一种具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用

1.本发明涉及生物制剂技术领域，具体为一种具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用。


背景技术：

2.我国的葡萄产量处于世界领先水平，随着葡萄加工产业的迅猛发展，葡萄废弃物的产生也越来越多。目前这些废弃物部分用于生产肥料、活性碳、沼气原料等低价值产品，多数则直接将其作为垃圾处理。然而葡萄籽中不仅含有丰富的维生素、氨基酸及矿物质等营养物质，更含量大量的原花青素；而且从葡萄籽中提取的原花青素具有强抗氧化性，能够高效清除自由基，其能力是维生素c的20倍。因此合理提取并利用葡萄籽中的原花青素具有重要的经济价值和实践意义。
3.原花青素(pc)是由黄烷
‑3‑
醇单体聚合而成不同聚合度的黄酮类物质。植物粗提取的原花青素大部分为聚合度大于5的高聚体。目前葡萄籽提取物是工业制备原花青素的最主要来源，葡萄中的pc大部分存在于葡萄籽的外珠被，与细胞基质中的蛋白质、纤维素、半纤维素、木质素等连接。葡萄籽原花青素(gspc)中聚合度>5的原花青素高聚体(ppc)占比为50％，而原花青素单体 (mpc)和二聚体等占比总共不到10％。ppc难以透过生物膜，生物利用度很低，且大量的ppc在肠道累积会刺激肠道，诱发肠道上皮炎症反应，对机体健康产生损害。因此，获得低聚合度的原花青素有助于提高其在机体内利用率，增强抗氧化性能。
4.氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(ros)和活性氮自由基(rns)产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。在氧化应激过程中，由于受到自由基的氧化胁迫，构成细胞组织的各种物质如脂质、糖类、蛋白质、脱氧核糖核酸(dna)等所有的大分子物质，都会发生各种程度的氧化反应，引起变性、交联、断裂等氧化损伤，进而导致细胞结构和功能的破坏以及机体组织的损伤和器官的病变。研究表明，肝脏的氧化应激是脂肪肝、肝硬化和肝癌等疾病的共同特征，且缓解氧化应激有助于上述疾病的恢复。因此，寻找高效的抗氧化制剂对于防治氧化应激引发的肝损伤类疾病具有重要意义。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用，具备防治氧化应激引发的肝损伤类疾病的优点，有效缓解了由于氧化应激导致机体受到损伤的问题。
7.(二)技术方案
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用，由葡萄籽原花青素粉、发酵培养基以及复合菌液发酵制备制成；
9.所述复合菌液由酿酒酵母h2和发酵乳杆菌o混合制成，且酿酒酵母h2 和发酵乳杆
菌o的添加比例为2:3；
10.所述发酵培养基由以下组分构成：葡萄糖26
‑
27重量份、蛋白胨10
‑
11 重量份、酵母浸粉4
‑
5重量份、磷酸氢二钾1
‑
2重量份、柠檬酸铵1
‑
2重量份、硫酸镁0.1
‑
0.3重量份，水950
‑
1000重量份；
11.还包括以下步骤：
12.s1、制备复合菌液：将组成复合菌液的菌种分别进行复苏及复壮培养后，用生理盐水分别将菌液调节至1麦氏比浊管的比浊度，之后将酵母菌和乳酸菌按体积2:3的接种比混合后即为复合菌液；
13.s2、混合发酵：将葡萄籽原花青素、复合菌液和发酵培养基混合加入发酵罐进行发酵，其中，葡萄籽原花青素添加量为40
‑
60重量份、复合菌液的接种量为20
‑
30体积份，发酵温度38
‑
40℃，搅拌转速为110
‑
130r/min，ph 为5.5
‑
6.5，发酵时间为18
‑
22h，发酵结束产物即为微生态制剂。
14.优选的，所述步骤s1中菌种在进行发酵培养之前，进行菌种的活化复壮，复壮培养基成分由以下组分制成：葡萄糖18
‑
22重量份、蛋白胨10
‑
12重量份、酵母浸粉4
‑
6重量份、牛肉浸粉6
‑
8重量份、磷酸氢二钾2
‑
4重量份、柠檬酸铵2
‑
4重量份、醋酸钠3
‑
5重量份、硫酸锰0.02
‑
0.04重量份、硫酸镁0.2
‑
0.4重量份、吐温80 1
‑
2重量份，二馏水950
‑
1000重量份。
15.优选的，所述葡萄籽原花青素的纯度为80
‑
90％、平均聚合度为6.5
‑
8.8。
16.(三)有益效果
17.与现有技术相比，本发明提供了一种具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用，具备以下有益效果：
18.1、该具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用，通过选用成本低的粗提商品化葡萄籽原花青素粉末，其杂质及聚合度均偏高，通过联合发酵可将原花青素的平均聚合度降低并稳定地溶解于复合菌液中，使制剂成分能够被机体吸收与利用从而防治肝损伤。
19.2、该具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用，通过采用原花青素与复合菌液的联合发酵提高复合菌液中酿酒酵母h2和发酵乳杆菌o生长速率，缩短两菌种进入生长稳定期的时间，加快制剂的制备效率，同时，原花青素对于胃肠道常见致病菌具有抑制作用，能够帮助复合益生菌在胃肠道定植生长，维持胃肠道菌群稳态、促进营养消化吸收、增强机体免疫力和抗病能力。
附图说明
20.图1为本发明中酿酒酵母h2在原花青素添加的液体培养基中(酿酒酵母 h2+)和未添加原花青素的液体培养基(酿酒酵母h2)中的生长曲线图；
21.图2为本发明中发酵乳杆菌o在原花青素添加的液体培养基中(发酵乳杆菌o+)和未添加原花青素的液体培养基(发酵乳杆菌o)中的生长曲线图；
22.图3为本发明中空白培养基组、复合菌液组、原花青素培养基组、微生态制剂对于dpph自由基清除率(％)检测图；
23.图4为本发明中空白培养基组、复合菌液组、原花青素培养基组、微生态制剂对于abts自由基清除率(％)检测图；
24.图5为本发明中微生态制剂预防急性肝损伤试验中小鼠肝脏剖检表观图；
25.图6为本发明中空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂预防组小鼠肝脏组织中sod和gsh
‑
px的活性(单位u/mgprot表示在1mg组织蛋白中酶的活性)；
26.图7为本发明中微生态制剂预防急性肝损伤试验肝脏切片he染色结果；
27.图8为本发明中微生态制剂治疗急性肝损伤试验中小鼠肝脏剖检表观图；
28.图9为本发明中微生态制剂治疗急性肝损伤试验中小鼠肝脏sod和 gsh
‑
px的酶活图；
29.图10为本发明中微生态制剂治疗急性肝损伤试验中小鼠肝脏切片he染色结果。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.本发明提供了一种具有肝损伤保护作用的微生态制剂的制备和应用，由葡萄籽原花青素粉、发酵培养基以及复合菌液发酵制备制成；
32.所述复合菌液由酿酒酵母h2和发酵乳杆菌o混合制成，且酿酒酵母h2 和发酵乳杆菌o的添加比例为2:3；
33.所述发酵培养基由以下组分构成：葡萄糖26
‑
27重量份、蛋白胨10
‑
11 重量份、酵母浸粉4
‑
5重量份、磷酸氢二钾1
‑
2重量份、柠檬酸铵1
‑
2重量份、硫酸镁0.1
‑
0.3重量份，水950
‑
1000重量份；
34.还包括以下步骤：
35.s1、制备复合菌液：将组成复合菌液的菌种分别进行复苏及复壮培养后，用生理盐水分别将菌液调节至1麦氏比浊管的比浊度，之后将酵母菌和乳酸菌按体积2:3的接种比混合后即为复合菌液；
36.s2、混合发酵：将葡萄籽原花青素、复合菌液和发酵培养基混合加入发酵罐进行发酵，其中，葡萄籽原花青素添加量为40
‑
60重量份、复合菌液的接种量为20
‑
30体积份，发酵温度38
‑
40℃，搅拌转速为110
‑
130r/min，ph 为5.5
‑
6.5，发酵时间为18
‑
22h，发酵结束产物即为微生态制剂。
37.实施例如下：
38.第一步菌种的复苏和传代
39.将cgmcc测序鉴定优选的酿酒酵母和发酵乳杆菌，使用复壮培养基进行复苏传代使其恢复活性。复壮培养基成分由以下组分制成：葡萄糖18
‑
22重量份、蛋白胨10
‑
12重量份、酵母浸粉4
‑
6重量份、牛肉浸粉6
‑
8重量份、磷酸氢二钾2
‑
4重量份、柠檬酸铵2
‑
4重量份、醋酸钠3
‑
5重量份、硫酸锰 0.02
‑
0.04重量份、硫酸镁0.2
‑
0.4重量份、吐温80 1
‑
2重量份，二馏水 950
‑
1000重量份。
40.第二步发酵培养基成分和发酵条件的优化
41.发酵培养基的制备，优化的培养基成分为葡萄糖26
‑
27重量份、蛋白胨 10
‑
11重量份、酵母浸粉4
‑
5重量份、磷酸氢二钾1
‑
2重量份、柠檬酸铵1
‑
2 重量份、硫酸镁0.1
‑
0.3重量
份、水950
‑
1000重量份。
42.第三步复合发酵
43.将葡萄籽原花青素添加量为40
‑
60重量份、复合菌液的接种量为20
‑
30 体积份，发酵温度38
‑
40℃，搅拌转速为110
‑
130r/min，ph为5.5
‑
6.5，发酵时间为18
‑
22h，发酵结束产物即为微生态制剂。
44.第四步安全性试验
45.采用本发明提供的微生态制剂对昆明鼠进行急性毒性试验，试验选取12 只雌雄各半，体重为20
‑
25g昆明鼠，随机分为两组，灌胃前16h禁食，对照组一次经口灌胃50μl/g生理盐水，实验组一次经口灌服50μl/g的微生态制剂，之后正常饮食观察14天，记录小鼠出现的中毒症状及存活情况，并在14天后摘除小鼠眼球采血进行血清生化指标包括血糖(glu)、谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、肌酐(cr)、乳酸脱氢酶(ldh)的测定，断颈处理后进行剖检及肝重比的称量。
46.为配合上述实验，现提供以下数据支持：
47.数据一：
48.表1急性毒性实验小鼠体况指标和血液生化指标
[0049][0050]
结果表示为平均数
±
标准误(样本数＝6)。
[0051]
小鼠经口急性毒性试验过程中，受试小鼠观察期间均无中毒症状，无小鼠死亡，剖检小鼠各脏器观察均无明显改变，由表1可知，实验组小鼠体重、肝重及肝重体重比均未受到影响，动物生长发育正常，小鼠血清中glu、ast、 alt、cr、ldh指标差异无统计学意义(p>0.05)，说明本发明对正常小鼠无毒副作用。
[0052]
数据二：
[0053]
采用本发明提供的微生态制剂对昆明鼠进行亚慢性毒性试验，试验选取 24只雌雄各半的昆明白鼠，体重为20
‑
25g，随机分为4组，即对照组(灌服 12.5μl/g生理盐水)、微生态制剂灌胃的低(12.5μl/g)、中(25μl/g)、高(37.5μl/g)剂量试验组，试验期间每日每组
小鼠灌胃对应剂量的微生态制剂，连续28d，每天观察小鼠活动状态、体征、摄食量、饮水及粪便状况， 28d后，将小鼠禁食12h，进行称重记录，摘除小鼠眼球采血进行血清生化指标包括glu、ast、alt、cr、ldh的测定，断颈处理后进行剖检及肝脏的称量。
[0054]
表2亚慢性毒性小鼠体况指标和血液生化指标
[0055][0056]
结果表示为平均数
±
标准误(样本数＝6)，肩标*表示对照组与实验组的比较，*，p<0.05。
[0057]
在整个小鼠经亚慢性毒性试验过程中，受试小鼠观察期间均无中毒症状，无小鼠死亡，剖检小鼠各脏器观察均无明显改变，由表2可知，实验组小鼠在灌胃28天后体重显著增加(p<0.05)，肝重及肝重体重比均未受到影响，动物生长发育正常，小鼠血清中glu、ast、alt、cr、ldh指标差异无统计学意义(p>0.05)，说明本制剂具有良好的安全性。
[0058]
第五步有效性试验
[0059]
微生态制剂对1,1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼(dpph)、2,2'
‑
联氮
‑
双
‑3‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸(abts)两种自由基清除能力试验。
[0060]
自由基清除实验中，为排除葡萄籽原花青素粗提物杂质导致的浓度误差，制备制剂时使用分析纯pc进行自由基清除能力验证，两种试验均分为四组： 1)仅含培养基的对照组；2)添加分析纯pc的液体培养基组(分析纯pc的添加量等同于微生态制剂组pc含量)；3)仅含酿酒酵母和发酵乳杆菌的复合菌液组；4)微生态制剂组，实验分别使用dpph、abts自由基清除检测试剂盒进行检测，所得结果见图3和图4。
[0061]
体外自由基清除实验表明微生态制剂组的自由基清除能力显著高于复合菌液组和单独添加原花青素组(p<0.05)，说明本制剂能够显著提高原花青素对于自由基的清除能力。
[0062]
数据三：
[0063]
微生态制剂对小鼠肝损伤的预防作用
[0064]
本实验利用ccl4作为肝损伤的诱导剂，试验选取18只雌雄各半的昆明白鼠，体重为20
‑
25g的昆明鼠，随机分为空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂预防组，每组小鼠雌雄各半，微生态制剂预防组以20μl/g的体积连续7d 灌服微生态制剂，空白对照组和ccl4模型组以20μl/g的体积连续7d灌服生理盐水，灌胃完毕，空白对照组腹腔注射10μl/g体积的生理盐水，ccl4模型组、微生态制剂预防组腹腔注射10μl/g体积的浓度为0.2％的ccl4豆油溶液，禁食、不禁水16h，摘眼球取血，静置1h，以转速3 000r/min 离心10min，采集血清，进行
血清生化指标包括glu、ast、alt、cr、ldh的测定，断颈处理后进行剖检及肝脏重量的称量。
[0065]
将采完血样的小鼠断颈处死进行剖检，图5为试验小鼠的肝脏表观形态剖检图，(a)空白对照组；(b)ccl4模型组；(c)微生态制剂预防组，空白对照组肝脏表观正常，无病理变化，ccl4模型组可见肝脏表面有大量坏死灶，与 ccl4模型组相比，微生态制剂预防组小鼠的肝脏坏死灶数量减少，仅沿肝叶边缘出现零星坏死灶，经计数，ccl4模型组小鼠肝脏表面坏死灶数量为10.67
±ꢀ
2.34(n＝6)，微生态制剂预防组小鼠肝脏表面坏死灶数量为6.72
±
1.06 (n＝6)，微生态制剂预防组小鼠肝脏表面坏死灶数量相较ccl4模型组显著降低 (p<0.05)。
[0066]
表3微生态制剂预防急性肝损伤试验小鼠体征状况和血液生化指标
[0067][0068]
结果表示为平均数
±
标准误(样本数＝6)，每行中数据相同肩标表示两组数据差异不显著，p<0.05。
[0069]
由表3可知，与空白对照组相比，ccl4模型组小鼠肝重及肝重体重比显著增加(p<0.05)，alt、ast和ldh活性显著升高(p<0.05)，表明小鼠肝脏发生急性肝损伤；cr水平显著升高(p<0.05)，表明肾脏功能受损，微生态制剂预防组较ccl4模型组血清中ast、alt、cr、ldh指标均显著降低(p<0.05)，说明该微生态制剂能够预防ccl4诱导的急性肝损伤以及肾功能受损。
[0070]
分别取0.2g空白对照组、ccl4模型组和微生态制剂预防组小鼠的肝脏组织，进行谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)和超氧化物歧化酶(sod)的测定，测定结果如下图6。
[0071]
由图6检测结果可知，ccl4模型组相较空白对照组肝组织中gsh
‑
px和sod 的酶活显著降低(p<0.01)，微生态制剂预防组相较ccl4模型组小鼠肝脏中sod 和gsh
‑
px的酶活显著升高(p<0.01)，说明该制剂能够提高肝脏抗氧化酶的活性，增强肝脏抗氧化能力，预防ccl4导致的肝脏氧化应激。
[0072]
取空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂预防组小鼠的肝脏用4％多聚甲醛固定后，进行he染色，观察肝脏组织切片如图8，其中(a)空白对照组；(b) ccl4模型组；(c)微生态制剂预防组；(d)各组坏死肝组织占视野肝组织面积占比(％)。
[0073]
由图7结果可知，空白对照组小鼠肝脏肝小叶完整，肝细胞形态正常，汇管区无异常；ccl4模型组小鼠肝脏小叶结构紊乱，围绕中央静脉有大面积坏死灶；微生态制剂预防组小鼠肝脏肝小叶结构较完整，围绕中央静脉坏死面积减小，肝损伤面积占整个肝组织比例显著降低(p<0.01)。
[0074]
以上结果说明本制剂对于ccl4导致小鼠的急性肝损伤具有预防作用。
[0075]
数据四：
[0076]
微生态制剂对小鼠肝损伤的治疗作用。
[0077]
本实验利用ccl4作为肝损伤的诱导剂，试验选取18只雌雄各半的昆明白鼠，体重为20
‑
25g的昆明鼠，随机分为空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂治疗组，每组小鼠雌雄各半，ccl4模型组、微生态制剂治疗组腹腔注射10μ l/g体积的浓度为0.2％的ccl4豆油溶液，空白对照组腹腔注射10μl/g体积的生理盐水，腹腔注射完毕，微生态制剂治疗组以20μl/g的体积连续7d 灌服微生态制剂，空白对照组和ccl4模型组以20μl/g的体积连续7d灌服生理盐水，禁食、不禁水16h，摘眼球取血，静置1h，以转速3 000r/min 离心10min，采集血清，进行血清生化指标包括glu、ast、alt、cr、ldh的测定，断颈处理后进行剖检及肝脏重量的称量。
[0078]
图8为试验小鼠肝脏的表观形态，其中(a)空白对照组；(b)ccl4模型组； (c)微生态制剂治疗组，可见ccl4模型组表面粗糙无光泽，肝脏表面有大量坏死灶；与ccl4模型组相比，微生态制剂治疗组小鼠肝脏表面坏死灶数量减少，部分表面坏死灶与肝脏脱落分离，经计数，ccl4模型组每只小鼠肝脏表面坏死灶数量为10.09
±
1.22(n＝6)，微生态制剂治疗组每只小鼠肝脏表面坏死灶数量为6.92
±
1.86(n＝6)，微生态制剂治疗组表面坏死灶数量相较ccl4模型组显著减少(p<0.05)。
[0079]
表4微生态制剂治疗急性肝损伤试验中小鼠体征状况和血液生化指标
[0080][0081]
结果表示为平均数
±
标准误(样本数＝6)，每行中数据相同肩标表示两组数据差异不显著，p<0.05。
[0082]
由表4可知，与对照组相比，ccl4模型组小鼠肝重体重比显著增加(p<0. 05)，alt、ast和ldh活性显著升高(p<0.05)，表明小鼠肝脏发生急性肝损伤；cr水平显著升高(p<0.05)，表明肾脏功能受损，微生态制剂治疗组较 ccl4模型组血清中ast、alt、cr、ldh指标均显著降低(p<0.05)，说明该微生态制剂能够治疗ccl4诱导的急性肝损伤以及肾功能受损。
[0083]
取0.2g空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂治疗组小鼠的肝脏组织，进行sod和gsh
‑
px的测定。测定结果如图10，其中(a)空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂治疗组小鼠肝脏组织蛋白中sod的酶活；(b)空白对照组、 ccl4模型组、微生态制剂治疗组小鼠肝脏组织蛋白中gsh
‑
px的酶活(单位 u/mgprot表示在1mg组织蛋白中酶的活性)：
[0084]
由图9检测结果可知，与空白对照组ccl4模型组肝组织中sod和gsh
‑
px 的酶活显著降低(p<0.01)，微生态制剂治疗组肝脏抗氧化酶sod和gsh
‑
px 的活性显著升高(p<0.01)，说明该制剂增强肝脏抗氧化酶活性，提高肝脏清除自由基的能力，缓解肝脏的氧化应激。
[0085]
取空白对照组、ccl4模型组、微生态制剂治疗组小鼠的肝脏用4％多聚甲醛固定后，进行he染色，观察肝脏组织切片，如图10，其中(a)空白对照组； (b)ccl4模型组；(c)微生态制剂治疗组；(d)各组坏死肝组织占视野肝组织面积占比(％)。
[0086]
由图10结果可知，空白对照组小鼠肝脏肝小叶完整，肝细胞形态正常，汇管区无异常；ccl4模型组小鼠肝脏小叶结构紊乱，围绕中央静脉有大面积坏死灶；微生态制剂治疗组小鼠肝脏中，围绕中央静脉坏死面积减小，肝损伤面积占整个肝组织比例显著降低(p<0.01)。
[0087]
综上所述，本制剂具有良好的安全性，通过与益生菌的联合发酵提高了原花青素粗提物清除自由基的能力，且能够预防和治疗小鼠的急性肝损伤。
[0088]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。