一种从马棘中提取含有羽扇豆醇的草药组分的制备方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从马棘中提取羽扇豆醇的制备方法，及其用于抑制人乳腺癌mcf-7细胞的用途。


背景技术：

2.乳腺癌是乳腺腺体上皮组织中的恶性肿瘤，其在临床治疗的难度在于早期难以发现，待发现已是晚期，手术切除难以完全切除病灶，且大部分患者容易复发。化疗药物虽在乳腺癌的治疗中广泛应用，但其副作用及耐用性对患者的治疗进程及治疗效果带来的影响也不可忽视。因此，寻找毒性较低的治疗药物成为研究治疗的必然趋势。天然产物是抗肿瘤药物的重要来源，三萜化合物是植物体内重要的次生代谢产物，具有广泛的生物活性，其中五环三萜羽扇豆烷型对多种肿瘤细胞生长均表现出很强地抑制活性，同时由于毒性较低且作用机制独特，使其成为优秀的抗肿瘤先导化合物。
3.马棘为豆科多年生植物马棘indigofera pseudotinctoria matsum.的嫩枝。夏秋季采收。药材马棘(indigogera pseudotinctoria mats.)在《中华人民共和国药典》里没有收录，属于草药。为豆科木蓝属(indigogera)半灌木植物，以根或全株入药，又名铁扫帚、夜关门、一味药、马胡梢、野绿豆、一味草、野绿豆、马料梢、山皂角、野蓝枝子等。其株高60～150cm，总株花序腋生，花开后较叶长，花冠淡红色或紫红色，荚果线状圆柱形，种子长圆形，花期8～9月，果期11～12月；生于海拔100～1 300m的山坡林缘及灌木丛中，广泛分布于我国江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、陕西、四川、广西、贵州和云南等地。
4.【主要成分】胡泽华等报道，马棘枝叶中石油醚部分提取了6个成分:羽扇豆-20(29)-烯-3-酮、木栓酮、3，β-乙酰氧基－齐墩果-12-烯-11-酮、3β-羟基-5-烯－欧洲桤木烷醇、β-谷甾醇和正三十烷醇。
5.【性味归经】味苦、涩，性平。归肺、脾、胃经。
6.【功效主治】清热解表、散瘀消积的功效。主治感冒发热，疔疮、毒蛇咬伤等。
7.羽扇豆醇作为环三萜羽扇豆烷型具有重要的药理作用，研究证实，羽扇豆醇在抗氧化、抗炎及促进皮肤伤口愈合等方面发挥重要作用。同时，羽扇豆醇在一些恶性肿瘤中表现出较好的抗癌活性。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于一种工艺简单、生产成本低、提取效率高的从马棘中提取羽扇豆醇的制备方法。
9.本发明的另一目的在于提供该提取物用于抑制人乳腺癌mcf-7细胞的用途。
10.一种从马棘中提取含有羽扇豆醇的草药组分的制备方法：取马棘用10倍液料比的95％乙醇，浸提15天，烘干溶剂即得。
11.本发明的一种从马棘中提取含有羽扇豆醇的草药组分用于抑制人乳腺癌mcf-7细胞的用途。
12.本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明以马棘为原料,用有机溶剂对马棘进行提取，获得羽扇豆醇，其工艺简单、生产成本低、提取效率高，羽扇豆醇作为环三萜羽扇豆烷型具有重要的药理作用，本发明从马棘中分离提取羽扇豆醇并体外试验用于抑制人乳腺癌mcf-7细胞。为开发利用马棘天然活性物质开发新的抗乳腺癌药物提供了方法。
附图说明
13.图1为羽扇豆醇gc-ms出峰位置图。
具体实施方式
14.实施例
15.一种从马棘中提取含有羽扇豆醇的草药组分的制备方法：取马棘种子用10倍液料比的95％乙醇，浸提15天，烘干溶剂即得。
16.试验例
17.1材料与方法
18.1.1材料与仪器
19.马棘种子(遵义绿普森农业科技开发有限公司提供)；羽扇豆醇标准品(≥98.0％，成都普思生物科技股份有限公司)；lc-ms(ab sciex 4000q trap lc-ms/ms)；lc色谱柱(acclaimtm 120c18 4.6x150mm 5μm)；gc-ms(thermo scientific
tm isq
tm 7000单四极杆gc-ms)；gc色谱柱(tg-5ms 30m x 0.25mm x 0.25μm)；其他所用试剂均为分析级。
20.1.2单因素试验
21.选取溶剂与时间两个因素，进行马棘种子提取单因素试验，烘干溶剂得浸膏。通过lc-ms检测计算羽扇豆醇含量。
22.1.2.1lc-ms含量检测
23.标准品及样品制备：精密称取4.0mg样品，溶解于1ml甲醇中，超声溶解，过0.22μm滤膜，4℃保存备用。精密称取1.0mg标准品，溶解于1ml甲醇中，配成1mg/ml浓度，过0.22μm滤膜。并依次稀释至320μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml，4℃保存备用。
24.lc-ms条件：流动相：0.1％甲酸甲醇：0.1％甲酸水＝90：10、进样量：1μl、流速：0.8ml/min。羽扇豆醇的准确分子质量：426.4、母离子：453.2、子离子：435.4、dp：102、ce：32。
25.1.3正交试验
26.以单因素试验为基础，设计三因素三水平正交试验见表1，并进行全面试验。烘干样品后通过gc-ms检测分析羽扇豆醇最佳提取方案及影响。
27.表1羽扇豆醇浸提工艺因素水平表
28.[0029][0030]
1.3.1gc-ms成分检测
[0031]
标准品及样品制备：精密称取各样品20mg，溶于1ml乙醚中，震荡溶解后过0.45μm滤膜，4℃保存备用。精密称取1.0mg标准品，溶解于1ml乙醚中，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。
[0032]
gc-ms条件：根据唐超
[3]
试验方法稍作调整，初始温度40℃，保持1min，以30℃/min升温至260℃，保持1min，再以15℃/min升温至280℃，保持10min；气化室温度；离子源温度；进样口温度；载气为高纯度氦气；体积流量：1.0ml/min；离子化模式：ei；电子能量：；溶剂延迟：12min。质谱扫描范围：m/z 40-500。
[0033]
1.3.2羽扇豆醇定性及半定量分析
[0034]
通过lc-ms检测，对相同工艺提取的gc-ms检测结果峰面积进行等量代换，并对lc-ms检测的其他峰面积进行推导计算含量。(m:浸膏总重；y：称取重量)
[0035][0036][0037]
2结果与分析
[0038]
2.1lc-ms检测单因素分析
[0039]
lc-ms检测结果计算含量，见表2。羽扇豆醇在10倍液料比情况下比较溶剂与浸提时间两个因素。石油醚、浸提5天、10倍液料比情况下羽扇豆醇含量最高。
[0040]
表2单因素实验结果
[0041][0042]
2.2gc-ms检测正交试验分析
[0043]
2.2.1定性分析
[0044]
如图1所示羽扇豆醇标准品a(18.37)与样品b的保留时间大致相同，向样品中加入标准品后出峰时间c(18.29)稍有提前。
[0045]
2.2.2峰面积半定量
[0046]
根据gc-ms含量，等量代换相同工艺后，根据峰面积推导对应含量，比值r溶剂的不同有所差别，95％乙醇、乙酸乙酯、石油醚的比值分别为315.91、208.25、1305.83。根据比
值带入公式计算相应含量，其95％置信区间为(5189.11，10938.16)μg，并按羽扇豆醇含量从大到小的顺序排列，见表5。
[0047]
表5 gc-ms半定量推导含量
[0048][0049][0050]
(*：峰面积过低无法进行含量推算。)
[0051]
采用中位数检验，正交实验排除第27号工艺后，对剩下26份数据按照羽扇豆醇含量降序排列，其数据为偶数，则中位数选取最中间两个数据(即第13号和第14号)，求得其平均值，即中位数值为4503.655μg；工艺分别为95％乙醇、15天10倍液料比和95％乙醇10天5倍液料比。根据降序排列可以看出最大提取含量工艺为石油醚，5天、5倍液料比，最小值为95％乙醇、5天、5倍液料比。且羽扇豆醇含量的前25％基本均为石油醚作为溶剂所提取的工艺。
[0052]
2.3lc-ms与gc-ms对比
[0053]
普遍认为lc-ms更倾向于含量检测，在检测样品中其峰面积均高于gc-ms所检测峰面积。lc-ms与gc-ms在相同工艺下所测得的羽扇豆醇含量峰面积比值分别为95％乙醇(315.91)、乙酸乙酯(208.25)、石油醚(1305.83)。根据wilcoxon符号秩和检验峰面积p《0.05，认为两者在峰面积上具有统计学意义，峰面积间存在显著差异性。但通过相同工艺下峰面积代换计算含量，所得含量结果两工艺对比p》0.05，两者含量无统计学意义，认为两样
本数据没有差异。因此本实验可以采用峰面积代换方法计算gc-ms检测羽扇豆醇的含量，见表8、9。
[0054]
表8 lc-ms与gc-ms相同工艺下羽扇豆醇峰面积及含量
[0055][0056]
表9 lc-ms与gc-ms相同工艺检测结果wilcoxon符号秩和检验结果
[0057][0058]
根据单因素实验中采用95％乙醇提取，基本比乙酸乙酯作为溶剂提取率更高，且乙醇易回收，因此选取95％乙醇作为溶剂，在对比正交实验中，也同时与单因素实验结果相联系。综合考虑后得出马棘提取羽扇豆醇工艺为95％乙醇、15天、10倍液料比。
[0059]
3使用羽扇豆醇体外试验考察其对于乳腺癌的影响
[0060]
目的：羽扇豆醇(lupeol)对人乳腺癌mcf-7细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及wnt/β-catenin信号通路在其中的作用。
[0061]
方法：以人乳腺癌mcf-7细胞为研究模型，mtt法检测细胞活力，划痕实验检测细胞的迁移能力，transwell小室实验检测细胞的侵袭能力，蛋白印迹实验检测c-myc、β-catenin、cyclind1及mmp2蛋白表达水平。
[0062]
结果：(1)mtt结果显示，羽扇豆醇处理人乳腺癌mcf-7细胞24h和48h，其对人乳腺癌mcf-7细胞增殖具有一定的抑制能力(p《0.05)，且呈剂量依赖性。(2)划痕实验结果表明，与对照组相比，羽扇豆醇处理人乳腺癌mcf-7细胞24h，能明显降低人乳腺癌mcf-7细胞的迁移能力(p《0.05)。(3)transwell小室结果显示，与对照组相比，羽扇豆醇处理人乳腺癌mcf-7细胞24h，能明显降低人乳腺癌mcf-7细胞的侵袭能力(p《0.01)。(4)蛋白印迹结果显示，与对照组相比，羽扇豆醇处理人乳腺癌mcf-7细胞24h能明显下调c-myc、β-catenin、cyclind1及mmp2蛋白表达水平(p《0.05或p《0.01)，且呈剂量依赖关系。结论羽扇豆醇可能通过抑制wnt/β-catenin信号通路，从而抑制人乳腺癌mcf-7细胞增殖、迁移和侵袭。
[0063]
4使用羽扇豆醇体外试验摸索其对于乳腺癌产生影响的机制
[0064]
目的：羽扇豆醇(lupeol)对人乳腺癌mcf-7细胞增殖的作用及相关机制。
[0065]
方法：以人乳腺癌mcf-7细胞为研究模型，采用mtt法和细胞平板克隆形成实验检测不同浓度羽扇豆醇对人乳腺癌mcf-7细胞增殖的影响；采用倒置显微镜观察不同浓度羽扇豆醇对人乳腺癌mcf-7细胞形态学影响；为进一步检测丝裂原活化蛋白激酶(mapks)在羽扇豆醇抗人乳腺癌mcf-7细胞增殖中的作用，60mg/l羽扇豆醇分别联合细胞外信号调节激酶(erk1/2)通路抑制剂pd98059、jun n末端激酶(jnk)通路抑制剂sp600125和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mapk)通路抑制剂sb203580，mtt法检测细胞增殖情况；蛋白质免疫印迹(western blot)法检测不同浓度羽扇豆醇对mapks信号通路活化的影响，通过mapks抑制剂实验进一步证实抗增殖的分子机制。
[0066]
结果：mtt和细胞平板克隆形成实验结果显示，与对照组比较，羽扇豆醇能够抑制人乳腺癌mcf-7细胞增殖活力，而erk1/2、jnk、p38 mapk抑制剂组可明显缓解羽扇豆醇诱导的人乳腺癌mcf-7细胞活力下降；羽扇豆醇干预后可见明显的细胞形态改变；蛋白质免疫印迹结果表明，与对照组比较，人乳腺癌mcf-7细胞经不同浓度的羽扇豆醇处理后，磷酸化erk1/2(p-erk1/2)、磷酸化jnk(p-jnk)、磷酸化p38 mapk(p-p38 mapk)表达明显上调(p《0.05或p《0.01)，erk1/2、jnk、p38 mapk抑制剂组可明显降低羽扇豆醇上调的人乳腺癌mcf-7细胞p-erk1/2、p-jnk、p-p38 mapk蛋白表达，erk1/2、jnk和p38 mapk表达均未发现明显变化。结论：羽扇豆醇可抑制人乳腺癌mcf-7的增殖活力，且其作用机制可能与活化mapks信号通路有关。
[0067]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单的修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。