鼻粘膜给药剂型和其应用的制作方法

鼻粘膜给药剂型和其应用
1.本技术要求2020年7月7日提交的、申请号为202010646239.1、发明名称为“鼻粘膜给药剂型和其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
发明领域
2.本发明属于医药领域，涉及含有ccr4抑制剂的鼻黏膜给药剂型，及所述药物用于治疗ccr4介导的疾病用途。


背景技术：

3.ccr4(趋化因子受体4，chemokine receptor 4)是1995年由christine a.power等首先发现的(christine ap等j.biol.chem.1995,270(8):19495-19500)，属于趋化因子受体(ccr)家族成员之一，是7次跨膜的g-蛋白偶联受体。ccr4表达于外周血白细胞、胸腺细胞、嗜碱性白细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、il-激活的nk细胞、脾及脑，可在多种疾病中起到重要作用。如在人类过敏性皮炎(ad)发生时，cd4+t细胞所表达的ccr4在外周血的单核细胞(pbmcs)中表达增加，血清中的tarc水平也相应增加。这表明ccr4在细胞表达的趋化现象是由tarc诱导的，并在人类过敏性皮炎时选择性的使th2细胞向损伤皮肤迁移。用于治疗过敏性皮炎的药物主要有抗组胺药、支气管扩张剂，但是它们只能改善症状，而对于疾病的发展起不到作用。另外，皮质甾类化合物对过敏性皮炎也有一定的作用，但是存在着安全隐患。有研究表明，对mdc或tarc的拮抗能减少t细胞在炎症部位的聚集，ccr4拮抗剂对于包括但不限于过敏性鼻炎、过敏性皮炎在内的过敏性炎症的治疗可能是很有效的。
4.已经发现ccr4与肺部疾病如慢性梗阻性肺炎、慢性支气管炎和哮喘也有很大的关系。ccr4可以限制性的表达于参与哮喘反应的细胞，被认为是治疗哮喘的良好靶点。因此，开发ccr4拮抗剂药物具有良好的应用前景。
5.cn101370793a公开了具有下式的化合物及其作为ccr4拮抗剂的用途，包括用于ccr4介导的疾病
6.其中各取代基如该申请中公开所定义。
7.cn102388039a公开了下式(i)的吲唑化合物及其作为ccr4拮抗剂的用途，包括其在与ccr4拮抗剂有关的治疗中的应用：
8.其中各取代基如该申请中公开所定义。
9.anthony cahn等人公开了上述结构中的化合物gsk2239633的i期临床结果(cahn et al.bmc pharmacology and toxicology 2013,14:14)，实验表明该化合物具有较好的人体耐受性，但在最大安全剂量下的体内显露量过低，无法产生预期的药效。
10.本领域仍然需要更好的ccr4抑制剂药物或剂型。


技术实现要素：

11.本发明提供了通过粘膜给药途径来改善gsk2239633生物利用度的技术以及可用的药用制剂，解决了现有技术中ccr4抑制剂溶解度低，难于制备，以及制备得到的制剂药物存在生物利用度过低，无法在体内达到预期的起效血药浓度的问题。本发明提供的ccr4抑制剂药物制剂ccr4抑制剂还具有无局部刺激性、使用安全的优点。
12.具体的，本发明提供了一种粘膜给药剂型，其含有式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：
[0013][0014]
式i化合物的cas号为1240516-71-5，其制备在cn102388039a的实施例57中公开，其化学名为n-[(3-{[3-{[(5-氯-2-噻吩基)磺酰基]氨基}-4-(甲氧基)-1h-吲唑-1-基]甲基}苯基)甲基]-2-羟基-2-甲基丙酰胺。在本领域，式i化合物的常用名为gsk2239633。
[0015]
式i化合物可采用前药形式给药，所述前药是在人或动物体内裂解而释放本发明化合物的化合物。前药的实例包括体内可裂解的酯衍生物和体内可裂解的酰胺衍生物，所述酯衍生物可在式i化合物的羧基或羟基上形成，所述酰胺衍生物可在式i化合物的羧基或氨基上形成。
[0016]
式i化合物的药学上可接受的前药为，例如其体内可裂解的酯或醚。含有羟基的式
i化合物的体内可裂解的酯或醚为，例如在人和动物体内裂解产生母体羟基化合物的药学上可接受的酯或醚。对于羟基，合适的药学上可接受的成酯基团包括无机酯例如磷酸酯(包括氨基磷酸环酯)。对于羟基，合适的药学上可接受的成酯基团还包括(1-10c)烷酰基(如乙酰基、苯甲酰基、苯乙酰基和取代的苯甲酰基和苯乙酰基)、(1-10c)烷氧基羰基(如乙氧基羰基、n,n-[二-(1-4c)烷基]氨基甲酰基、2-二烷基氨基乙酰基和2-羧基乙酰基)。苯乙酰基和苯甲酰基上环取代基的实例包括氨基甲基、n-烷基氨基甲基、n,n-二烷基氨基甲基、吗啉代甲基、哌嗪-1-基甲基和4-(1-4c)烷基哌嗪-1-基甲基。对于羟基，合适的药学上可接受的成醚基团包括α-酰氧基烷基例如乙酰氧基甲基和新戊酰氧基甲基。
[0017]
本发明的式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药具有ccr4抑制剂的活性。由此，式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药可用于治疗ccr4介导的疾病或用于制备治疗ccr4介导的疾病的药物。
[0018]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型为经鼻给药的剂型。在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型为经鼻给药的剂型为含有所述式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的溶液组合物。经鼻给药的剂型可以用适当的给药装置如喷雾器(如喷雾泵、气溶胶、雾化器或定量喷雾器)或滴加容器(如点滴器或鼻滴管)将所述组合物吸入、滴于或涂于鼻腔内以附着于鼻粘膜上，由此有效组分通过鼻粘膜吸收。在本发明中，上述式i化合物基本上完全溶于所述溶液中。在某些情况下，所述粘膜给药剂型存在部分悬浮的式i化合物。
[0019]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型(特别是经鼻粘膜给药剂型，例如用于喷雾的溶液)包含助溶剂。在本发明中，所述助溶剂有利于式i化合物在溶液中的溶解。在本发明的其中一个方面，所述助溶剂选自氢氧化钠、甲醇钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、α-，β-或γ-环糊精中的任意一种或多种。在本发明的其中又一个方面，所述助溶剂为氢氧化钠和/或β-环糊精。在本发明的其中又一个方面，所述助溶剂为氢氧化钠。
[0020]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型中包含的助溶剂的含量为约0.25-1.5mol/l，优选为0.5-1.0mol/l。
[0021]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型(特别是经鼻粘膜给药剂型，例如用于喷雾的溶液)包含ph调节剂。在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型包含的ph调节剂选自磷酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸、马来酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的任意一种或多种。优选的，所述粘膜给药剂型包含的ph调节剂磷酸盐和/或柠檬酸盐缓冲液。
[0022]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型(特别是经鼻粘膜给药剂型，例如用于喷雾的溶液)包含助溶剂和ph调节剂。
[0023]
在本发明的其中一个方面，所述粘膜给药剂型的ph为约6.5-9.5；优选为约7.0-8.5，例如为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5以及这些具体ph值中的任意两个所构成的ph值范围。
[0024]
不拘于理论的限制，ph高于9.5时，对鼻腔的刺激性较大，尽管此时式i化合物的溶解度比较理想。本发明人还在研究中发现，当ph较低时，例如等于或低于6.5时，式i化合物容易析出。
[0025]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型包含防腐剂，例如选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、对羟基苯甲酸乙酯钠、对羟基苯甲酸丙酯钠、对羟基苯甲酸丁酯钠、山梨酸、山梨酸钠、苯甲酸、苯甲酸钠、苯甲醇、苯扎溴铵、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、间苯二酚和乙二胺四乙酸钠中的任意一种或者多种，优选的，所述防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯钠。
[0026]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型为等渗制剂。由于鼻腔环境能够进行自我调剂，在本发明的其中又一个方面，所述制剂不含有渗透压调节剂。
[0027]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型包含渗透压调节剂，例如选自氯化钠、硝酸钾、硼酸和葡萄糖中的任意一种或者多种，优选为氯化钠。
[0028]
在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型不包含渗透促进剂。式i化合物分子量为约550，所述制剂可不包含渗透促进剂。
[0029]
在本发明的其中一个方面，所述粘膜给药剂型喷雾溶液剂型，其喷雾粒度为约5-200μm，优选为约10-150μm。
[0030]
在本发明的其中一个方面，所述粘膜给药剂型(特别是经鼻粘膜给药剂型，例如用于喷雾的溶液)的含量为每100ml剂型中所述式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的量为约1.25mg-10.0g，优选为约2.5mg-5g，跟优选为约5mg-1g。
[0031]
在本发明的其中一个方面，所述粘膜给药剂型(特别是经鼻粘膜给药剂型，例如用于喷雾的溶液)为单剂量或多剂量给药的剂型，其中每个剂量给予的所述式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的量为约2.5μg-10.0mg，优选为约5.0μg-1.0mg。
[0032]
在本发明的其中一个方面，所述粘膜给药剂型用于治疗ccr4介导的疾病。式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药具有ccr4抑制剂的活性。由此，本发明的式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药可用于治疗ccr4介导的疾病或用于制备治疗ccr4介导的疾病的药物。具体的，本发明的式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药可用于治疗ccr4的调节(例如抑制ccr4的活性)对患者有利的疾病。
[0033]
所述ccr4介导的疾病例如为：(1)呼吸道疾病，如气道阻塞性疾病，包括哮喘，包括支气管哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘、运动诱发性哮喘、药物诱发性(包括阿司匹林和nsaid诱发的)哮喘和粉尘诱发性哮喘，间歇性哮喘和持续性哮喘；慢性阻塞性肺病(copd)；支气管炎，包括传染性支气管炎和嗜酸性支气管炎；肺气肿；支气管扩张；囊性纤维化；超敏感性肺炎；肺纤维化，包括隐原性纤维化肺泡炎、特发性间质性肺炎、抗肿瘤治疗和慢性感染并发的纤维化；肺血管的血管炎和血栓形成疾病及肺动脉高压；鼻炎：急性鼻炎和慢性鼻炎，包括药物性鼻炎和血管运动性鼻炎；常年性变应性鼻炎和季节性变应性鼻炎，包括神经性鼻炎；急性病毒感染，包括普通感冒和由呼吸道合胞病毒、流行性感冒、冠状病毒和腺病毒引起的感染。优选的，其中所述ccr4介导的疾病为哮喘、copd和鼻炎。
[0034]
在本发明的其中一个方面，提供了式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在用于通过粘膜给药途径来治疗或预防ccr4介导的疾病的方法，特别是通过鼻粘膜给药途径来治疗或预防ccr4介导的疾病的方法。所述方法中，式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药以喷雾溶液的形式给药。
[0035]
根据本发明的又一方面，提供了式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在制备用于通过粘膜给药途径来治疗或预防ccr4介导的疾病的药物中的用途，特别是通
过鼻粘膜给药途径，例如以喷雾溶液的形式给药。
[0036]
本发明还提供了一种制备如前所定义的本发明的粘膜给药剂型的方法，其中所述粘膜剂型包含式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。
[0037]
在本发明的其中一个方面，所述粘膜给药剂型为经鼻给药剂型，例如为溶液组合物。在本发明中，所述方法包括将式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药与助溶剂和/或ph调节剂混合的步骤。
[0038]
在本发明的其中一个方面，所述方法包括将ph调节至约6.5-9.5；优选为约7.0-8.5的步骤。任选的，所述方法还包括加入防腐剂、渗透压调节剂、渗透促进剂中的一种或多种的步骤。其中，所述助溶剂、ph调节剂、防腐剂、渗透压调节剂、渗透促进剂如前所定义。
[0039]
在本发明的其中一个实施方式中，所述制备本发明的经鼻给药剂型，特别是喷雾剂的方法包括以下步骤：
[0040]
1.使用助溶剂将式i化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药溶解，加入ph调节剂将溶液的ph调至约7.0－9.0，例如至约8.0，
[0041]
其中加入的助溶剂的体积为约0.5-3体积份，优选为约1-2体积份，例如为约1.5体积份；
[0042]
2.加入水和/或其它组分至目的制剂体积，调节ph为约6.5-9.5；优选为约7.0-8.5。
[0043]
在本发明的其中一个方面，所述制备方法的步骤1中加入的助溶剂选自氢氧化钠、甲醇钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、α-，β-或γ-环糊精中的任意一种或多种，优选的，其包含的助溶剂为氢氧化钠/或β-环糊精，更优选的，其包含的助溶剂为氢氧化钠和。
[0044]
在本发明的其中一个方面，所述式i化合物的粘膜给药剂型在制备中，先将式i化合物溶于较小体积的助溶剂(例如先溶于氢氧化钠)，然后加入其它组分或水调配到工作体积。在本发明的其中又一个方面，所述粘膜给药剂型中加入的助溶剂的浓度为约0.1-3.0mol/l，优选为约0.2-2.0mol/l，更优选为约0.3-1.0mol/l，例如为约0.5mol/l，以及在每100体积份粘膜给药剂型中含有约0.5-3.0体积份，优选为约1.0-2.0体积份，例如为约1.5体积分助溶剂。
[0045]
本发明人在研究中发现，助溶剂例如氢氧化钠能够促进式i化合物的溶解，但是氢氧化钠的用量较低或者氢氧化钠在制剂中的浓度较低时，不足以使ccr4抑制剂溶解。当氢氧化钠的用量较高或者氢氧化钠在制剂中的浓度较高时，则需要使用较多的ph调节剂例如磷酸二氢钠、碳酸氢钠。本发明人发现，在这种情况下，制得的制剂的渗透压较高，对鼻腔给药不利；并且本发明人还发现，在这种情况下，会产生大量的热量，不利于制备过程的进行，特别是不利于工业化生产。因此，在其中一种实施方式中，制备每100ml含有式1的ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂中，加入的氢氧化钠的量按照约0.5mol/l的浓度计算，体积为约0.5ml-3ml，优选为约1ml-2.0ml，更优选为1.5ml。也可以使用其它浓度的氢氧化钠，只要氢氧化钠的量落入上述范围或者与上述范围等同。在其中一种实施方式中，优选使用浓度较大的氢氧化钠，例如大于或等于0.1mol/l的氢氧化钠，优选大于0.3mol/l的氢氧化钠；更优选使用浓度为大于或等于0.5mol/l的氢氧化钠。
[0046]
本发明提供的方法和制剂具有而不限于以下优点：
[0047]
1.式i化合物在本发明的制剂中具有良好的溶解性和高溶解度，鼻纤毛毒性较小并可逆，并且制剂的ph值适宜于鼻腔。
[0048]
2.本发明提供的鼻腔喷雾剂较常规给药途径具有速效，避免首过效应，生物利用度高的优点，并且使用方便、安全、顺应性好。
具体实施方式
[0049]
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果。实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
[0050]
gsk2239633，cas号1240516-71-5，购自mce中国，目录号:hy-100183。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0051]
实施例1：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂1的制备
[0052]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加注射用水近100ml刻度，摇匀，用磷酸二氢钠调节ph值至7.0，加入氯化钠0.3g，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约7.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0053]
实施例2：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂2的制备
[0054]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加丙二醇15.0g，加注射用水近100ml刻度，摇匀，用碳酸二氢钠调节ph值至8.0，加入氯化钠0.3g，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约8.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0055]
实施例3：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂3的制备
[0056]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加丙二醇15.0g，加注射用水近刻度，摇匀,加入柠檬酸和柠檬酸钠(1：10)，调节ph值至8.0，再加注射用水至100ml刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约8.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0057]
实施例4：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂4的制备
[0058]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 1.0g，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加注射用水近刻度，摇匀，用磷酸氢钠调节ph值至7.0，加入氯化钠0.3g，加入β-环糊精2.5克，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约7.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0059]
实施例5：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂5的制备
[0060]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 1.0g，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加聚氧乙烯月桂醇醚10.0g，加注射用水近刻度，摇匀，用碳酸氢钠调节ph值至8.0，加入氯化钠0.3g，加入
β-环糊精2.5克，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约8.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0061]
实施例6：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂6的制备
[0062]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 1.0g，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加丙二醇15.0g，加注射用水近刻度，摇匀,加入柠檬酸0.08g和柠檬酸钠0.8g，调节ph值至8.0，加入β-环糊精1.5克，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，既得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约8.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0063]
实施例7：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂7的制备
[0064]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加注射用水近刻度，摇匀，用磷酸二氢钠调节ph值至8.0，加入氯化钠0.3g，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约8.5。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0065]
实施例8：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂8的制备
[0066]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加丙二醇15.0g，加注射用水近刻度，摇匀，用碳酸氢钠调节ph值至8.5，加入氯化钠0.3g，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约9.0。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0067]
实施例9：ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂9的制备
[0068]
称取对羟基苯甲酸甲酯钠0.03g,置于100ml量瓶中，加注射用水适量，使溶解，再加入gsk2239633 1.0g，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，加丙二醇15.0g，加注射用水近刻度，摇匀,加入柠檬酸和柠檬酸钠(1：10)缓冲液，调节ph值至8.5，加入氯化钠0.3g，加入β-环糊精1.5克，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，得ccr4抑制剂的鼻腔喷雾剂药液，ph为约9.0。随后分别灌装于单剂量及多剂量鼻喷雾装置中，包装备用。
[0069]
实验例10：体外纤毛毒性实验
[0070]
本实验评价了前述制备得到的具有不同浓度ccr4抑制剂的制剂的鼻纤毛毒性。实验采用文献公认的有严重纤毛毒性的去氧胆酸钠作为阳性对照，生理盐水为空白对照，
[0071]
1.实验样品
[0072]
实施例1-9制备的ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂1-9；
[0073]
阳性对照(1％去氧胆酸钠溶液)；
[0074]
空白对照(生理盐水)。
[0075]
2.实验方法
[0076]
采用蟾蜍上腭纤毛离体法测定纤毛持续运动时间(lasting time of eilliary movement,ltcm)。
[0077]
将蟾蜍固定，用手术剪剪下上腭粘膜，置于生理盐水中，洗净血块和杂物，迅速用眼科剪剪取约3x3 mm2的上腭粘膜，粘膜纤毛面向上平铺于载玻片上，于粘膜表面加0.1ml
药液，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察纤毛运动情况，直至纤毛运动停止，记录从给药至纤毛运动停止所持续的时间。
[0078]
用生理盐水小心洗净粘膜上的药液,继续观察纤毛运动是否恢复,记录恢复试品的持续运动时间。
[0079]
3.实验结果
[0080]
如下面的表1。
[0081]
表1纤毛毒性评价结果
[0082]
样品信息ltcm(分钟)相对百分比(％)恢复时间(分钟)生理盐水648
±
36
‑‑
阳性对照7
±
21.1-实施例1427
±
1365.9126
±
9实施例2456
±
2070.4128
±
9实施例3487
±
2175.2131
±
8实施例4356
±
1754.9186
±
9实施例5347
±
1653.5178
±
11实施例6367
±
1756.6185
±
12实施例7433
±
1266.8121
±
8实施例8455
±
1770.2118
±
4实施例9360
±
1255.6167
±8[0083]
4.实验结论
[0084]
1)空白对照组显微镜下黏膜表面完好，纤毛活跃。
[0085]
2)阳性对照组显微镜下黏膜表面纤毛脱落，纤毛不摆动，且无法恢复。
[0086]
3)实施例1-9制备的ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂具有一定的纤毛毒性，但均可在一定时间后恢复，毒性是可逆的。
[0087]
4)gsk2239633的纤毛毒性随着浓度增加而增加，但也是可逆的。
[0088]
5)制剂中的其它成分的纤毛毒性均较小，基本无明显影响。
[0089]
实施例11在体纤毛毒性评价
[0090]
1.实验样品
[0091]
实施例1-9制备的ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂1-9。
[0092]
空白对照为生理盐水。
[0093]
2.实验方法
[0094]
将蟾蜍仰卧固定，使口腔张开，于上腭黏膜处滴加药液0.5ml使完全浸没上腭，接触30min后用生理盐水洗净药物，分离上腭黏膜以供显微镜观察纤毛运动情况。黏膜分离后立即洗净,平铺于载玻片上，于黏膜表面滴加生理盐水，盖上盖玻片，如上操作观察并记录纤毛运动的持续时间。
[0095]
3.实验结果
[0096]
如下面的表2。
[0097]
表2在体纤毛毒性评价结果
[0098]
样品信息ltcm(分钟)相对百分比(％)
生理盐水816
±
37-实施例1760
±
2393.1实施例2756
±
2092.6实施例3787
±
2596.4实施例4666
±
1781.6实施例5677
±
1883.0实施例6691
±
1784.7实施例7753
±
2292.3实施例8775
±
1995.0实施例9660
±
1380.9
[0099]
通过在体法对实施例1-9制备的ccr4抑制剂鼻腔喷雾剂的纤毛毒性进行了评价，实验发现各制剂的纤毛毒性均低于体外实验，纤毛持续运动时间均长于离体法，因此所述实施例的制剂均具有良好的纤毛安全性，适于鼻腔给药。
[0100]
实验例12：生物利用度评价
[0101]
1.实验样品
[0102]
ccr4抑制剂鼻喷剂,实施例1-9制备。
[0103]
ccr4抑制剂注射剂的制备：100ml量瓶中，加注射用水适量，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，摇匀，用碳酸氢钠调节ph值至8.5，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，制得ccr4抑制剂的注射剂药液。
[0104]
ccr4抑制剂口服剂的制备：100ml量瓶中，加注射用水适量，再加入gsk2239633 250mg，加入适量氢氧化钠(1.5ml,0.5mol/l)，振摇使溶解，摇匀，用碳酸氢钠调节ph值至10，再加注射用水至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤药液，制得ccr4抑制剂的口服剂药液。
[0105]
2.实验方法
[0106]
给药途径：鼻喷剂、口服、注射。
[0107]
给药剂量：口服5mg/kg，鼻喷剂、注射剂1mg/kg。
[0108]
给药方案：
[0109]
实验采用三周期、自身对照交叉设计，27条雄性比格犬，随机分为9组，每期经一周洗净期后，分别口服、注射、鼻喷给药ccr4抑制剂，计算鼻喷制剂的相对生物利用度。分别于给药前0min和给药后0.033、0.083、0.167、0.5、1、2、3、4、6、8h由四肢静脉分别交替采血约1ml，转移到1.5ml的ep管中，3000转/分钟，离心15min,分离血浆约100μl，其余备份，置-30℃冰箱存放待处理。
[0110]
样品处理：
[0111]
取比格犬血浆100μl，加入100μl右美托嘧啶(内标，50ng/ml)，加入0.5ml甲醇，充分振荡后，12000转/分钟，离心6分钟，转移上清200μl于进样瓶中，取10μl进样lc/ms/ms分析测定。
[0112]
表3：ccr4抑制剂相对生物利用度研究实验
[0113]
样品信息生物利用度(％)
注射制剂-口服制剂25.0
±
0.2实施例190.1
±
0.4实施例289.3
±
0.5实施例388.7
±
0.3实施例491.2
±
0.5实施例590.3
±
0.4实施例688.6
±
0.4实施例785.4
±
0.3实施例890.2
±
0.5实施例992.2
±
0.4
[0114]
3.实验结果
[0115]
结果显示：鼻喷、口服、静注三种途径给药ccr4抑制剂后，以注射为对照，口服制剂的相对生物利用度为25.0％，鼻喷制剂的相对生物利用度为85.4-92.2％，生物利用度提高了3.47-3.69倍，有效克服了ccr4抑制剂的不足。
[0116]
本发明克服了ccr4抑制剂gsk2239633的溶解性差，生物利用度的缺陷，在本领域首次制备和提供了具有更符合临床应用的ccr4抑制剂制剂。具体的，本发明提供了通过鼻粘膜给药等粘膜给药途径来改善gsk2239633生物利用度的技术以及可用的药用制剂，解决了现有技术的ccr4抑制剂存在溶解度低，影响药物活性成分的释放、造成生物利用度过低，存在在最大安全剂量下无法在体内达到预期的起效血药浓度的问题。本发明提供的ccr4抑制剂药物制剂ccr4抑制剂还具有无局部刺激性、使用安全的优点。
[0117]
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。