对照组相比，葛根芹菜汤低、中剂量实验组小鼠的体重差异不大，而葛根芹菜汤高剂量实验组小鼠的体重显著增加，从而验证了葛根芹菜汤高剂量可对小鼠体重增加有明显影响。

试验例2：发明人研究发现葛根芹菜汤能改善败血症评分、肛温及败血症引起的血常规变化。

方案：

给予葛根芹菜汤预处理15天，然后采用clp手术，于在体水平上构建败血症心肌损伤模型。

步骤：

使用balb/c小鼠作为研究对象，按照研究设计，用随机数字表法进行分组，小鼠感染性心肌损伤模型按照rittirschd等发表的clp实验方法，复制重度感染性心肌损伤模型。具体实验步骤如下：

(1)分组：将balb/c小鼠分为假手术组、clp组、葛根芹菜汤低、中、高剂量实验组，每组6只；

(2)给药：手术前15天进行预处理(灌胃)，按照10ml/kg(体重)的浓度给假手术组、clp组pbs(磷酸缓冲盐溶液)，保护组葛根芹菜汤(pbs溶解，制成剂量分别为0.75g/kg、1.5g/kg、3g/kg的葛根芹菜汤溶液)，每天给药1次，共15天，确保每次给药的时间点相同；

(3)造模：①第16天造模，采用小动物吸入麻醉系统对小鼠进行麻醉：小鼠吸入含异氟烷2％(体积分数vol/vol)的氧气，麻醉流量为3l/min，造模过程中流量为1.5l/min，麻醉程度监测标准为肢体的撤回反射消失，将小鼠固定并持续吸入含异氟烷2％的氧气维持麻醉；②小鼠腹正中区域备皮，75％乙醇消毒皮肤两次，延中下腹部正中行纵切口1-2cm，逐层切开分离皮肤、皮下组织，见腹白线，延腹白线切开腹直肌及腹膜，切口两侧用0.9％生理盐水湿润，用弯镊进腹，找到盲肠后轻柔牵出，将靠近回盲瓣处的粪便轻柔挤向盲肠末端(避免空气残留)，在距盲肠末端1/3处用4号无菌手术缝线结扎盲肠，在结扎线与盲肠末端中点处用25g针头对穿已结扎肠(避开血管)，穿孔后轻轻挤压盲肠，可见结扎段盲肠内容物质顺穿刺孔流出，将盲肠连同周围所有肠管还纳入腹腔，用3号无菌手术缝线逐层间断缝合腹膜及皮肤；③术毕，所有实验小鼠均于术后立即背部皮下注射37℃生理盐水(10ml/kg体重)进行液体复苏，标记后放回鼠笼，等待苏醒。假手术组除不进行盲肠结扎穿孔外，其余步骤与实验组相同。

(4)根据败血症评分表对clp后8h的小鼠进行打分。

(5)检测clp手术8h后小鼠的肛温：固定小鼠，将温度计探头水平插入小鼠直肠2cm，待肛温测量仪显示屏上的读数稳定后记录肛温。

(6)检测clp手术8h后小鼠血常规各项指标的变化：损伤8h后采用摘眼球取血法取血，采用全自动血常规仪进行血常规检测。

结果：

于小鼠clp处理8h进行败血症评分。结果如图2b所示，与假手术组相比，clp组败血症评分显著升高(p<0.05)，给予高剂量葛根芹菜汤处理后，败血症评分显著降低(p<0.05)；

于小鼠clp处理8h检测小鼠肛温。如图2c所示，与假手术组相比，clp组肛温显著降低(p<0.05)，给予高剂量葛根芹菜汤处理后，肛温显著升高(p<0.05)；

于小鼠clp处理8h后检测了血常规相关指标的变化。如图3所示，与假手术组相比，wbc、lym、plt显著减少(p<0.05)；给予高剂量葛根芹菜汤处理后，wbc、plt均显著增加(p<0.01)，但对lym无显著影响(p＝0.2)。

发明人研究发现葛根芹菜汤能改善败血症引起的血生化变化。

方案：

给予葛根芹菜汤预处理15天，然后采用clp手术，于在体水平上构建败血症心肌损伤模型。

步骤：

检测clp手术8h后小鼠血生化各项指标的变化：损伤8h后采用摘眼球取血法取血，收集每组全血，3000r/min，离心10min，吸取血清，随后使用全自动血生化分析仪进行检测。

结果：

于小鼠clp处理8h后检测了血生化相关指标的变化，如图4所示，与假手术组相比，clp损伤8h后，血清中bun、ast水平显著上升(p<0.01)；而给予高剂量葛根芹菜汤处理后，bun、ast水平出现显著下降(p<0.05)。

发明人研究发现葛根芹菜汤能改善败血症引起的心肌组织损伤。

方案：

给予葛根芹菜汤预处理15天，然后采用clp手术，于在体水平上构建败血症心肌损伤模型。

步骤：

心肌组织he染色：

①石蜡包埋：心尖部缓慢注入含肝素生理盐水，右心耳流出的液体变为透明时，将灌注液体替换为4％多聚甲醛固定液；多聚甲醛组织固定成功后，沿心脏根部剪断各血管，完整取下心脏；心脏取出后，切下心脏左半边(左心房及左心室)放入4％多聚甲醛中，进行后固定至少24h；按照顺序依次在80％、95％、95％、100％乙醇中浸泡40min，再按照100％乙醇、100％乙醇∶二甲苯＝1∶1混合液、二甲苯浓度梯度浸泡30min进行组织脱水透明；然后于包埋机中浸蜡3h，最后进行滴蜡包埋。

②切片：设置切片厚度为5μm，使用捞片法将切片贴于多聚赖氨酸覆膜载玻片上，70℃烤片1h后，60℃烤片5h。

③染色：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再次浸泡10min，按照100％、100％、95％、95％、80％乙醇、去离子水的顺序依次浸泡2min脱蜡至水，以备染色；将切片浸入苏木素染液染色3min，使用自来水轻柔冲洗5min；浸入1％盐酸乙醇30s，1％氨水3min脱色，使用自来水轻柔冲洗3min；浸入伊红染液染色3min，使用自来水轻柔冲洗3min；按照70％、80％浓度乙醇30s，95％、95％、95％、100％、100％浓度梯度乙醇、二甲苯、二甲苯的顺序分别浸泡2min进行脱水透明处理；中性树胶封片。

结果：

小鼠心肌组织he染色结果显示，如图5a、5b所示，与假手术组相比，clp损伤后心肌组织结构紊乱，视野内细胞核数量显著增加，肌细胞间微血管单核细胞浸润增加；而给予高剂量葛根芹菜汤处理后，he染色可见心肌组织结构相对清晰，视野内细胞核数量减少，肌细胞间微血管单核细胞浸润减少。

发明人研究发现葛根芹菜汤可以改善败血症引发的心肌功能损伤。

方案：

给予葛根芹菜汤预处理15天，然后采用clp手术，于在体水平上构建败血症心肌损伤模型。

步骤：

小动物超声检测clp手术8h后小鼠心脏功能：各组动物于超声检测前一天脱去小鼠左胸区域被毛，小鼠经2％异氟烷麻醉，麻醉气体流量为1l/min，异氟烷吸入麻醉后固定于37℃恒温板上，充分暴露左侧胸廓，采用30mhz探头，选取标准胸骨旁左室长轴切面及标准左心室乳头肌短轴切面，记录m模心脏超声切面图像，测量指标包括：左室收缩末期容积、左室舒张末期容积、左室收缩末期后壁厚度、左室舒张末期后壁厚度、心率等。

结果：

小动物超声检测clp手术8h后小鼠心肌收缩功能，结果如图6a(胸骨旁左室长轴超声结果)、6b(左室短轴超声结果)所示，与假手术相比，小鼠心脏的lvesv、lvedv显著下降(p<0.001)，而给予高剂量葛根芹菜汤处理后，心功能明显改善(p<0.05)；以及与对照组相比，小鼠lvpws、lvpwd明显变厚(p<0.05)，而给予高剂量葛根芹菜汤处理后，心功能明显改善(p<0.05)。

发明人研究发现葛根芹菜汤通过减轻炎症反应，改善感染性clp引起的心肌损伤。

方案：

给予葛根芹菜汤预处理15天，然后采用clp手术，于在体水平上构建败血症心肌损伤模型。

步骤：

(1)免疫组织化学检测：

①石蜡包埋、切片步骤同上；

②染色：切片常规脱蜡至水：分别取各组小鼠心脏组织石蜡切片依次经二甲苯2次，每次10min，100％乙醇2次、每次10min；95％、90％、80％、70％乙醇各1次，每次5min，最后浸入蒸馏水中5min；抗原修复：柠檬酸钠缓冲液微波抗原修复20min，流水冲洗10min；阻断内源性过氧化物酶：3％双氧水，室温15min。pbs洗3次，每次5min；封闭：滴加5％正常山羊血清封闭液，室温孵育60min；滴加一抗：擦去多余血清，加一抗，4℃孵育过夜。pbs洗3次，每次5min；滴加二抗：滴加辣根过氧化物酶hrp标记的二抗(1∶5000，pbs配制)，37℃温箱内孵育1h，pbs洗3次，每次5min；dab显色：滴加dab0.5-3min，镜下控制显色程度，流水冲洗10min，苏木素复染，1％盐酸酒精分化，1％氨水脱色，脱水，经二甲苯透明后用中性树胶封片。

③显微镜下观察并拍照：显微镜下观察并拍照，光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位，每张切片随机找出20-30个不重叠视野，采用医学图象分析软件imagej5.0软件半定量计算。

(1)实时定量荧光pcr

①样品总rna提取：将装有小鼠心脏样本的离心管从液氮中取出后，加入1mltrizol和2个研磨小珠，置于组织破碎仪上于60hz破碎1min，轻轻摇晃使trizol与样品混匀，置于冰上裂解5min；加入200μl氯仿，手动剧烈震荡管体15s，室温孵育15min后，置于4℃高速离心机离心15min，转速为12000rmp/min；此时rna全部位于上层水相中，用移液器吸取400μl水相转移至干净的无rna酶的离心管中，加入等体积的异丙醇进行混合，手动摇晃15s，室温孵育10min后，置于4℃高速离心机离心15min，转速为12000rmp/min；弃上清，加入75％乙醇(用depc水配制)，手动摇晃使rna沉淀悬浮，室温孵育5min后，4℃，8000rmp/min离心5min，重复该操作一次；弃去乙醇溶液，留下rna沉淀，室温干燥5-10min；采用20μldepc水溶解rna沉淀，打开dna/rna浓度测定仪，测定样品的浓度，放于-80℃冰箱进行保存。

②反转录：将提取的总rna从-80℃冰箱中取出，加入反转录试剂(购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；货号：ag11706)后置于pcr仪器中进行反转录，反转录程序为：37℃15min；85℃5s；反转后的cdna放于-20℃保存，反转录体系如表2所示：

表2反转录体系

③qrt-pcr：将cdna、试剂盒(购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；货号：ag11409-s)及反所需引物(购自生工生物工程有限公司(上海)；nlrp3：正向引物5'-ggagttcttcgctgctatgta-3'；反向引物5'-ggaccttcacgtctcggttc-3'；il-1β：正向引物5'-gtgtctttcccgtggacctt-3'；反向引物5'-catctcggagcctgtagtgc-3'；il-6：正向引物5'-ttgggactgatgctggtgac-3'；反向引物5'-ggtatagacaggtctgttgggagt-3')；il-18：正向引物5'-tcaaagtgccagtgaaccc-3'；反向引物5'-tgtctgattccaggtctcca'；tnf-α：正向引物5'-actgaacttcggggtgatcg'；反向引物5'-tggtggtttgctacgacgtg-3'；cxcl2：正向引物5'-ccaccaaccaccaggctaca-3'；反向引物5'-ctgtagcctggtggttggt-3'，从-20℃冰箱中取出，准备好实验所需的器材；待样品和试剂盒融化后，按照以下比例配制溶液后，使用qrt-pcr仪器设置好的程序进行实验；反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s；58℃退火延伸20s；72℃终末延伸30s，共40个循环，反应体系如表3所示：

表3qrt-pcr反应体系

结果：

小鼠心肌组织ihc染色结果显示，图7a、7b为葛根芹菜汤对clp损伤8h后小鼠心肌炎症相关指标的影响，炎症相关典型指标f4/80、ly6g的免疫组织化学染色结果和炎症相关分子nlrp3、il-1β、il-6、il-18、tnf-α、cxcl2mrna的表达水平。如图7a所示，与假手术组相比，clp损伤后f4/80、ly6g表达均显著升高，而高剂量葛根芹菜汤预处理组中的表达量显著降低；小鼠心肌组织qrt-pcr结果显示,如图7b所示，与对照组相比，clp损伤后炎症相关分子il-1β、il-6、nlrp3、il-18、tnf-α、cxcl2的mrna水平均显著升高(p<0.05)，而高剂量葛根芹菜汤预处理组中的表达量显著降低(p<0.05)。

上面对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本发明的保护之内。