一种稀土上转换复合纳米材料用于肿瘤治疗

本发明涉及一种基于磷脂包覆的上转换纳米材料（ucnps）负载光敏剂竹红菌乙素（hb），并在ucnps表面peg上通过o-mn配位原位生长mno2，构建了一个肿瘤光动力/化学动力学（pdt/cdt）的协同治疗平台。是一种集合纳米技术，光学技术和化学作用的肿瘤治疗新技术，属于交叉学科相结合的现代医学微创或无创治疗领域。

本发明涉及以上转换纳米材料负载光敏剂hb，且将mno2直接原位生长在ucnps表面的复合纳米材料，作为一种理想的tme（肿瘤微环境响应疗法）响应型纳米治疗平台，用于机体内乏氧肿瘤的有效治疗。

背景技术：

近年来，光动力疗法（pdt）在临床恶性肿瘤治疗中受到广泛的关注。pdt是利用特定波长的光照射富集在肿瘤部位的光敏剂（ps），将o2转化为具有细胞毒性的活性氧（ros），ros可对蛋白质或dna造成不可逆损伤，进而诱导肿瘤细胞凋亡。与传统的手术、化疗和放疗相比，pdt具有侵袭性小、毒性低、选择性高、效能高、疗效好等诸多优点，在肿瘤治疗领域中有很大的发展前景。然而，至今仍然有许多不可避免的因素制约着pdt的临床应用。

首先，选择合适的光敏剂有利于获得高效的pdt结果。然而传统的光敏剂穿透深度和pdt效率之间很难达到平衡。据报道，竹红菌素具有抗病毒、抗肿瘤等作用，在预防和治疗癌症等疾病方面显示出巨大的药用潜力。其中，光敏剂竹红菌乙素（hb）的光敏活性和光疗效果要更为突出，由于其具有光毒性强、代谢快、三线态氧和单线态氧的量子产率高、对正常组织损伤小等优点，是发挥pdt的理想ps。然而，生物相容性差和穿透深度差的可见光作为激发光限制了其在pdt的应用。巧合地是，稀土掺杂的上转换纳米粒子（ucnps）可以将近红外光转换为紫外光或可见光，其介导的光动力疗法在增加光的组织穿透深度以对抗深部肿瘤方面显示出了巨大的效果，这使得pdt又向前迈出了关键性的一步。通过脂质体包覆后，hb的吸收峰产生较大红移，实现与ucnps的发射光谱高度匹配，从而提高荧光量子转移效率，产生高效的pdt作用。该pdt过程采用近红外光激发ucnps实现，由于近红外光在生物组织中的穿透深度较深，因此可以实现深部肿瘤治疗。

其次，由于肿瘤微环境（tme）的极度缺氧，对o2的高度依赖限制了pdt的发展。此外，在pdt过程中消耗的o2会进一步加重肿瘤缺氧，降低pdt的疗效，恶化肿瘤。所以需要采用一种有效的策略以增加缺氧区的氧浓度。高压氧疗法即在加压室呼吸纯o2，已被用于克服缺氧环境，但是正常组织中过量氧造成的高氧惊厥和气压创伤等副作用限制了它的广泛应用。各种纳米材料（如全氟化碳、cao2等）也被用于选择性地缓解癌症缺氧，但存在生物相容性差、o2生成效应短暂等局限性。

研究表明肿瘤细胞具有不同于正常细胞的独特代谢模式。一方面，由于在肿瘤发生过程中糖酵解代谢的上调，实体瘤会产生大量的乳酸，导致肿瘤微环境呈酸性，ph值显著降低。另一方面，恶性肿瘤细胞产生过多的h2o2，导致tme中h2o2水平显著升高。此外，研究还表明，肿瘤组织中的还原性谷胱甘肽（gsh）的含量至少是正常组织的4倍。综上所述，实体瘤tme具有明显的gsh、h2o2、h⁺含量高的特点。近年来，mno2纳米结构作为一种独特的tme-响应型纳米治疗诊断材料，引起了人们的极大兴趣。由于ph/氧化还原反应特性，脱落的mno2纳米结构可以被实体肿瘤中酸性的h2o2还原成mn²⁺，同时产生大量的氧，可明显改善氧依赖的pdt对低氧肿瘤的治疗作用。另外，mno2可以通过类fenton反应可生成高度活泼的羟基自由基（•oh），被证实可用于化学动力学治疗（cdt）。此外，gsh作为一种细胞内抗氧化剂，对pdt产生的¹o2和cdt产生的•oh具有很强的清除作用，从而大大增加了癌细胞对氧化应激的抵抗能力，降低了pdt与cdt的疗效。而通过mno2降低细胞内gsh水平是pdt/cdt纳米药物规避肿瘤耐药性、提高肿瘤治疗疗效的重要手段。

受上述研究启发，本研究方法将mno2直接原位生长在ucnps表面，作为一种理想的tme（肿瘤微环境响应疗法）响应型纳米治疗平台。原理为这种多功能纳米平台采用两亲性共聚物dspe-peg2000通过疏水相互作用与ucnps表面油酸配体结合，实现磷脂包裹上转换纳米颗粒，并通过致密的疏水层组装光敏剂hb，最后在ucnps表面的peg通过o-mn配位原位生长mno2纳米片。该平台是一个集肿瘤微环境响应、pdt/cdt为一体的理想设计，可充分发挥上转换纳米复合材料中各成分的作用，实现肿瘤的有效治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于构建一个近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台，通过肿瘤微环境响应、pdt/cdt的协同治疗，提高治疗效率，实现对乏氧肿瘤的有效治疗。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种可作为肿瘤微环境响应型（tme）纳米治疗平台的上转换纳米复合材料，其特征在于：是一个集肿瘤微环境响应、光动力治疗、化学动力学治疗为一体的理想设计；这种多功能纳米平台采用两亲性共聚物dspe-peg2000通过疏水相互作用与ucnps表面油酸配体结合，实现磷脂包裹上转换纳米颗粒，并通过致密的疏水层组装光敏剂hb，最后在ucnps表面的peg通过o-mn配位原位生长mno2纳米片，能充分发挥上转换纳米复合材料中各成分的作用，实现肿瘤的有效治疗。

本发明所述的作为肿瘤治疗平台的上转换纳米复合材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）根据热分解法制备了nayf4:yb,er纳米晶（ucnps），采用薄膜水化法制备了dspe-peg2000包覆nayf4:yb,er纳米晶的纳米粒子ucnps@dspe-peg2000（ucnps@dp）；

2）光敏剂hb的负载：棕色小瓶中各加入步骤1已合成的1mlucnps@dspe-peg2000（ucnps@dp）的dmf溶液和10μl、选自0、0.5、1、5、10、20、30、40mm的不同浓度hb的dmf溶液，避光搅拌24h，获得ucnps@dspe-peg2000@hb（ucnps@dpb）；

3）ucnps@dspe-peg2000@hb-mno2（ucnps@dpb-mno2）的制备：将100μl的步骤2）获得的ucnps@dpb水溶液添加到1.5ml的ep管中，加入320μl去离子水，然后将40μl、浓度为50mm的mes溶液和40μl、浓度为4mm的kmno4溶液依次添加到管中，在室温下超声30min；最后，用14500rpm离心10min收集沉淀物，用去离子水洗涤3次，分散于100μl去离子水中获得ucnps@dspe-peg2000@hb-mno2（ucnps@dpb-mno2），以备进一步使用；

4）上转换纳米复合材料对肿瘤细胞的杀伤作用：通过近红外光谱实验表明980nm激光对hela细胞无不良影响，孵育有ucnps@dpb的癌细胞在980nm激光照射下，在各浓度范围内均得到抑制，说明pdt起到了杀伤hela细胞的作用，相比较ucnps@dpb，ucnps@dpb-mno2对hela细胞有更加明显的抑制作用，这是由于包覆的mno2发生了降解，一方面，产生了o2，提高pdt的氧依赖性治疗效率；另一方面，产生了mn²⁺，介导类fenton反应的发生，产生剧毒•oh，引起肿瘤细胞的氧化应激，实现对肿瘤细胞的有效治疗。

上述的上转换纳米复合材料（ucnps@dpb-mno2）的制备；

1）光敏剂hb负载量的确定及稳定性考察：使用ucnps@dp对不同浓度的hb进行负载，当浓度达200μm后，颜色保持不变，基本达到饱和；进一步对其负载量进行考察，在dmf溶液中，当hb的浓度为200μm时，负载量达到饱和为15μg/mg；将复合物放置24h，离心取上清液，并测试吸收光谱；复合物分散在去离子水、pbs、乙醇、氯仿、dmem、rpmi-1640中离心后的上清液测定吸收光谱，仅有在乙醇中的发生了少量的泄漏，这是因为乙醇会破坏磷脂结构，而其他溶液中未发现hb的泄漏；使用二氯甲烷可以将负载在磷脂层中的hb完全萃取出来；该磷脂层性质稳定，能够很好地负载光敏剂用于肿瘤的光动力学治疗；

2）体外单线态氧的测试：采用化学探针1，3-二苯基异苯并呋喃（dpbf）对上转换纳米复合材料在980nm激光照射下产生的¹o2进行检测；在980nm下，激光分别单独照射hb和ucnps@dp是没有¹o2产生的，负载光敏剂hb后，随着复合物浓度的提高与照射时间的延长，dpbf的衰减程度逐渐加大，这种能高效产生¹o2的复合物为提高下一步的光动力治疗效果奠定了基础；

3）上转换纳米复合材料介导类fenton反应的测试：为了验证mn²⁺介导的类fenton反应，将含有10μg/mlmb、8mmh2o2和0.5mmmncl2的25mmnahco3溶液在37℃静置30min，通过665nm处的吸光度变化监测•oh诱导的mb降解；

4）gsh对•oh的清除作用：25mmnahco3溶液，含有10μg/mlmb、8mmh2o2、选自0、1、5和10mm的不同浓度的gsh和0.5mmmncl2或ucnps@dpb-mno2，在37℃下静置30min，通过665nm处的吸光度变化监测•oh诱导的mb降解。

本发明所述的上转换纳米复合材料，其特征在于：采用两亲性共聚物dspe-peg2000通过疏水相互作用与ucnps表面油酸配体结合，实现磷脂包裹上转换纳米颗粒；以hb为光敏剂，利用ucnps能将近红外光转换为540nm绿光，将其作为pdt疗法中介导的载体，进而激发光敏剂hb进行pdt过程；最后在ucnps表面的peg通过o-mn配位原位生长mno2纳米片；肿瘤微环境中内源性酸性h2o2水解mno2能实现o2的自给自足，克服肿瘤缺氧障碍，提高pdt的氧依赖性治疗效率；水解产生的mn²⁺可介导类fenton反应的发生，产生剧毒·oh，引起肿瘤细胞的氧化应激；mno2能消耗细胞内抗氧化产物gsh，减少·oh的清除，提高cdt效率；通过mtt实验表明上转换纳米复合材料浓度在200μg/ml以内，细胞存活率能达到90%以上，且ucnps@dpb-mno2对非癌性细胞几乎没有毒性；980nm激光处理下ucnps@dpb-mno2+nir处理组杀伤细胞的数量最多；该上转换纳米复合材料有良好的细胞相容性且对肿瘤细胞表现出良好的治疗效果。

具体地说，本发明设计构建了近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台，用于乏氧肿瘤的有效治疗。其策略是：首先采用两亲性共聚物dspe-peg2000通过疏水相互作用与ucnps表面油酸配体结合，实现磷脂包裹上转换纳米颗粒。其次，通过致密的疏水层组装光敏剂hb，高效、稳定发光的ucnps可以将980nmnir光转化为540nm绿色最强荧光，从而利用540nm绿光激发吸收光谱红移后的光敏剂hb进行pdt过程。同时，在ucnps表面的peg通过o-mn配位原位生长mno2纳米片，mno2可水解肿瘤微环境中内源性酸性h2o2进而实现o2的自给自足，克服肿瘤缺氧障碍，提高pdt的氧依赖性治疗效率。水解产生的mn²⁺可介导类fenton反应的发生，产生剧毒·oh，引起肿瘤细胞的氧化应激。mno2也可消耗细胞内抗氧化产物gsh，减少·oh的清除，提高cdt效率。该平台结合了肿瘤微环境响应、pdt和cdt的协同治疗，提高了治疗效率，实现了对乏氧肿瘤的有效治疗。

本发明所述的构建的近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台，用于乏氧肿瘤的有效治疗的方法，包括以下步骤：

1）根据高温裂解法制备了nayf4:yb,er纳米晶（ucnps），采用薄膜水化法制备了dspe-peg2000包覆nayf4:yb,er纳米晶的纳米粒子。

2）光敏剂hb的负载：光敏剂hb的负载：棕色小瓶中各加入1mlucnps@dspe-peg2000（简称为ucnps@dp）的dmf溶液和10μl不同浓度hb的dmf溶液（0、0.5、1、5、10、20、30、40mm），避光搅拌24h。

3）mno2的复合：ucnps@dspe-peg2000@hb-mno2（简称为ucnps@dpb-mno2）的制备。将100μl的ucnps@dpb水溶液添加到1.5ml的ep管中，加入320μl去离子水，然后将40μl的mes溶液（50mm）和40μl的kmno4溶液（4mm）依次添加到管中，在室温下超声30min。最后，用14500rpm离心10min收集沉淀物，用去离子水洗涤3次，分散于100μl去离子水中，以备进一步使用。

4）复合材料介导类fenton反应的测试：mn²⁺介导的类fenton反应产生•oh的验证：mb是一种能被•oh降解的染料，被选作•oh生成的指示剂。首先，为了验证mn²⁺介导的类fenton反应，将含有10μg/mlmb、8mmh2o2和0.5mmmncl2的25mmnahco3溶液在37℃静置30min，通过665nm处的吸光度变化监测•oh诱导的mb降解。gsh对•oh的清除作用：25mmnahco3溶液，含有10μg/mlmb、8mmh2o2、不同浓度的gsh（0、1、5和10mm）和0.5mmmncl2或ucnps@dpb-mno2，在37℃下静置30min，通过665nm处的吸光度变化监测•oh诱导的mb降解。

5）mtt检测细胞存活率：首先分别检测正常细胞和经cdt治疗后的肿瘤细胞的存活率作为对照组。其次对经pdt和cdt联合治疗后的肿瘤细胞的存活率检测，采用生长状况良好的hela细胞，以每孔100μl含1.0×10⁴个细胞的细胞密度铺在96孔板中，在37℃,5%co2的细胞培养箱中培养24h。在实验组对应的孔中分别加入不同浓度（0、25、50、100、200、400μg/ml）的ucnps@dpb和ucnps@dpb-mno2，孵育1h，pbs洗3遍。然后用980nm激发光（2w/cm²）照射20min。之后更换新鲜培养基再培养24h，吸出培养液，pbs洗1遍，在每个孔中加入100μl的mtt（1mg/ml），然后在37℃孵育4h，小心吸去培养液并加入150μldmso，摇床上低速振荡10min，酶标仪测定490nm处的吸光度，计算细胞存活率。

6）上转换复合纳米材料的光动/化学动力学治疗：balb/c小鼠按照标准规程培养，在进行两周的观察后在其右后肢背部注入适量的4t1细胞。当肿瘤长到可用大小时，将小鼠随机分为5组进行光照实验，分别为saline、nir、hb、ucnps@dpb以及ucnps@dpb+nir，每组5只。通过原位注射的方法注射60μl样品溶液，对于需要光照的nir及ucnps@dpb+nir组，用功率为2w的980nm激发器对肿瘤部位照射，照射时间为25min，每隔5min停止照射1min，光纤头到肿瘤部位的垂直距离为1.5cm。治疗时间持续14天，记录小鼠的体重以及实体肿瘤的体积。

7）组织病理学分析

h&e染色：摘除小鼠的肿瘤及各主要脏器后用4%的多聚甲醛进行固定。之后将样品进行包埋，切片和染色。于倒置显微镜下观察并评价其组织病理学改变。

tunel实验：取小鼠的肿瘤进行石蜡包埋、切片和染色处理，于荧光显微镜下观察并评价其组织病理学改变。

本发明成功构建了近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台。高效、稳定发光的ucnps可以将980nmnir光转化为540nm绿光，540nm绿光激发光敏剂hb进行pdt过程。肿瘤微环境中内源性酸性h2o2水解mno2可实现o2的自给自足，克服肿瘤缺氧障碍，提高pdt的氧依赖性治疗效率。水解产生的mn²⁺可介导类fenton反应的发生，产生剧毒·oh，引起肿瘤细胞的氧化应激。mno2也可消耗细胞内抗氧化产物gsh，减少·oh的清除，提高cdt效率。肿瘤细胞靶向特性（epr）使肿瘤细胞对上转换复合材料具有较高的选择性，避免了对正常细胞的损伤，显著降低了副作用。该平台结合了肿瘤微环境响应、pdt/cdt的协同治疗，提高了治疗效率，实现了对乏氧肿瘤的有效治疗。

本发明的优点：

（1）hb作为第二代有很大潜力的光敏剂，具备光毒性强、代谢快、单线态氧的量子产率高等优点，能够有效产生活性氧并杀死癌细胞。ucnps可以将近红外光转换为可见光或紫外光，hb与ucnps结合后，可在深部肿瘤中被近红外光间接激发，在增加光的组织穿透深度以对抗深部肿瘤方面显示出了明显的效果。克服了其他方法生物相容性差、穿透深度差等缺点、提高了专一性、降低了副作用；

（2）采用两亲性共聚物dspe-peg2000通过疏水相互作用与ucnps表面油酸配体结合，实现磷脂包裹上转换纳米颗粒，通过致密的疏水层组装光敏剂hb，使hb的吸收峰红移了105nm，与er掺杂的ucnps在540nm处的发射峰匹配。充分利用了上转换纳米材料nayf4：yb/er在540nm处的最强上转换荧光，并极大提高了pdt能量转移效率。

（3）肿瘤微环境中内源性酸性h2o2水解mno2可实现o2的自给自足，克服肿瘤缺氧障碍，提高pdt的氧依赖性治疗效率。

（4）mno2也可消耗细胞内抗氧化产物gsh，减少·oh的清除，提高cdt效率。肿瘤细胞靶向特性（epr）使肿瘤细胞对上转换复合材料具有较高的选择性，避免了对正常细胞的损伤，显著降低了副作用。

附图说明

图1为hb的浓度对应其荧光强度的标准曲线图，图中a是不同浓度的hb溶于dmf溶液中的荧光谱图；b是hb的浓度对应其荧光强度的标准曲线图。

图2为ucnps的紫外可见吸收光谱图、上转换发射光谱图及ucnps@dp负载hb前后的紫外可见吸收光谱图。

图3为各实验对照图，图中：(a)hb的uv图；(b)ucnps@dp的uv图；(c-g)不同浓度的ucnps@dpb的uv图；(h)dpbf和不同材料在980nm激发光下其415nm处吸光度随时间的变化曲线。

图4为ucnps@dp-mno2与100μmh2o2在酸性溶液（ph=5.5）中反应后(蓝线)的体外产氧量随时间的变化曲线图。

图5为不同浓度的gsh处理ucnps@dp-mno2后光谱图，图中：（a）为吸收光谱；（b）为上转换发射光谱图。

图6为表征上转换纳米复合材料介导类fenton反应的吸收谱图，图中：(a)分别用h2o2、mn²⁺、h2o2+mn²⁺、h2o2+mn²⁺+hco3^-处理mb后的吸收光谱(插图:样品照片)；(b)为不同浓度(1，2，4，8，10mm)h2o2处理mb后的吸收光谱(插图:样品照片)，对照组：mb，实验组：mb+mn²⁺+hco3^-+h2o2；(c)为不同浓度(1，5，10mm)谷胱甘肽处理mb后的吸收光谱(插图:样品照片)，对照组：mb，实验组：mb+mn²⁺+hco3^-+h2o2+gsh；(d)不同浓度(1，5，10mm)谷胱甘肽处理mb后的吸收光谱(插图:样品照片)，对照组：mb，实验组：mb+ucnps@dp-mno2+hco3^-+h2o2+gsh。

图7为hela细胞与不同浓度的材料孵育后在不同条件下的细胞存活率。

图8为hela细胞通过5种不同方式处理后用pi染色的荧光成像。

图9为基于上转换纳米复合材料的光动力/化学动力学治疗平台示意图，图中：a为上转换纳米复合材料合成图解；b为上转换纳米复合材料抗肿瘤机理图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实例1：

光敏剂hb的负载

1）热分解法制备nayf4:yb,er纳米晶（具体制备方法可参见专利申请号cn201810591016.2，实例2）：称取0.8mmol稀土硬脂酸盐和28mmolnaf加入到100ml三颈烧瓶中，加入12mloa（油酸）、8mlode（十八烯）；将体系置于氩气氛围中加热至140℃，保持30min进行脱水脱气；然后迅速升温至312℃～314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、蒸馏水洗涤离心至无有机油状物和naf成分，60℃真空干燥获得oa-ucnps备用；

2）dspe-peg2000包覆ucnps：取10mg步骤1）制得的oa-ucnps（简称为nayf4:yb,er）分散于氯仿中，充分超声，使其分散均匀；取12.5mg的dspe-peg2000（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000购于上海炎怡生物科技有限公司）溶解于氯仿中，将分散好的oa-ucnps（nayf4:yb,er）逐滴滴加于其溶液中，在避光的玻璃小瓶中搅拌至氯仿自然挥干；加入超纯水，剧烈超声10min，将其置于80℃水浴锅中，剧烈搅拌；离心后去掉上清液，加入超纯水，洗涤一次，再离心，去掉上清液，冷冻干燥获得ucnps@dspe-peg2000（简称ucnps@dp），用去离子水分散至2.5mg/ml备用。

3）光敏剂竹红菌乙素（hb）的负载：棕色小瓶中各加入1ml2.5mg/ml步骤2）获得的ucnps@dp（ucnps@dspe-peg2000）的dmf溶液和10μl不同浓度hb的dmf溶液（0、0.5、1、5、10、20、30、40mm），避光搅拌24h，获得ucnps@dspe-peg2000@hb（简称ucnps@dpb）。

3）hb负载量的确定及稳定性考察：配制不同浓度hb的dmf溶液（5、10、20、30、40、50μm），在470nm激发下可测得hb在550-800nm处的发射光谱，确定在620nm处有最大吸光度，测定其在620nm处的荧光强度，绘制荧光强度-浓度的标准曲线，如图1所示。将各个组装好hb的ucnps（ucnps@dpb）溶液离心，未组装的hb在上清液dmf中，吸取上清液，测定其在620nm处的荧光强度，根据标准曲线，计算上清液中游离hb的浓度。

hb负载在磷脂层稳定性的考察，将复合物放置24h后，离心取上清液，并测试吸收光谱。如图2所示，复合物分散在去离子水、pbs、乙醇、氯仿、dmem、rpmi-1640中离心后的上清液测定吸收光谱，仅有在乙醇中的发生了少量的泄漏，这是因为乙醇会破坏磷脂结构，而其他溶液中未发现hb的泄漏。因此，该磷脂层性质稳定，能够很好地负载光敏剂用于肿瘤的光动力学治疗。

4）体外单线态氧的测试：在相同的980nm激发光功率密度（2w/cm²）和测试条件下分别对hb、ucnps@dp和不同浓度的ucnps@dpb（25、50、100、200、400μg/ml）的进行测试。结果如图3所示，根据化学探针1，3-二苯基异苯并呋喃（dpbf）的衰减可以看出，作为对照，980nm激光分别单独照射hb和ucnps@dp是没有¹o2产生的。负载光敏剂hb之后，随着复合物浓度的提高，随着照射时间的延长，dpbf的衰减程度逐渐加大。

实例2

ucnps@dpb-mno2复合材料的制备

1）ucnps@dpb-mno2（ucnps@dspe-peg2000@hb-mno2）的制备：将100μl，2.5mg/ml的ucnps@dpb水溶液添加到1.5ml的ep管中，加入320μl去离子水，然后将40μl的2-吗啉乙磺酸（mes）溶液（50mm）和40μl的kmno4溶液（4mm）依次添加到管中，在室温下超声30min。最后，用14500rpm离心10min收集沉淀物，用去离子水洗涤3次，分散于100μl去离子水中，可备进一步使用。

2）上转换纳米复合材料自供氧能力的表征：因实体肿瘤中存在一个酸性且富含h2o2的微环境，且mno2纳米片具有ph/氧化还原反应特性，在肿瘤微环境中酸性条件下可被h2o2还原为mn²⁺，并产生大量氧气，可显著改善氧依赖性pdt对缺氧肿瘤的治疗效果。为了直接验证该纳米复合物催化h2o2转化为溶解氧的能力。分别测量了复合物在100μmh2o2的中性（ph=7.4）/酸性（ph=5.5）溶液的产氧能力，结果如图4所示，在弱酸性条件下能产生更多的溶解氧，产氧速度快且连续，符合肿瘤微环境中的酸性条件。

3）上转换纳米复合材料介导类fenton反应的表征：实体肿瘤微环境具有明显的gsh、h2o2、h⁺含量高的特点。因此，上转换纳米复合材料中的mno2纳米片可以与肿瘤微环境中h⁺、gsh和h2o2反应，然后释放出mn²⁺，介导类fenton反应的发生，产生剧毒·oh，进而杀伤肿瘤细胞。

为了验证不同浓度谷胱甘肽（gsh）对复合物是否能发生氧化还原反应，实验测定了不同浓度gsh处理复合物后的吸收光谱和ucl发射光谱。如图5中的a所示，吸收值随gsh浓度增高而降低；同样，随着gsh浓度的增加，ucl也逐渐恢复，如图中的b所示。说明mno2在该环境中易被降解为mn²⁺。

mn²⁺介导的类fenton反应通过生成•oh来实现肿瘤细胞的cdt。为了验证•oh的生成，在碳酸氢盐（hco3^-）的存在下使用可被•oh降解的亚甲基蓝（mb）染料作为•oh生成的指示剂，如图6中的a所示。

随着h2o2浓度的增加，mb的吸光度降低，说明由mn²⁺介导的类fenton反应生成的•oh是依赖于h2o2浓度,如图6中的b所示。值得注意的是，细胞内gsh作为•oh的清除剂，限制了cdt的疗效。如图6中的c所示，加入gsh后，mn²⁺介导的类fenton反应对mb的降解非常有限。相反，由于gsh的消耗特性（图6中的d），mno2可以有效地消除这种清除效应。因此，与单独mn²⁺相比，在gsh存在下，mno2可显著提高•oh的生成。

实例3

基于上转换复合材料的光动力/化学动力学治疗平台的构建

1）mtt检测pdt和cdt联用对肿瘤细胞治疗效果：为了研究pdt与cdt联用对肿瘤细胞的治疗效果，在980nm激光照射下比较了ucnps@dpb与ucnps@dpb-mno2的抗癌效果。如图7所示，nir处理组细胞存活率接近95%，说明980nm激光对hela细胞无不良影响，孵育有ucnps@dpb的癌细胞在980nm激光照射下，在各浓度范围内均得到明显地抑制，说明pdt起到了杀伤hela细胞的作用，相比较ucnps@dpb，ucnps@dpb-mno2对hela细胞的抑制程度更大，荧光显微镜观察细胞死亡情况如图8所示，这是由于包覆的mno2发生了降解，一方面，产生了o2，提高pdt的氧依赖性治疗效率；另一方面，产生了mn²⁺，介导类fenton反应的发生，产生剧毒·oh，引起肿瘤细胞的氧化应激。因此，将pdt与cdt联合起来更有利于肿瘤的治疗，原理如图9所示。

2）上转换复合纳米材料的光动/化学动力学治疗：balb/c小鼠按照标准规程培养，在进行两周的观察后在其右后肢背部注入适量的4t1细胞。当肿瘤长到可用大小时，将小鼠随机分为5组进行光照实验，分别为saline、nir、hb、ucnps@dpb以及ucnps@dpb+nir，每组5只。通过原位注射的方法注射60μl样品溶液，对于需要光照的nir及ucnps@dpb+nir组，用功率为2w的980nm激发器对肿瘤部位照射，照射时间为25min，每隔5min停止照射1min，光纤头到肿瘤部位的垂直距离为1.5cm。治疗时间持续记录小鼠的体重以及实体肿瘤的体积。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。