含朝鲜蒲公英胎盘培养提取物的皮肤改善用化妆品组合物的制作方法

1.本发明涉及一种含有朝鲜蒲公英胎盘培养提取物的用于皮肤改善的化妆品组合物，该化妆品组合物对特应性皮炎等极干性皮肤具有保湿、舒缓和皮肤屏障增强功效。


背景技术：

2.随着年龄的增长，人体皮肤会因多种内在和外在因素而发生变化。作为内在因素，调节新陈代谢的各种激素的分泌减少，且免疫细胞的功能和细胞的活性降低，导致生物体所需的结构蛋白的生物合成减少。作为外在因素，由于臭氧层被破坏，太阳光线中到达地球表面的紫外线含量增加，且环境污染的进一步加深使得自由基和活性有害氧增加，导致皮肤的厚度减少、皱纹增加、弹性下降、皮肤问题频发等多种变化。
3.随着皮肤老化的进行，会发生角质形成细胞和成纤维细胞分裂减少、胶原蛋白合成减少、mmp的生成增加、生成黑色素的信号转导增加等，由此导致皱纹增加，皮肤弹性下降，且斑点、雀斑和老年斑增加。尤其是在40岁左右，荷尔蒙失去平衡，导致细胞再生能力、胶原蛋白合成能力和对皮肤保湿很重要的角质层水分含量显着降低。目前有观点认为其原因在于角质层脂质成分的减少和天然保湿因子的减少等。结果，在老化皮肤中，从下方表皮层供给角质层的水分不足，导致皮肤干燥加剧，由此容易引起炎症和瘙痒。另一方面，皮肤皱纹是由胶原蛋白合成和降解之间的失衡引起的，而通常在皮肤中i型胶原蛋白的合成与其分解酶mmp-1处于平衡状态。然而，在光老化皮肤中，i型和iii型胶原蛋白的合成减少，mmp-1的活性增加。这些mmp(基质金属蛋白酶)已知作为蛋白水解酶具有分解细胞外基质(extracellular matrix)的功能，且在正常条件下参与伤口愈合或组织再生过程。
4.由于这些变化，人们对能够抑制皮肤老化的材料的兴趣和社会对含有它们的化妆品的需求不断增加，开发具有生物相容性和优异皮肤渗透率的材料正成为一项重要课题。最近，正在应用多种方法，其中，正在研究多种植物资源和肽用于恢复如上所述的皮肤损伤。
[0005]“愈伤组织(callus)”作为在植物受到创伤时通过使细胞恢复分裂能力来闭合伤口且增大的组织，是指通过在含有生长素的培养基中培养从植物体切下的组织的方法等产生的一种特殊的组织块，最近人们对使用这种愈伤组织的兴趣越来越高，并且正在多个方面进行研究。植物具有优异的全能性(totipotency)，即使仅移植构成植物的诸如叶、茎和根等一部分，也会重新形成整个个体。愈伤组织具有可以通过植物细胞培养、特别是组织培养从植物的任何部位诱导产生且可以通过继代培养连续产生的特点。培养植物细胞的基本原理在于利用所有植物细胞都有能力构建其来源的整个植物的生物学事实。这种全能性可与动物胚胎干细胞的多能性相媲美。因此，可以接受植物细胞对皮肤干细胞的保护和激活有积极作用。另一方面，与来自动物的胎盘类似地，植物的“胎座(placenta)”作为主管种子发育的重要部位，是在雌蕊子房(ovary)中胚珠附着的部分。胚珠的分化离不开胎座，其与其他组织相比含有大量作为生理活性营养素的植物化学物质。它参与维持针对外部刺激的内稳态，且分布有结构维持蛋白，例如分子伴侣。
[0006]
如果使用通过利用这种植物特性的组织培养来培养未分化细胞团的愈伤组织，则可以视为具有优异生理活性功效的化妆品原料。


技术实现要素：

[0007]
技术问题
[0008]
本发明旨在解决上述问题和与其相关的其他问题。
[0009]
本发明的一个示例性目的是提供一种制备含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的提取物的化妆品组合物的方法。
[0010]
本发明的另一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的提取物的用于皮肤保湿的化妆品组合物。
[0011]
本发明的又一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的提取物的用于增强皮肤屏障的化妆品组合物。
[0012]
本发明的又一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的用于保护皮肤免受紫外线伤害的化妆品组合物。
[0013]
本发明的又一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的用于保护皮肤免受蓝光伤害的化妆品组合物。
[0014]
本发明的又一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的用于预防或减轻皮肤应激的化妆品组合物。
[0015]
本发明的又一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的用于保护皮肤免受微尘伤害的化妆品组合物。
[0016]
本发明的又一个示例性目的是提供一种基于上述方法的含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或该胎座细胞培养物的用于舒缓皮肤的化妆品组合物。
[0017]
根据本说明书所公开的发明的技术思想所要解决的技术问题不限于解决上述问题点的问题，本领域普通技术人员能够通过以下记载清楚地理解未提及的又一个问题。
[0018]
技术方案
[0019]
具体说明如下。另外，本技术中公开的各个说明和实施例可以应用于各自的其他说明和实施例。即，本技术中公开的多种要素的所有组合都落入本技术的范围内。此外，本技术的范围不能视为受到以下具体描述的限制。
[0020]
为实现上述目的的本发明的一个方面提供制备含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或所述胎座细胞培养物的提取物的化妆品组合物的方法，包括：从朝鲜蒲公英(taraxacum coreanum)植物的子房内的胎座组织中分离胎座细胞并进行培养的步骤a；以及制备含有在所述步骤a中获得的培养物或所述培养物的提取物的组合物的步骤b。
[0021]
本发明在一方面涉及基于上述制备方法的含有朝鲜蒲公英的胎座细胞培养物或其提取物作为活性成分的用于改善皮肤的外用组合物。具体地，基于组合物的总重量，所述胎座细胞培养物或其提取物的含量可为0.1重量％至10重量％。该比例仅仅是优选的范围，例如在下面的实施例中，通过在1％、5％和10％的浓度下进行实验，证实了它具有优异的功效，且证实了甚至在10％下也对细胞存活率没有影响。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，除此之外，在 20％或30％以上的情况下也会具有出色的皮肤改善功效、皮肤屏障增强、改善、皮肤保湿、皮肤抗衰老、皮肤皱纹改善、保护皮肤免受紫外线或蓝光的伤害、
防止皮肤应激、舒缓皮肤、微尘阻隔功能等。
[0022]
本发明的制备含有朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或其提取物的化妆品组合物的方法，包括：从朝鲜蒲公英植物的子房内的胎座组织中分离胎座细胞并进行培养的步骤a；以及制备含有所述步骤a中获得的培养物或其提取物的组合物的步骤b。
[0023]
在本发明中，所述步骤b可以包括：将所述步骤a中获得的朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物干燥和粉碎，并与纯净水混合以制备组合物。
[0024]
在本发明中，所述步骤b可以包括：将所述步骤a中获得的朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物干燥、粉碎、与纯净水混合，然后通过减压提取、超声波提取或热水提取制备组合物。
[0025]
在本发明中，可以使用朝鲜蒲公英的胎座细胞培养物(胚体)本身，或将培养物过滤后使用，或将培养物粉碎后使用，或将培养物干燥粉碎，然后通过溶解在纯净水中使用。
[0026]
在本发明中，“提取物”是指将朝鲜蒲公英胎座细胞培养物粉碎，或通过减压提取法、冷水提取法、热水提取法、乙醇提取法等多种已知的提取方法得到的提取物。
[0027]
本发明的提取方法不受特别限制，例如减压提取、冷浸提取、超声波提取、回流提取、热水提取等。
[0028]
其中，在减压提取的情况下，可以进行低温减压提取，例如，可以在低温 (60℃至80℃)下减压提取朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物6至8小时。另外，对在减压提取时特别使用的减压提取装置没有限制，且在减压提取时，通过在0.03mpa至0.3mpa的压力下、具体在0.05mpa至0.1mpa的压力下进行减压提取来获得作为本发明化妆品组合物的原料功效优异的提取物。
[0029]
其中，在热水提取的情况下，通过在热水蒸馏器中在80℃至100℃下加热8 至48小时来获得热水提取物。
[0030]
例如，在冷水提取的情况下，将胎座组织培养物本身或其干燥粉末与冷水 (15℃至25℃)混合并提取3天以获得冷水提取物。
[0031]
或者，可以通过使用水、有机溶剂或它们的混合溶剂提取的方法来制备。提取液可直接使用或浓缩和/或干燥使用。使用有机溶剂提取时，可使用甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亚砜(dmso)、1，3-丁二醇、丙二醇或其混合溶剂作为有机溶剂，在不破坏草药的活性成分或使破坏程度最小化的条件下以室温或通过加热进行提取。药剂活性成分的提取程度和损失程度可能根据用于提取的有机溶剂而不同，因此应选择和使用合适的有机溶剂。
[0032]
在本发明中，所述提取物可以在浓缩或稀释后使用，也可以使用提取物的蒸馏液。
[0033]
在本发明中，抗衰老是指包括皮肤保护和皮肤状态改善、皮肤美白、对皮肤老化和皱纹的预防或改善、毛孔收缩、缩小、皮肤保护和皮肤炎症反应减轻、免疫疾病改善能力、或皮肤屏障功能改善、皮肤刺激缓解、皮肤细胞增殖和再生能力、抗氧化能力和胶原蛋白合成促进能力等的概念。
[0034]
在本发明中，“含有...作为活性成分”的含义是指皮肤化妆品组合物含有有效量以表达本发明中所需的功效，例如皮肤保湿、皮肤屏障强化、改善、皱纹改善等。
[0035]
在根据本发明的皮肤屏障保护功能中，皮肤屏障(skin barrier)是作为表皮最外层的角质层(stratum corneum)，其主要由无核扁平角质细胞(corneocyte) 构成。通过正
常表皮细胞的分裂和分化过程维持的皮肤屏障的角质细胞所合成的神经酰胺、胆固醇和脂肪酸等细胞间脂质形成的多层脂质膜(multi lamella lipidlayer)起到防止皮肤中的水分蒸发的保护膜作用。同时，在这些细胞间脂质中，欧米茄羟基神经酰胺通过与作为角质细胞(corneocyte)外层的蛋白的外皮蛋白 (involucrin)形成化学共价键来形成角质细胞脂质包膜(corneocyte lipidenvelope，cle)，从而起到物理上稳定多层脂质膜形态的细胞间脂质的作用，进而起到加强屏障功能的作用。
[0036]
本发明的组合物通过皮肤涂抹递送至角质层，促进角质细胞的分化，从而不仅具有改善表皮层厚度变厚的功效，而且其修复皮肤屏障损伤的功效优异，因此能够有效地用于治疗和预防由皮肤屏障损伤引起的皮肤病。由皮肤屏障损伤引起的皮肤病包括但不限于特应性皮炎(atopic dermatitis)、干皮病 (xeroderma)、牛皮癣(psoriasis)、鱼鳞病(ichthyosis)和痤疮等。
[0037]
此外，通过作为紧密连接结构蛋白的封闭蛋白(occludin)和紧密连接蛋白
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1(claudin-1)的蛋白质量的增加证实了皮肤屏障保护机制。丝聚蛋白(filaggrin) 作为角质形成细胞在分化阶段表达的多种结构蛋白之一，参与表皮基底层至角质层的分化，而且还构成皮肤组织的保湿所需的天然保湿因子(atural moisturefactor，nmf)的主体，因此用作皮肤水分维持和皮肤膜功能的主要指标，由于丝聚蛋白基因表达显着增加，根据本发明的胎座细胞培养物具有优异的皮肤屏障保护、加强和改善功能。
[0038]
另外，由于证实了根据本发明的胎座细胞培养物在紫外线照射或蓝光照射下的皮肤细胞保护功效优越，因此它可以用于针对紫外线照射的皮肤保护。
[0039]
另一方面，与动物的胎盘类似地，植物的胎座(placenta)作为主管种子发育的重要部位，是在雌蕊子房(ovary)中胚珠附着的部分。通常位于形成子房的心皮(carpel)的边缘，有时位于心皮的中脉处。此外，有时也呈现形成为子房底部或从底部直立在子房中的柱状形态。
[0040]
鉴于此，本发明涉及一种制备含有朝鲜蒲公英胎座细胞培养物或其提取物的化妆品组合物的方法，包括：分离朝鲜蒲公英植物的胎座组织并进行培养的步骤a；以及制备含有所述朝鲜蒲公英植物的胎座细胞培养物或其提取物的组合物的步骤b。
[0041]
在所述步骤a中，具体可以选择合适的培养基来培养朝鲜蒲公英胎座细胞。如果有在本领域通常用于植物组织培养的培养基，可以不受限制地使用。对于植物，通常主要使用ms培养基、b5培养基等，例如可使用具有0.025mg的 cocl2.6h2o、0.025mg的cuso4.5h2o、36.70mg的fenaedta、6.20mg的h3bo3、 0.83mg的ki、16.90mg的mnso4.h2o、0.25mg的na2moo4.2h2o、8.60mg的 znso4.7h2o、332.02mg的cacl2、170.00mg的kh2po4、1900.00mg的kno3、 180.54mg的mgso4、1650.00mg的nh4no3的组成(1l基准)的ms培养基。
[0042]
此外，所述培养基中可包含肌醇、硫胺素、玉米素和蔗糖，通过这些材料的组合能够实现优异的蒲公英胎座细胞诱导产率。在本发明中，硫胺素和玉米素的重量比可以为2至6∶1。例如，ms培养基(1l基准)可包含100mg肌醇(myoinositol)、0.4mg硫胺素(thiamine)、0.1mg玉米素(zeatin)和30g蔗糖。
[0043]
在本发明中，在所述步骤b中，可将含有通过步骤a的培养获得的朝鲜蒲公英胎座细胞培养物本身的组合物制备成适当形态的皮肤外用组合物，或者可通过已知的提取方法以提取物的形态获得并制备成适当形态的化妆品组合物。
[0044]
例如，在所述步骤b中，可通过将步骤a中得到的朝鲜蒲公英胎座细胞培养物干燥、粉碎且与纯净水混合来制备组合物，或者可将步骤a中得到的朝鲜蒲公英胎座细胞培养物干燥、粉碎、且与纯净水混合后，通过冷水提取、热水提取或乙醇提取来制备组合物。
[0045]
作为另一个例子，可将所述步骤a中获得的培养物用热空气干燥后，通过进行粉碎并蒸发水分来制备。
[0046]
所述化妆品组合物可以包含化妆品制剂中可接受的载体。其中，“化妆品制剂中可接受的载体”是指已知和已使用的可包含在化妆品制剂中的化合物或组合物，或未来待开发的不会具有与皮肤接触时人体可适应的程度以上的毒性、不稳定性或刺激性化合物或组合物。
[0047]
所述载体在本发明的皮肤外用组合物中的含量基于组合物总重量为约1重量％至约99.99重量％，优选约90重量％至约99.99重量％。然而，该比例可根据制备本发明的皮肤外用组合物的后述剂型、其具体施用部位(面部、颈部等)或其优选施用量而不同，因此该比例在任何方面均不应被解释为限制本发明的范围。
[0048]
所述载体的实例包括醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、显色剂、香料等。本领域中已知可用作为所述醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、润湿剂、保湿剂、粘度调节剂、乳剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、显色剂、香料的化合物/组合物，因此本领域普通技术人员可以选择合适的相应材料/组合物并使用。
[0049]
作为本发明的一个实施方式，根据本发明的化妆品组合物除了所述胎座细胞培养物提取物之外，还可以包含甘油、丁二醇、丙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、乙醇、三乙醇胺等，且根据需要，可包含微量的防腐剂、香料、着色剂、纯净水等。
[0050]
根据本发明的化妆品组合物可以制备成各种形态，例如，化妆水、精华素(essence)、乳胶(gel)、乳液(emulsion)、露(lotion)、霜(cream)(水包油型、油包水型、多相)、溶液、悬浮液(无水和水基)、无水产品(油基和乙二醇基)、凝胶、面膜(mask)、剥撕式面膜(pack)、粉或明胶等具有涂层的胶囊 (软胶囊、硬胶囊)剂型等形态。
[0051]
本发明中的皮肤是除了面部之外还包括头皮和全身的概念。作为可以施用在头皮上的皮肤外用组合物，有洗发水、护发素、护理剂、生发剂等，且可以作为可施用于全身的身体清洁剂等用途，制备成多种形态。
[0052]
根据本发明的制备含有朝鲜蒲公英胎座细胞培养提取物的化妆品组合物的方法不限于上述制备方法，且本发明所属领域的普通技术人员也可以通过经部分变型的制备方法来制备根据本发明的含有朝鲜蒲公英胎座细胞培养提取物的化妆品组合物。
[0053]
特别地，除了本发明中具体公开的制备方法之外，还可以通过使用常规已知的制备方法将所述化妆品组合物制备成一般的乳化剂型和可溶剂型的形态。
[0054]
当制备成化妆品组合物时，乳化剂型化妆品包括营养化妆水、霜和精华素等，而可溶剂型化妆品包括软化化妆水。此外，通过含有皮肤病学可接受的介质或基质，可制备成可以局部或全身施用的皮肤病学领域中常用的佐剂形态。
[0055]
此外，合适的化妆品剂型包括例如溶液、凝胶、固体或糊状无水产品、通过将油相分散在水相中获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微粒球或离子型(脂质体)、非离子型的囊泡分散剂的形态；以及霜、皮肤、露、粉末、软膏、喷雾剂或遮瑕棒形态。此外，它可以制备
成泡沫或进一步包含压缩推进剂的气溶胶组合物的形态。
[0056]
此外，本发明的化妆品组合物还包含化妆品学或皮肤病学领域常用的辅料，诸如脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子封锁剂和螯合剂、防腐剂、维生素、封闭剂、润湿剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲脂性活性剂、脂质囊泡或常规用于化妆品中的任何其他成分。另外，可以按皮肤病学领域中通常使用的量引入上述成分。
[0057]
在下文中，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
[0058]
具体而言，在以下实施例中，证实了朝鲜蒲公英胎座细胞培养物提取物的功效，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，并非提取物的培养物本身也有这种功效。
[0059]
发明效果
[0060]
根据本发明的朝鲜蒲公英胎座细胞培养物或其提取物不仅对皮肤细胞无毒，还具有皮肤保湿、抗衰老、皮肤屏障增强、皱纹改善、皮肤舒缓、保护皮肤免受紫外线伤害以及保护皮肤免受蓝光的伤害等功效。
具体实施方式
[0061]
在下文中，将通过以下实施例更详细地说明本发明。然而，这些实施例仅用于例示性说明目的，并且本发明的范围不仅限于这些实施例。
[0062]
实施例1：根据本发明的组合物制备
[0063]
实施例1-1：植物表面消毒
[0064]
为了根据本发明的植物细胞生产，对朝鲜蒲公英的花苞用镊子小心地剥下子房壁以分离胎座细胞，浸入70％乙醇中30秒后，在2％次氯酸钠中振荡灭菌 5分钟，然后用无菌水洗涤。
[0065]
实施例1-2：植物胎座细胞诱导
[0066]
使用锋利的刀子一次性切下灭菌的胎座细胞，并在基本ms培养基 (murashige和skoog 1962，duchefa公司，目录m0221)中在25℃和70％湿度的生长室条件下进行暗室培养且诱导了早期植物细胞，其中ms培养基(1l 基准)包含作为植物生长调节剂(plant growth regulators)的肌醇(myoinositol) 100mg、硫胺素(thiamine)0.4mg、玉米素(zeatin)0.1mg、蔗糖(sucrose) 30g。用1n的naoh将每个培养基的ph值调至5.8。以两周的间隔进行传代培养。
[0067]
实施例1-3：根据本发明的植物胎座细胞培养和大量生产
[0068]
将通过无菌传代培养的朝鲜蒲公英胎座细胞随后利用生物反应器在除琼脂外成分相同的液体培养基中恒定地调节在温度25℃、湿度70％、空气供应量 0.1vvm的同时每隔14天进行培养和增殖，从而进行大量生产。
[0069]
实施例1-4：根据本发明的植物胎座细胞组合物制备
[0070]
将经培养的朝鲜蒲公英胎座细胞收获并用干净的纸巾充分除去水分，然后在60℃下干燥2天。为了获得根据本发明的组合物，对20g朝鲜蒲公英胎座细胞用10l纯化水在60℃至80℃下进行减压提取6至8小时并进行过滤。
[0071]
实验例1：皮肤细胞无刺激功效确认测试
[0072]
首先，为了确认实施例1的根据本发明的组合物对于皮肤细胞按不同处理浓度是否具有毒性刺激，进行了用于测量细胞存活率的mtt法。
[0073]
为此，将hacat细胞(角质形成细胞)和detroit细胞(成纤维细胞)分别与含有10％fbs(胎牛血清)和1％抗生素-抗真菌素(antibiotic-antimycotic) 的dmem(dubelcco改良eagle培养基)一同分株在96-孔板中，并在5％的co2和37℃条件下的培养箱中培养24小时。此后，用添加有纯净水的对照组和作为实验物质的组合物处理细胞以使最终浓度成为1％、5％和10％，并进一步培养24小时。然后，每孔添加5mg/ml的mtt(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2h-溴化四唑)溶液4μl，并培养4小时以进行反应。除去培养液后，加入 100μl的dmso(二甲基亚砜)溶液以溶解细胞，然后在540nm处测定吸光度。
[0074]
[表1]
[0075][0076]
结果，当用本发明的组合物以1％至10％的浓度进行处理时，与对照组相比，细胞存活率均为95％以上，未引起皮肤细胞内毒性。因此，证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养提取物”的如下功效：对皮肤细胞造成刺激的可能性低，且对皮肤细胞无害。
[0077]
实验例2：来自dpph自由基清除能力的抗氧化功效确认测试
[0078]
为了确认根据本发明的组合物由于抑制1，1-二苯基-2-苦基肼(dpph)自由基的生成而产生的抗氧化功效，进行了dpph测定。
[0079]
为此，将500μl的0.1mm dpph溶液和100μl的对照组以及500μl的0.1mmdpph溶液和100μl的测试物质组合物分别添加到400μl乙醇中。各样品混合后，室温避光反应30分钟，然后在517nm处测定吸光度。
[0080]
[表二]
[0081][0082]
结果，当用本发明的组合物以不同浓度进行处理时，与对照相比dpph自由基清除能力增加，由此证实了“蒲公英植物胎座培养物提取物”具有抗氧化功效。
[0083]
实验例3：针对h2o2氧化毒性的抗氧化功效确认测试
[0084]
为了确认根据本发明的组合物针对h2o2氧化毒性的抗氧化功效，查看了 h2o2引起的细胞存活率的变化。
[0085]
为此，将hacat细胞分株在48孔板中，然后在细胞培养条件下培养24小时。此后，照射1mm h2o2，用对照组和作为测试物质的组合物处理细胞，并进一步培养12至16小时。在这种情况下，使用2mm的n-乙酰半-l-胱氨酸(nac) 作为阳性对照组。此后，使用mtt法测量细胞存活率，以确认皮肤细胞是否受到保护免受h2o2氧化毒性诱导造成的损害。
[0086]
[表3]
[0087][0088]
结果，与对照组(+h2o2)相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，h2o2处理导致的细胞死亡被抑制，因此证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养物提取物”针对h2o2氧化毒性具有抗氧化功效。
[0089]
实验例4：根据pip生成增加的皱纹改善功效确认测试
[0090]
为了确认根据本发明的组合物的皱纹改善功效，测量了作为胶原合成前体的原胶原(procollagen type i c-peptide，pip)的生物合成量。
[0091]
为此，将detroit551细胞分株在48孔板中，然后在细胞培养条件下培养24 小时。之后，用对照组和作为测试物质的组合物处理细胞，并进一步培养48小时。然后，取稀释经培养的培养基上清液而得的一部分20μl，与pip eia kit (takara，目录mk101)中的pip标准物质20μl一起放入抗体包被的微量滴定板中，并将100μl过氧化物酶标记的抗体溶液分别加入每孔中，在37℃下使得进行反应3小时。除去培养基，用200μl的pbs洗涤4次后，每孔添加100μl 的底物溶液，在遮光状态下进行室温反应15分钟。之后，添加100μl终止液(1n 的h2so4)，并在450nm处测量吸光度。
[0092]
[表4]
[0093][0094]
结果，与对照组相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，pip 的量提高，因此证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养物提取物”具有抗皱功效。
[0095]
实验例5：基于aqp3和flg表达增加的保湿和皮肤屏障改善功效确认测试
[0096]
为了确认根据本发明的组合物的保湿和皮肤屏障改善功效，查看了作为水分/甘油转运蛋白的aqp3(水通道蛋白)和已知为天然保湿因子的flg(丝聚蛋白)的表达水平的变化。
[0097]
将hacat细胞分株在96孔板中后，在细胞培养条件下培养24小时。之后，用对照组和作为测试物质的组合物处理细胞，并进一步培养24小时。进行了实时pcr以确认aqp3和flg的基因水平，该测试顺序如下。
[0098]
为了rna分离和cdna合成，使用了superprep
tm cell lysis&rt kit forqpcr(toyobo，目录scq-101)。将除去培养基的细胞用pbs洗涤1次，添加细胞裂解液50μl，反应5
分钟后，加入终止液。将先前提取的裂解液8μl加入32μl的rt反应混合物中，并分别在37℃和15分钟、50℃和5分钟以及 95℃和5分钟条件下使用pcr合成了cdna。为了基因表达的比较分析，将以上合成的cdna用作模板，使用thunderbird
tm sybr qpcr mix(toyobo，目录qps-201)进行实时pcr分析。实验所用引物为qiagen公司的quantitectprimer assays(gapdh；目录qt01192646，aqp3；目录qt00212996，flg；目录qt02448138)，样品的aqp3和flg mrna表达水平采用gadph定量。作为实时qpcr条件，首先在95℃下反应1分钟，然后以94℃下15秒、60℃下30秒和72℃下30秒为每个循环总共进行40个循环。
[0099]
[表5]
[0100][0101]
结果，与对照组相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，aqp3 和flg的mrna表达水平提高，因此证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养物提取物”具有保湿和皮肤屏障改善功效。
[0102]
实验例6：基于cox-2表达降低的抗炎功效确认测试
[0103]
为了确认根据本发明的组合物的抗炎功效，查看了参与炎症反应的cox-2 (环加氧酶-2)的表达水平的变化。
[0104]
为此，将hacat细胞分株在96孔板中，然后在细胞培养条件下培养24小时。此后，通过uvb照射诱导炎症反应，将细胞用对照组和作为测试物质的组合物处理，并进一步培养4小时。进行了实时pcr以确认cox-2的基因水平，该测试顺序如下。
[0105]
为了rna分离和cdna合成，使用了superprep
tm cell lysis&rt kit forqpcr(toyobo，目录scq-101)。将除去培养基的细胞用pbs洗涤1次，并添加细胞裂解液50μl，反应5分钟后，加入终止液。将先前提取的8μl裂解液加入32μl的rt反应混合物中，并分别在37℃下15分钟、50℃下5分钟以及 95℃下5分钟的条件下使用pcr合成了cdna。为了基因表达的比较分析，将以上合成的cdna用作模板，并使用thunderbird
tm sybr qpcr mix(toyobo，目录qps-201)进行实时pcr分析。实验所用引物为qiagen公司的quantitectprimer assays(gapdh；目录qt01192646，cox-2；目录qt00040586)，样品的cox-2mrna表达水平采用gadph定量。作为实时qpcr条件，首先在 95℃下进行反应1分钟，然后以94℃下15秒、60℃下30秒和72℃下30秒为每个循环总共进行40个循环。
[0106]
[表6]
[0107][0108]
结果，与对照组(uvb处理)相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，cox-2的mrna表达水平降低，因此证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养物提取物”具有抗炎功效。
[0109]
实验例7：通过紫外线刺激的皮肤细胞保护功效确认测试
[0110]
为了确认根据本发明的组合物针对紫外线刺激的皮肤细胞保护作用，查看了细胞存活率的变化。
[0111]
为此，将hacat细胞分株在96孔板中，然后在细胞培养条件下培养24小时。此后，照射uvb，用对照组和作为测试物质的组合物处理细胞，并进一步培养24小时。然后，通过使用mtt法测量细胞存活率，以确认是否保护了皮肤细胞免受紫外线诱导的损伤。
[0112]
[表7]
[0113][0114][0115]
结果，与对照组(+uvb)相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，uvb处理导致的细胞死亡被抑制，因此证实了“蒲公英植物胎座培养物提取物”具有保护细胞免受紫外线的伤害的功效。
[0116]
实验例8：通过蓝光诱导的皮肤细胞保护功效确认测试
[0117]
为了确认根据本发明的组合物针对蓝光刺激的皮肤细胞保护功效，查看了细胞存活率的变化。
[0118]
为此，将hacat细胞分株在96孔板中，然后在细胞培养条件下培养24小时。之后，用对照组和作为测试物质的组合物处理细胞，并在2小时后使用 topview 5450vri smd led(itswell，目录iws-l5056-vri-k3)将蓝光照射到细胞6小时，然后将细胞进一步培养24小时。随后，通过使用mtt法测量细胞存活率，以确认是否保护皮肤细胞免受蓝光诱导的损伤。
[0119]
[表8]
[0120][0121]
结果，与对照组(+蓝光)相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，蓝光处理导致细胞死亡被抑制，因此证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养提取物”具有保护细胞免受蓝光的伤害。
[0122]
实验例9：基于tert表达的抗衰老功效确认测试
[0123]
为了确认根据本发明的组合物的抗衰老功效，查看了已知为延长dna链末端端粒长度的酶tert(端粒酶逆转录酶)表达水平的变化。
[0124]
查看了已知为延长dna链末端端粒长度的酶tert(端粒酶逆转录酶)表达水平的变化。
[0125]
将hacat细胞分株在96孔板中，在细胞培养条件下培养24小时。之后，用对照组和作为测试物质的组合物处理细胞，并进一步培养24小时。进行了实时pcr以确认tert基因水平，该测试顺序如下。
[0126]
为了rna分离和cdna合成，使用了superprep
tm cell lysis&rt kit forqpcr(toyobo，目录scq-101)。将除去培养基的细胞用pbs洗涤1次，并添加细胞裂解液50μl，反应5分钟后，加入终止液。将先前提取的裂解液8μl 加入32μl的rt反应混合物中，并分别在37℃下15分钟、50℃下5分钟和 95℃下5分钟的条件下使用pcr合成了cdna。为了基因表达的比较分析，将以上合成的cdna用作模板，并使用thunderbirdtm sybr qpcr mix(toyobo，目录qps-201)进行了实时pcr分析。实验所用引物为qiagen公司的quantitectprimer assays(gapdh；目录qt01192646，tert；目录qt00073409)，样本的tert mrna表达水平采用gadph定量。作为实时qpcr条件，首先在95℃下进行反应1分钟，然后以94℃下15秒、60℃下30秒和72℃下30秒为每个循环总共进行40个循环。
[0127]
[表9]
[0128][0129]
结果，与对照组相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，tert 的mrna表达水平提高，因此证实了“蒲公英植物胎座培养物提取物”具有抗衰老功效。
[0130]
实验例10：基于lea表达增加的抗应激功效确认测试
[0131]
为了确认根据本发明的组合物的抗应激功效，查看了已知可保护细胞免受应激损伤的lea(晚期胚胎发育丰富蛋白)的表达变化。
[0132]
为此，将hacat细胞分株到6孔板中并在细胞培养条件下培养24小时。之后，将细胞
用对照组和作为测试物质的组合物处理，然后将细胞进一步培养24 小时，并使用in-cell elisa比色检测试剂盒(invitrogen公司，目录号62200) 测量了lea蛋白表达水平。去除完成培养的细胞的培养基并通过在室温下用 100μl的固定液培养15分钟来固定了细胞。随后，用pbs洗涤，并添加100μl 透化液，在室温下反应15分钟。随扈，用pbs洗涤，并添加100μl淬灭液，在室温下反应20分钟。随后，用pbs洗涤，并添加100μl封闭液，在室温下反应30分钟。除去溶液后，添加50μl的lea一抗，在4℃下反应24小时。去除抗体后，用pbs洗涤，并添加50μl的hrp偶联二抗以反应1小时。去除抗体并用pbs洗涤后，添加100μl的tmb底物溶液并在遮光的状态下在室温下反应15分钟。然后，添加100μl终止液(1n的h2so4)，并测量450nm处的吸光度。
[0133]
[表10]
[0134][0135]
结果，与对照组(+uvb)相比，在用本发明的组合物以不同浓度处理的细胞中，uvb处理导致的lea表达水平提高，因此证实了“朝鲜蒲公英植物胎座培养物提取物”具有通过保护细胞免受伤害来缓解应激的功效。
[0136]
实验例11：(体内)微尘阻隔功效确认测试
[0137]
查看了采用了1％的根据本发明的组合物的精华素剂型的微尘阻隔功效。
[0138]
首先，至于精华素剂型，实验组制备成包含朝鲜蒲公英植物胎座培养提取物1重量份、甜菜碱1重量份、二棕榈酰羟脯氨酸0.5重量份、1，2己二醇0.3 重量份、卡波姆0.2重量份、丙二醇0.1重量份、山梨糖醇0.05重量份、氢氧化钠0.02重量份、剩余纯水100重量份，而对照组的精华素剂型中不包含作为本发明的组分的朝鲜蒲公英植物胎座培养提取物1重量份。
[0139]
测试时，在20名受试者的前臂上分别划分出一个正方形(2cm
×
2cm)，并分别涂抹50μl的产品，并将测试部位暴露在配备螺旋桨的微尘漂浮室中1分钟。将炭黑(korea carbon black co.，ltd.，corax n220，粒径：20nm至25nm)作为微尘替代物在腔室中悬浮1g。在吸附微尘替代物之前和吸附微尘替代物之后进行测量。对于摄影，使用数码相机(佳能，eos70d)拍摄前臂的照片。对捕获的图像使用图像分析程序(plus)指定测试部位的aoi(兴趣区域)，然后分析了微尘吸附前后像素值的差异。单位是任意单位(a.u.)。
[0140]
[表11]
[0141]
样品处理浓度(％)微尘像素变化量对照组1
‑‑
0.00对照组2-+20.01实验组1+14.65
[0142]
实验组相对于对照组的微尘替代物吸附防止功效的提高率(％)＝[1-(实验组的微尘替代物像素的变化量)/(对照组2的微尘替代物像素的变化量)]*100
[0143]
结果，与对照组2相比，采用本发明组合物的实验组在防止微尘吸附方面表现出26.79％的改善率。因此，推断出“朝鲜蒲公英植物胎座培养物提取物”是有助于防止微尘吸附的产品。
[0144]
实验例12：(体内)皮肤舒缓功效确认测试
[0145]
查看了采用了1％的根据本发明的组合物的精华素剂型的基于皮肤温度降低率的皮肤舒缓功效。
[0146]
为此，在25名受试者的前臂上划分出一个正方形(2cm
×
2cm)，并分别涂抹50μl的产品，然后在测试前暴露在直射光下20分钟。使用计算机红外热成像传感器(diti)进行了测量，以0分钟(加样前)、5分钟(加样后)和10分钟(加样后)为间隔测量体温，并计算了温度降低率。
[0147]
[表12]
[0148][0149][0150]
结果观察到，与对照组相比，在采用了本发明的组合物的实验组中，即使在20分钟后也保持了持续的热降低率。因此，证实了“朝鲜蒲公英植物胎座素提取物”具有舒缓皮肤的功效。
[0151]
以上对本发明内容的特定部分进行了详细说明，对于本领域普通技术人员来说，这些具体说明仅仅是优选实施例，本发明的保护范围并不因此而受到限制。因此，本发明的实质范围旨在由所附权利要求及其等同物来限定。