一种牡蛎壳肉酶解物及其在制备防治抑郁症的药物、食品或保健品中的应用的制作方法

1.本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种牡蛎壳肉酶解物及其在制备防治抑郁症的药物、食品或保健品中的应用。


背景技术：

2.抑郁症是一种情感障碍性精神疾病，主要表现为情绪低落、思维迟缓以及运动抑制，常伴有睡眠障碍、消化功能减弱、躯体不适、自责自罪，严重的甚至出现自残、自杀观念及行为，具有两高一难的治疗特点（发病率高、复发率高、治愈难）。抑郁症的持续或反复发作不但使患者的生存质量下降，工作能力和范围受限，而且增加了家庭和社会的沉重负担。随着社会经济发展、生活节奏加快以及生活压力增加，抑郁症已成为现代社会危害全人类身心健康的常见病，其发病率逐年攀升。据世界卫生组织 (wto) 最新统计分析，抑郁症是危害人类健康最严重的十大疾病之一，抑郁症的高发病率、致死率、致残率和疾病负担已引起社会的广泛重视。
3.现阶段用于治疗抑郁症的药物主要包括：单胺氧化酶抑制剂、单胺氧化酶再摄取抑制剂、三环类抗抑郁剂、5
‑ꢀ
羟色胺再摄取抑制剂、5
‑ꢀ
羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂等。但这些药物普遍存在起效慢、有效率低、药物依赖和毒副作用大、易复发、不良反应多等缺点，而且由于起效慢，长期使用引起体重增加，性功能障碍等副作用，导致患者依从性差，不能坚持服药。因此，研发高效、低毒及副作用小的防治抑郁症的药物已成为国际关注的课题。中医药典籍有使用中药治疗抑郁症的记载，且民间临床实践中使用中药治疗抑郁症疗效确切、安全性高；现有研究也表明，不少中药材的提取物或中药复方制剂都在抗抑郁方面具有一定的活性（如中药贯叶金丝桃的主要成分金丝桃素，具有一定的抗抑郁作用，已有临床治疗报道；又如申请号为201310117254.7的中国专利公开了一种防治抑郁症的药物组合物，该发明药物组合物通过发挥多靶点效应，疏肝解郁，调通心肾之功宏著，临床应用效果明显）；而且，中药具有副作用小、综合治疗能力强等优点，因此，开发高效低毒的抗抑郁中药制剂是当今临床亟需解决的重要问题。
4.牡蛎（ostrea gigas tnunb）俗称海蛎子、蚝等,是世界上第一大养殖贝类。牡蛎肉嫩味鲜，药食兼用，在我国已有几百年的历史。牡蛎肉中含有多种氨基酸、糖原、大量的活性微量元素及小分子化合物，牡蛎壳中含有大量碳酸钙并含有17种氨基酸、镁、铝、硅及氧化铁等, 具有敛阴，潜阳，止汗，涩精，化痰，软坚等作用，牡蛎作为一种优质的海产养殖贝类，不仅具有肉味鲜美的食用价值，而且其肉与壳均可入药，具有较高的药用价值。近年来，酶制剂在海洋贝类资源加工过程中得到了普遍的应用，贝类蛋白酶解工艺及其酶解物功效的研究不断进展，酶解技术已经成为海洋贝类蛋白资源高值化、资源化、生态化开发利用的重要手段。但是，如何借鉴和突破传统酶解技术与工艺，对海洋贝类资源的绿色高值化开发，仍是我国贝类资源综合利用中一个重要的研究领域。牡蛎具有治虚弱、解丹毒、降血压、滋阴壮阳、止渴等药用价值。在抗抑郁的药物方面也有采用牡蛎作为原料之一的相关文献报
道，如申请号为200510027086.8 的中国专利公开了一种桂枝甘草龙骨牡蛎制剂在制备防治抑郁症药物中的应用，该桂枝甘草龙骨牡蛎制剂由桂枝、甘草、龙骨和牡蛎组成，该发明通过对大鼠的急性应激反应和慢性应激反应实验及治疗抑郁症实例，表明桂枝甘草龙骨牡蛎制剂具有抗抑郁作用。但是，对于牡蛎壳肉酶解物，迄今为止，现有公开文献中尚未见有将牡蛎壳肉酶解物用于治疗抑郁症及其引起的相关疾病的相关报道。因此，如何将牡蛎壳肉酶解物扩大化使用，使之产生最大的功效，发挥出应有的效能，至今仍是医学医药研究的主攻方向。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种牡蛎壳肉酶解物及其在制备防治抑郁症的药物、食品或保健品中的应用，所述的牡蛎壳肉酶解物为采用牡蛎科动物牡蛎及其近缘动物的全体，经过特定工艺提取得到的酶解物，本发明首次发现牡蛎壳肉酶解物具有明显的抗抑郁活性，抗抑郁效果好，具有制备预防或治疗抑郁症及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，且药物制剂的制备方法简单，成本低，成药经济效益好。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种牡蛎壳肉酶解物，所述的牡蛎壳肉酶解物为采用牡蛎科(ostreae)动物牡蛎(ostreagigastnunb)及其近缘动物的全体，经过特定工艺提取得到的酶解物，其具体的提取方法步骤如下：（1）牡蛎壳肉分离洗净；（2）按重量比牡蛎肉:牡蛎壳为1:4～5的比例将牡蛎肉和牡蛎壳混合，然后置于90～95℃的水中汆烫7～10min；用胶体磨将牡蛎肉和牡蛎壳研磨至200～500μm，得到研磨液；（3）在研磨液中加入蛋白酶、纤维素酶和葡糖酸内酯进行酶解；所述蛋白酶的规格为30000u/g～50000 u/g，加入量为底物质量的0.5%～1.5%；纤维素酶的规格为10000u/g，加入量为底物质量的0.2%～0.6%；葡糖酸内酯酶的加入量为底物质量的0.1%～0.3%；酶解温度为40℃～42℃，酶解时间为2～4h；酶解之后升温至100℃保持15min灭酶；过滤去除不溶性成分，得到牡蛎壳肉酶解溶液；（4）将所述牡蛎壳肉酶解溶液通过膜，截留分子量范围在1000～2000道尔顿（8～15肽）；（5）然后将牡蛎壳肉酶解溶液浓缩至含固量为10%～20%，喷雾干燥，即得到牡蛎壳肉酶解物。
7.上述的牡蛎壳肉酶解物，其提取方法中所用到的蛋白酶为酸性蛋白酶、复合酸性蛋白酶中的任意一种。
8.本发明的另一目的在于，提供所述的牡蛎壳肉酶解物在制备防治抑郁症的药物、食品或保健品中的应用。
9.所述的牡蛎壳肉酶解物在用于制备防治抑郁症的药物时，在所述的牡蛎壳肉酶解物中选择性添加常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的用于防治抑郁症及其相关疾病的药物制剂。
10.所述的制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。
11.所述的常规辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇
‑
4000、聚乙
二醇
‑
6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素或交联聚维酮中一种以上。
12.本发明的有益效果是：1、本发明提供了一种牡蛎壳肉酶解物及其提取方法，并首次发现牡蛎壳肉酶解物具有明显的抗抑郁活性，抗抑郁效果好，可将其加入到食品或保健品中起到预防抑郁症的作用；同时，可以将牡蛎壳肉酶解物制备成预防或治疗抑郁症及其相关疾病的药物制剂，为开发抗抑郁症创新药物提供新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。
13.2、本发明的牡蛎壳肉酶解物提取方法简单、成本低、污染小，有利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。
14.3、本发明分别通过悬尾实验 (tail suspension test，tst)和强迫游泳实验(forced swimming，fst)研究了牡蛎壳肉酶解物对小鼠悬尾和强迫游泳的影响，以及通过研究牡蛎壳肉酶解物 对利血平诱导的抑郁症大鼠行为学、血清和前额皮层中神经递质及炎症因子的影响等，有力证明了本发明的牡蛎壳肉酶解物在抑郁症状上具有明显的抗抑郁活性，可用于制备防治抑郁症的药物、食品或保健品。
15.4、本发明提供的牡蛎壳肉酶解物还具有补肺益肾、助阳益精、纳气定喘等功效，可用于肺气不足、阳痿遗精、虚喘气促、劳嗽咳血等症，可以在用于预防或治疗抑郁症的同时起到治疗其他合并症的效果。
16.5、本发明提供的牡蛎壳肉酶解物可以与其他药材进行配伍组成复方药用于预防或治疗抑郁症，还可以将牡蛎壳肉酶解物与辅料混合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂等，这些制剂不仅制备方法简单，成本低，而且较为方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。
具体实施方式
17.为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
18.实施例1一种牡蛎壳肉酶解物的提取方法，步骤如下：（1）牡蛎壳肉分离洗净；（2）按重量比牡蛎肉:牡蛎壳为1:4.5的比例将牡蛎肉和牡蛎壳混合，然后置于90℃的水中汆烫7min；用胶体磨将牡蛎肉和牡蛎壳研磨至300μm，得到研磨液；（3）在研磨液中加入酸性蛋白酶、纤维素酶和葡糖酸内酯进行酶解；所述酸性蛋白酶的规格为50000 u/g，加入量为底物质量的1.0%；纤维素酶的规格为10000u/g，加入量为底物质量的0.3%；葡糖酸内酯酶的加入量为底物质量的0.2%；酶解温度为40℃～42℃，酶解时间为3h；酶解之后升温至100℃保持15min灭酶；过滤去除不溶性成分，得到牡蛎壳肉酶解溶液；（4）将所述牡蛎壳肉酶解溶液通过膜，截留分子量范围在1000道尔顿；（5）然后将牡蛎壳肉酶解溶液浓缩至含固量为15%，喷雾干燥，即得到牡蛎壳肉酶解物。
19.另以牡蛎肉同法酶解，获得牡蛎肉酶解物。
20.实施例2一种牡蛎壳肉酶解物的提取方法，步骤如下：
（1）牡蛎壳肉分离洗净；（2）按重量比牡蛎肉:牡蛎壳为1:4的比例将牡蛎肉和牡蛎壳混合，然后置于95℃的水中汆烫8min；用胶体磨将牡蛎肉和牡蛎壳研磨至400μm，得到研磨液；（3）在研磨液中加入复合酸性蛋白酶、纤维素酶和葡糖酸内酯进行酶解；所述复合酸性蛋白酶的规格为30000u/g，加入量为底物质量的1.5%；纤维素酶的规格为10000u/g，加入量为底物质量的0.2%；葡糖酸内酯酶的加入量为底物质量的0.2%；酶解温度为40℃～42℃，酶解时间为2h；酶解之后升温至100℃保持15min灭酶；过滤去除不溶性成分，得到牡蛎壳肉酶解溶液；（4）将所述牡蛎壳肉酶解溶液通过膜，截留分子量范围在1500道尔顿；（5）然后将牡蛎壳肉酶解溶液浓缩至含固量为10%，喷雾干燥，即得到牡蛎壳肉酶解物。
21.实施例3一种牡蛎壳肉酶解物的提取方法，步骤如下：（1）牡蛎壳肉分离洗净；（2）按重量比牡蛎肉:牡蛎壳为1:4.2的比例将牡蛎肉和牡蛎壳混合，然后置于90～95℃的水中汆烫10min；用胶体磨将牡蛎肉和牡蛎壳研磨至200μm，得到研磨液；（3）在研磨液中加入酸性蛋白酶、纤维素酶和葡糖酸内酯进行酶解；所述酸性蛋白酶的规格为40000 u/g，加入量为底物质量的0.9%；纤维素酶的规格为10000u/g，加入量为底物质量的0.5%；葡糖酸内酯酶的加入量为底物质量的0.1%；酶解温度为40℃～42℃，酶解时间为3.5h；酶解之后升温至100℃保持15min灭酶；过滤去除不溶性成分，得到牡蛎壳肉酶解溶液；（4）将所述牡蛎壳肉酶解溶液通过膜，截留分子量范围在2000道尔顿；（5）然后将牡蛎壳肉酶解溶液浓缩至含固量为20%，喷雾干燥，即得到牡蛎壳肉酶解物。
22.实施例4一种牡蛎壳肉酶解物的提取方法，步骤如下：（1）牡蛎壳肉分离洗净；（2）按重量比牡蛎肉:牡蛎壳为1:5的比例将牡蛎肉和牡蛎壳混合，然后置于90～95℃的水中汆烫9min；用胶体磨将牡蛎肉和牡蛎壳研磨至500μm，得到研磨液；（3）在研磨液中加入酸性蛋白酶、纤维素酶和葡糖酸内酯进行酶解；所述酸性蛋白酶的规格为50000 u/g，加入量为底物质量的0.5%；纤维素酶的规格为10000u/g，加入量为底物质量的0.6%；葡糖酸内酯酶的加入量为底物质量的0.3%；酶解温度为40℃～42℃，酶解时间为4h；酶解之后升温至100℃保持15min灭酶；过滤去除不溶性成分，得到牡蛎壳肉酶解溶液；（4）将所述牡蛎壳肉酶解溶液通过膜，截留分子量范围在1000～2000道尔顿（8～15肽）；（5）然后将牡蛎壳肉酶解溶液浓缩至含固量为10%～20%，喷雾干燥，即得到牡蛎壳肉酶解物。
23.实施例5 牡蛎壳肉酶解物片剂的制备
【处方】由实施例1的方法制得的牡蛎壳肉酶解物（取相当于含牡蛎鲜肉5kg的量）、干淀粉550g；【制备方法】将所得的牡蛎壳肉酶解物、干淀粉混匀，加入适量羧甲基纤维素钠、滑石粉，制成颗粒，干燥，压制成1000片，所得的牡蛎壳肉酶解物片，每片含牡蛎壳肉酶解物（相当于含牡蛎鲜肉5g的量）。
24.以上所述的干淀粉、羧甲基纤维素钠和滑石粉均可在市场上购买得到。
25.实施例6 牡蛎壳肉酶解物胶囊的制备【处方】由实施例1的方法制得的牡蛎壳肉酶解物（取相当于含牡蛎鲜肉5kg的量）、干淀粉550g；【制备方法】将所得的牡蛎壳肉酶解物、干淀粉混匀，加入适量羧甲基纤维素钠、滑石粉，制成颗粒，干燥，分装成1000 粒，所得的牡蛎壳肉酶解物胶囊，每片含牡蛎壳肉酶解物（相当于含牡蛎鲜肉5g的量）。
26.以上所述的干淀粉、羧甲基纤维素钠和滑石粉均可在市场上售得到。
27.实施例7 牡蛎壳肉酶解物颗粒剂的制备【处方】由实施例1的方法制得的牡蛎壳肉酶解物（取相当于含牡蛎鲜肉5kg的量）、干淀粉550g；【制备方法】将所得的牡蛎壳肉酶解物、干淀粉混匀，加入适量羧甲基纤维素钠、滑石粉，制成颗粒，干燥，分装成1000袋，所得的牡蛎壳肉酶解物颗粒，每袋含牡蛎壳肉酶解物（相当于含牡蛎鲜肉5g的量）。
28.以上所述的干淀粉、羧甲基纤维素钠和滑石粉均可在市场上购买得到。
29.药性试验为了验证本发明牡蛎壳肉酶解物的抗抑郁活性，发明人进行了以下试验：1、牡蛎壳肉酶解物对小鼠悬尾的影响供试品：所述牡蛎壳肉酶解物和牡蛎肉酶解物均是由实施例1中所述方法制备而成。
30.处理方法：采用雄性昆明小鼠，体重18
‑
22g，每组10只。分别设置对照组，阳性组（氟西汀10 mg.kg
‑1），牡蛎壳肉酶解物高、中、低剂量组（分别相当于含牡蛎鲜肉12、6、3g.kg
‑1）；牡蛎肉酶解物高、中、低剂量组（分别相当于含牡蛎鲜肉12、6、3g.kg
‑1）。对照组给予等量的蒸馏水，各组均连续灌胃给药10d，末次给药1h后测试。将单个小鼠在距尾尖部约2cm处用医用胶布固定在悬尾箱（长30cm
×
宽30cm
×
高25cm）上部支架上，使其成倒挂状态，头部离箱底约5cm。悬挂6 min，记录后4 min内累计不动的时间（不动状态即小鼠停止挣扎不动或无任何活动）。
31.结果：如表1所示，与对照组相比，灌胃给予牡蛎壳肉酶解物10d后，高、中、低剂量组均可显著缩短小鼠悬尾不动时间，差异有统计学意义（*p＜0.05）。和牡蛎肉酶解物中剂量组比较，牡蛎肉壳酶解物中剂量组的悬尾不动时间显著降低，比较有统计学意义（p＜0.05）。
32.2、牡蛎壳肉酶解物对小鼠强迫游泳的影响供试品：所述牡蛎壳肉酶解物和牡蛎肉酶解物均是由实施例1中所述方法制备而成。
33.处理方法：采用雄性昆明小鼠，体重18
‑
22 g，每组10只。分别设置对照组，阳性组（氟西汀10mg.kg
‑1），牡蛎壳肉酶解物高、中、低剂量组（分别相当于含牡蛎鲜肉12、6、3g.kg
‑1），牡蛎肉酶解物高、中、低剂量组（分别相当于含牡蛎鲜肉12、6、3g.kg
‑1）。对照组给予等量的蒸馏水，各组均连续灌胃给药10d，末次给药1h后测试。将小鼠单独放入缸内水深 10cm的圆柱形玻璃缸中（高20cm、直径14cm），水温 25℃
±
2℃，从小鼠进入水面后计时6min，记录后4min内游泳累计不动的时间（指小鼠在水中停止挣扎或显示漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面）。
34.结果：如表2所示，与对照组相比，灌胃给予牡蛎壳肉酶解物10d后，高、中剂量组均可显著缩短小鼠游泳不动时间（*p＜0.05）。和牡蛎肉酶解物中剂量组比较，牡蛎肉壳酶解物中剂量组的游泳不动时间显著降低，比较有统计学意义（p＜0.05）。
35.3、牡蛎壳肉酶解物对利血平引起的抑郁症大鼠的影响供试品：所述牡蛎壳肉酶解物和牡蛎肉酶解物均是由实施例1中所述方法制备而成。
36.处理方法：采用雄性sd大鼠，体重180
‑
220g，喂养适应1周后，按空腹体重随机分组，每组10只。分别设置对照组、模型组、阳性组、牡蛎壳肉酶解物高、中、低剂量组（分别相当于含牡蛎鲜肉12、6、3g.kg
‑1），牡蛎肉酶解物高、中、低剂量组（分别相当于含牡蛎鲜肉12、6、3g.kg
‑1）。对照组大鼠每天腹腔注射生理盐水0.5ml.kg
‑1，其余各组大鼠每天腹腔注射利血平0.5mg.kg
‑1造模，连续注射10天；自第一天开始造膜后开始，注射完生理盐水或利血平后按照以下给药方式灌胃给药：阳性组给予氟西汀1.8mg.kg
‑1，牡蛎壳肉酶解物高剂量组给予相当于牡蛎12g.kg
‑1，牡蛎壳肉酶解物中剂量组给予相当于牡蛎6g.kg
‑1，对照组、模型组给予同等体积的蒸馏水，每天1次。
37.自造模后，每天观察各组大鼠行为学情况：记录各组大鼠上睑下垂、运动抑制等情况。上睑下垂观察时，将大鼠放在支架上，观察大鼠眼睑不能睁开1/2的动物只数，计算对抗率，对抗率=(1
‑
上睑下垂大鼠／组内动物总数)
×
100％；运动抑制观察时，将动物放于直径40cm的圆形白板的中心位置观察30s，观察不同组中大鼠呆在圈内的时间。
38.末次给药后1h，于大鼠腹主动脉取血，离心取血清，检测血清中5
‑
ht、da、mao、il
‑
6、tnf
‑
α的水平，观察牡蛎壳肉酶解物对利血平诱导大鼠抑郁症血清神经递质及炎症因子的影响。取大脑前额皮层，匀浆，离心取上清，检测前额皮层中mao、il
‑
6、 tnf
‑
α的水平，观察牡蛎壳肉酶解物对利血平诱导大鼠抑郁症前额皮层中神经递质及炎症因子的影响。
39.结果：（1）牡蛎壳肉酶解物对利血平诱导的抑郁症大鼠行为学的影响如表3所示，造模后第4天，对照组大鼠没有眼睑下垂现象；模型组有9只大鼠出现眼睑下垂，与对照组相比其对抗率差异有统计学意义（#p＜0.01）；牡蛎壳肉酶解物高剂量组出现3只大鼠眼睑下垂、低剂量组出现6只大鼠眼睑下垂，与模型组相比其对抗率均有所升高。如表4所示，造模后第4天，与对照组相比，模型组大鼠在圈内保留时间显著增加（*p＜0.05）；与模型组相比，牡蛎壳肉酶解物高、低剂量组在圈内保留时间显著减少（*p＜0.05）。
40.（2）牡蛎壳肉酶解物对利血平诱导的抑郁症大鼠血清神经递质及炎症因子的影响如表5所示，与对照组相比，模型组大鼠血清中5
‑
ht、da的水平明显降低（*p＜0.05）。与模型组相比，牡蛎壳肉酶解物高、中剂量组大鼠血清中5
‑
ht的水平明显升高（*p＜0.05）；牡蛎壳肉酶解物高、中剂量组大鼠血清中da的水平明显升高（*p＜0.05），低剂量组没有显著性差异。与对照组相比，模型组大鼠血清中mao、il
‑
6的水平明显升高（#p＜0.05）。与模型组相比，牡蛎壳肉酶解物高、中剂量组大鼠血清中mao、il
‑
6的水平明显降低（*p＜0.05）。和牡蛎肉酶解物中剂量组比较，牡蛎壳肉酶解物中剂量组的血清5
‑
ht、da显著增高，比较有统计学意义（p＜0.05）。
41.