一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法

1.本发明属于基因递送载体技术领域，特别是涉及一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法。


背景技术：

2.冠心病是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄、阻塞或痉挛，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，亦称缺血性心脏病。冠心病已成为全世界人民关注的大难题，也是现今人类所亟待解决的疾病。
3.基因治疗是指在靶细胞，将正常基因细胞导入其中，表达正常细胞的蛋白质，以达到治疗的目的，基因治疗药物与手术治疗，传统药物治疗等方法治疗疾病相比，具有副作用小，靶向性强等优点，已成为现今研究治疗许多疾病的大发展方向。1993年，wilson等应用低密度脂蛋白受体(ldl
‑
r) 基因治疗家族性高胆固醇血症，这是基因治疗首次在心血管病相关领域实现临床应用。近年来，心血管病基因治疗占全部基因治疗临床研究的比例逐渐增加，在美国，该比例从1994年的3％上升至2000年的17％；基因治疗的对象也从单基因遗传的心血管病扩展到多基因心血管病，如高血压病和冠心病，有望为这些疾病的治疗开拓一片新的天地。
4.为了将一种基因转移入适当的细胞需要一个载体，合适载体的选择，是决定基因治疗是否有效的关键因素之一。可以搭载基因进入细胞的载体有很多，包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体能够高效感染哺乳动物细胞，但病毒基因整合到宿主染色体，其安全性尚未得到确证，具有潜在的风险。
5.本发明采用脂质体作为基因递送载体，制备阳离子脂质体用于dna的载带和在细胞内表达。阳离子脂质体已用于体内或体外的基因转染，此类非病毒载体最早出现于20世纪80年代末，主要用于血管基因的转移。阳离子脂质体可自动、快速地与多聚阴离子如dna、mrna等相互作用，阳离子脂质体的体积较小，可以包裹较大的核酸片段，同源性也较高，与生物膜的脂质双分子层接触性良好，dna内容物可通过阳离子脂质体与生物膜的脂质双分子层之间的融合直接进入目标细胞。在阳离子脂质体介导的动脉血管基因转移的研究中，已建立了多种动物模型，如正常的和动脉粥样硬化的大鼠、兔、犬和猪等。结果表明，阳离子脂质体载体的一大显著优势即是其高安全性，经静脉或动脉给予阳离子脂质体引起机体的生化及血流动力学改变和心脏毒性反应均很轻微。另外，阳离子脂质体的制备也比较容易。
6.然而脂质体和基因本身靶向性差，对心脏组织无靶向选择性，因此以脂质体作为心肌组织的基因递送载体需考虑用配体进行修饰提高靶向性。
7.另外，用细胞穿膜肽tat和特异性心肌靶向肽pcm共同修饰的脂质体载药可以增强其心肌靶向性，所以本发明拟用细胞穿膜肽tat和特异性心肌靶向肽pcm共同修饰的脂质体搭载增强绿色荧光蛋白表达质粒构建基因递送系统，通过体外评价对此基因递送系统的心肌靶向性进行初步评价。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种具有心肌靶向性的基因递送载体，以解决了现有的问题：脂质体和基因本身靶向性差，对心脏组织无靶向选择性，因此以脂质体作为心肌组织的基因递送载体需考虑用配体进行修饰提高靶向性。
9.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
10.本发明为一种具有心肌靶向性的基因递送载体，所述递送载体包括空白载体与dna，其中，空白载体与dna的质量比例为25：1；
11.所述空白载体包括dotap、大豆卵磷脂、dope
‑
mpeg1000、胆固醇、tat 和pcm。
12.其中，所述tat和pcm分别占空白载体总脂质摩尔量的1％和3％；
13.所述dotap、大豆卵磷脂、dope
‑
mpeg1000、胆固醇的摩尔比为2:4:1:3。
14.上述的基因递送载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
15.称取一定量的dotap、大豆卵磷脂、dope
‑
mpeg1000、胆固醇，使其四者摩尔比满足上述的比例，并放置在茄形瓶内；
16.加入有机溶剂氯仿使其充分溶解，在旋转蒸发仪上抽成均匀的薄膜,真空干燥挥干有机溶剂后，向茄形瓶里加入pbs，并作用一段时间；
17.用探头超声在规定功率下作用相应时间后经pbs溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在特定温度下贮存备用；
18.精密称取一定量的tat和pcm，加水溶解备用；
19.取一定量的dope
‑
mpeg1000
‑
mal，使其与多肽的摩尔比均为1：12，用三氯甲烷溶解，于旋转蒸发仪上旋转抽成均匀的薄膜，分别加入tat和pcm 溶液制得胶束溶液；
20.分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育达到设定时间，透析过夜，分别得到tat和pcm修饰阳离子脂质体的1％tat
‑
lip和3％pcm
‑
lip，以及tat和pcm共同修饰的阳离子脂质体1％tat
‑
3％pcm
‑
lip；
21.将上述脂质体加入不同质量的质粒，用pbs稀释至相同体积，室温震荡孵育达到设定时间，即可制得本基因递送载体。
22.其中，向茄形瓶里加入pbs，并作用一段时间，为在37℃、120rpm水化条件下作用1h。
23.其中，用探头超声在规定功率下作用相应时间后经pbs溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在特定温度下贮存备用，主要包括，用探头超声在150w功率下作用7min后经pbs溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在4℃下贮存备用；
24.其中，加入tat和pcm溶液制得胶束溶液，主要包括，加入tat和pcm 溶液后在37℃恒温环境下震荡1h制得胶束溶液；
25.其中，分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育达到设定时间，透析过夜，主要包括，分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育3h，透析过夜；
26.其中，用pbs稀释至相同体积，室温震荡孵育达到设定时间，主要包括，用pbs稀释至相同体积，室温震荡孵育20min。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本发明采用生物相容性很好的脂质体作为基因递送载体的母体，克服了脂质体靶
向性差、基因递送效果差的缺点，引入了两种不同作用的多肽进行修饰，该基因递送系统在心肌细胞内具有较高的基因表达效率。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明空白脂质体对质粒搭载能力的测定示意图；
31.图2为本发明四种不同脂质体对质粒搭载能力的测定示意图；
32.图3为本发明不同的基因递送系统转染h9c2细胞后绿色荧光表达情况示意图；
33.图4为本发明不同脂质浓度的不同基因递送系统孵育后h9c2细胞的存活率示意图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本实施例公开了一种具有心肌靶向性的基因递送载体。
36.本发明的目的是提供一种具有心肌靶向性的基因递送载体，该载体为细胞穿膜肽tat和特异性心肌靶向肽pcm共同修饰的阳离子脂质体。
37.本发明的技术方案：
38.为实现上述目的，本发明的载体系统采用如下配方：
39.一种具有心肌靶向性的基因递送载体，其配方为：
40.dotap、大豆卵磷脂、dope
‑
mpeg1000、胆固醇摩尔比为2:4:1:3；
41.tat和pcm分别占总脂质摩尔量的1％和3％，此为空白载体。
42.空白载体与dna的比例为25：1(总脂质质量:dna质量)。
43.本发明载体系统的制备方法如下：
44.s1.精密称取一定量的dotap、大豆卵磷脂、dope
‑
mpeg1000、胆固醇，使其四者摩尔比为2:4:1:3，并放置在茄形瓶内；
45.s2.加入有机溶剂氯仿使脂质充分溶解后，在旋转蒸发仪上抽成均匀的薄膜,真空干燥挥干有机溶剂后，向茄形瓶里加入pbs，37℃、120rpm水化 1h；
46.s3.用探头超声(150w，7min)后pbs溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于4℃冰箱贮存备用；
47.s4.精密称取一定量的tat和pcm，加水溶解备用；
48.s5.取一定量的dope
‑
mpeg1000
‑
mal，使其与多肽的摩尔比均为1：12，用三氯甲烷溶解，于旋转蒸发仪上旋转抽成均匀的薄膜，分别加入tat和 pcm溶液于37℃恒温震荡1h即制得胶束溶液；
49.s6.分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育3h，透析过夜，分别得到tat和pcm修饰阳离子脂质体的 1％tat
‑
lip和3％pcm
‑
lip，以及tat和pcm共同修饰的阳离子脂质体 1％tat
‑
3％pcm
‑
lip；
50.s7.将上述脂质体加入不同质量的质粒，用pbs稀释至相同体积，室温震荡孵育20min，制得不同脂质体/dna比例的脂质体载质粒复合物，即得不同的基因递送载体。
51.参看说明书附图，为本发明的dna载带效率实验图：
52.其中图1为空白脂质体对质粒搭载能力的测定：
53.line1：dna marker 2000；line2:质粒+loading buffer；line3:质粒+0.1μllip；line4：质粒+0.5μllip；line5：质粒+1.0μllip；line6：质粒+2.0μllip；line7：质粒+5μllip；line8：质粒+10.0μllip
54.其中图2为四种不同脂质体对质粒搭载能力的测定：
55.line1：dna marker 2000；line2:质粒+loading buffer；line3:质粒+1μllip；line4：质粒+1μl1％tat
‑
lip；line5：质粒+1.0μ l3％pcm
‑
lip；line6：质粒+1.0μl1％tat
‑
3％
‑
pcm
‑
lip
56.综合上述两图可知，未连接多肽的脂质体与dna的在比例为25：1(总脂质质量:dna质量)时能将dna载带完全(见图1)，连接多肽的脂质体在此比例下也能将dna载带完全(见图2)。
57.另外，本技术人做了空白脂质体的粒径，pdi，电位的测定，结果如下表：
58.表1空白脂质体的粒径，pdi，电位的测定结果(n＝3，mean
±
sd)
[0059][0060]
本技术人同时做出了关于脂质体搭载质粒后的粒径，pdi，电位的测定，结果如下表：
[0061][0062]
由上述表1可知，不同的空白脂质体的粒径差别不大，pdi相当，zeta 电位接近0mv。由表2可知，而载带dna形成不同的基因递送系统后，粒径和pdi均有不同程度的增加，
而电位均有明显降低，均表明dna被成功载带，形成了基因递送系统。
[0063]
关于空白脂质体的稳定性，本技术人的测定结果如下：
[0064]
表3空白脂质体在4℃保存30天后的稳定性考察(n＝3，mean
±
sd)
[0065][0066]
由上述表3可知，制备好的不同空白脂质体在4℃冰箱放置一个月，在0天和30天后分别测其粒径pdi，可见经过30天的放置，粒径和pdi均未发生变化，空白脂质体的稳定性可以满足使用需求。
[0067]
另外，参看图3，为本技术的不同的基因递送系统转染h9c2细胞后绿色荧光表达情况图，具体为用egfp质粒作为报告基因制备不同的基因递送系统，观察它们介导所载基因在心肌细胞h9c2中的表达情况。可见，未连接多肽的普通脂质体的转染效率一般，单肽修饰的脂质体形成的基因递送系统表达效率高于普通脂质体，而双多肽修饰的脂质体形成的基因递送系统具有最高的表达效率，表面本发明所述的基因递送系统确实具有优越的心肌靶向性，能介导所载基因在心肌细胞中高效表达。
[0068]
参看图4，为不同脂质浓度的不同基因递送系统孵育后h9c2细胞的存活率(n＝3，mean
±
sd，***p＜0.001；*p＜0.05vs对照)。采用不同的基因递送系统分别以不同浓度与h9c2孵育，采用cck
‑
8细胞活力检测试剂盒检测细胞存活率。可见，随着脂质浓度的增加，不同基因递送系统的毒性均增加，具有剂量依赖性。不同的基因递送系统之间比较，在浓度较低时差别不大，在浓度较高时，多肽修饰的基因递送系统表现出了稍强的细胞毒性，提示该系统在应用时应注意使用浓度。
[0069]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0070]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明
的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。